一种耐受和富集重金属的格氏沙雷氏菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及环境微生物修复技术领域，具体而言，涉及耐受和富集土壤和水体重 金属的沙雷氏菌属细菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着工业的发展和化石燃料的广泛使用，重金属在土壤和水源中大量富集，通过 污水灌溉等途径加剧其扩散，并通过食物链在人体富集，危害健康，如日本由汞污染引起的 水俣病，镉污染导致的骨痛病。随着我国工业的快速发展，由此产生的重金属污染也越来越 严重，据国家环境保护部的统计2009年我国重金属污染事件导致4035人血铅超标，182人 镉超标，引发群体性事件32起。我国每年缺水超过300亿吨，而水体的重金属污染会引发 水质性缺水；重金属污染还会导致土壤微生物活性降低，土壤肥力和质量严重下降。因此， 重金属污染的治理迫在眉睫。
[0003] 微生物在重金属处理方面具有的优势：（1)处理能力强，可通过吸附、转化和活化 等多种方式降低环境中重金属的浓度；(2)适应能力强，可迅速适应环境，容易应用于其他 领域；（3)成本低，效益高，容易管理，不易造成二次污染。微生物的吸附作用是指利用某些 微生物本身的化学成分和结构特性来吸附废水中的重金属离子，通过固液两相分离达到去 除废水中的重金属离子的目的。生物吸附剂为自然界中丰富的生物资源，如藻类、地衣、真 菌和细菌等。微生物结构的复杂性以及同一微生物和不同金属间亲和力的差别决定了微生 物吸附金属的机理非常复杂，至今尚未得到统一认识。根据被吸附重金属离子在微生物细 胞中的分布，一般将微生物对金属离子的吸附分为胞外吸附、细胞表面吸附和胞内吸附。
[0004] 目前，对耐重金属细菌的研究主要集中在以下3个方面：（1)重金属耐性菌株的 筛选与鉴定；（2)细菌耐重金属的机理研究；（3)耐重金属细菌在生态治理方面的综合运 用。具有耐重金属属性的细菌有许多菌属，如黄单胞菌属（Xanthomonas sp.)、硫杆菌属 (Thiobacillus sp·)、假单胞菌属（Pseudomonas sp·)、红假单细胞菌属（Rhodopseudomona s sp.)、纤发菌属（Leptothrix)、嘉利翁氏菌属（Gallionella)、嗜酸硫杆菌属 (Acidithiobacill us sp·)、硫杆菌属（Thiobacillus sp·)、球衣菌属（Sphaerotilus sp.)、节杆菌属（Arthrobacter)、芽抱杆菌属（Bacillus sp.)、壤霉菌属（Agromyces sp.)、 肠杆菌属（Enterobacter)、埃希氏菌属（Escherichia)、根瘤菌属（Rhizobiumfrank)、青枯 菌属（Ralstonia)、气单胞菌属、短杆菌属（Brevibacterium)、无色细菌属（Achromatium sp.)、红杆菌属（Rhodobacte r)、食烧菌属、产碱菌属（Alcaligenes sp.)、短波单胞杆苗 属（Brevundimonas sp·)、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp·)、伯克霍尔德氏菌属 (Burkholderia sp·)、不动杆菌属（Acinetobacter)、微杆菌属（Microbacterium sp·)、肠 球菌属（Enterococcus)、气单胞杆菌（Aeromonas)、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas.sp·)。 此外还有特殊的如趋磁性细菌（Magnetotactic bacteria)、MTB和工程菌等。
[0005] 近年来，重金属细菌研究取得了较大的进展，然而在该领域的研究仍不够成熟，应 用和耐性机理方面有待深入。细菌耐重金属机理研究作为可以广泛应用理论的前提，一方 面有利于揭示细菌生理生化特征，另一方面也有利于以后的研究；此外，各学科人员的协同 合作，有利于开拓更大的发展空间。如利用生物工程的技术手段，对耐重金属细菌进行改 良，提高细菌的适应力与耐受力。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于通过耐重金属菌株筛选、诱变、富集驯化，从而提供一种能够富 集重金属的沙雷氏菌属细菌及其应用。
[0007] 为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈探索，最终获得了一种 耐受和富集土壤和水体中重金属的细菌。进一步地，发明人对该细菌进行了 16S rRNA基因 序列分析，并得出其16S rRNA的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO: 1所示。通过 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/网页中的比对程序进行同源性分析，得出该菌种属 于沙雷氏菌属，发明人将其命名为DJ16。该细菌已于2014年11月19日送往中国典型培 养物保藏中心进行保藏，分类命名：格氏沙雷氏菌（Serratia grimesii)DJ16 ;保藏编号： CCTCC NO :M 2014578 ;地址：中国武汉武汉大学。
[0008] 本发明所筛选的沙雷氏菌属细菌DJ16具有如下培养特征：
[0009] 沙雷氏菌属细菌DJ16摇瓶发酵培养条件为：发酵温度30_37°C，发酵时间12_36h， 转速 150-225r/min。
[0010] IOL发酵罐中试发酵条件为：装液量4-7L培养基，接种量3-5%，接种液细菌浓度 为 108CFU/mL，发酵温度 25-40°C，pH 6. 8-7. 8,发酵时间 18-36h，转速，200-400r/min，通气 量 1 : 1。
[0011] 摇瓶发酵和中试发酵的培养基均为Luria-Bertani (LB)培养基，成分为：胰蛋白 胨l〇g、酵母浸出物5g、氯化钠10g、去离子水lOOOmL，pH 6. 8-7. 2。
[0012] 在pH 4-10之间均能生长；盐浓度10%以下均能生长；在15°C -36°C下DJ16菌株 能够在平板中生长良好，而在4°C和42°C的环境下，菌株也能够在平板中生长。
[0013] 另外，本发明人通过耐受重金属实验发现，沙雷氏菌属细菌DJ16对Cu2+的最大 耐受能力为6mmol/L，对Zn 2+的最大耐受能力在lOmmol/L以上，对Cd2+的最大耐受能力为 10mmol/L，对Pb 2+的最大耐受能力为5mmol/L ;本发明人通过吸附重金属实验发现，沙雷氏 菌属细菌DJ16干菌体所能吸附Cu2+金属离子的量可达6. 8mg/g，Zn 2+金属离子的量可达 9. 0mg/g, Cd2+金属离子的量可达8. 8mg/g, Pb2+金属离子的量可达5. 0mg/g。目前,关于沙 雷氏菌属细菌高效耐重和富集多种重金属方面的研究在国内外没有报道。因此，基于此研 究结果，本发明还提供一种工业新用途，即：本发明提供的沙雷氏菌属细菌DJ16在富集土 壤和水体重金属中的应用。
[0014] 与现有技术相比，本发明提供的沙雷氏菌属细菌DJ16具有以下优点和显著的进 I K 少：
[0015] (1)菌株DJ16为环境微生物，无致病性，生长速度快适应能力强，生物修复应用前 景广泛。
[0016] (2)菌株0116耐受0(12+、？132+、(：11 2+、2112+浓度高，对(：112+的最大耐受能力为6臟〇1/ L，对Zn2+的最大耐受能力在10mmol/L以上，对Cd2+的最大耐受能力为10mmol/L，对Pb 2+的 最大耐受能力为5mmol/L。
[0017] (3)每克干菌体吸附0(12+、？132+、(：11 2+、2112+能力强，干菌体所能吸附(：112+金属离子的 量可达6. 8mg/g，Zn2+金属离子的量可达9. Omg/g，Cd 2+金属离子的量可达8. 8mg/g，Pb 2+金 属离子的量可达5. Omg/g。
【附图说明】
[0018] 图1 :基于16S rRNA基因序列的系统发育树。
[0019] 图2 :脂肪酸组分气相色谱图。
[0020] 图3 :2mmol/L Cu2+的胁迫下菌株DJ16的生长曲线。
[0021] 图4 :2mmol/L Zn2+的胁迫下菌株DJ16的生长曲线。
[0022] 图5 :2mmol/L Cd2+的胁迫下菌株DJ16的生长曲线。
[0023] 图6 :2mmol/L Pb2+的胁迫下菌株DJ16的生长曲线。
[0024] 图7 :菌株DJ16耐受重金属试验结果。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围，如未特别说明，本发明 所用方法为常规技术，所用试剂均购自生化商店。
[0026] 实施例1 :沙雷氏菌属细菌DJ16的筛选
[0027] 沙雷氏菌属细菌DJ16原始菌株的分离：污水处理厂土壤中取样，称取I. Og样加 入盛有9mL无菌水的试管中，在涡旋器上充分振荡IOmin使土壤颗粒充分散开，然后静置 5min，采用10倍梯度稀释法将上清液制成10'10'10'KT 5稀释液分别涂布到LB平板上 (加入一定量的Cd2+，选择分离），倒置于28°C培养箱中培养7d。根据菌落形态特征的不同， 从平板上挑取单菌落接种到相应斜面培养基上。如果发现有非纯培养的菌株，再用接种环 挑取少许菌苔在平板上划线分离。
[0028] 沙雷氏菌属细菌DJ16原始菌株的的诱变：LB液体培养基接种上述得到的原始菌 株37°C恒温振荡培养过夜，取ImL菌液稀释到KT 5倍。分别在6个灭菌平皿上铺上IOmL 稀释菌液，进行紫外照射（25W，253nm，40cm)并设置不同的时间梯度：0、2、4、6、8、10min，之 后分别吸取200μ L照射后的菌液在含有S-(2-aminoethyl)-L-cysteine(AEC)6. Omg/L的 minimal medium(MM)固体培养基上涂布，37°C恒温静置培养IOh后进行菌落计数，同时以 1〇_5倍稀释，200 μ L涂布LB固体培养基作为原始对照。挑取多个生长状态好的菌落进行富 集重金属（Cd2+、Pb2+、Cu 2+、Zn2+)分析，一株富集重金属最高的菌株被命名为沙雷氏菌属细菌 DJ16,该细菌已于2014年11月19日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：格 氏沙雷氏菌（Serratia grimesii)DJ16;保藏编号：CCTCC NO :M 2014578;地址：中国武汉 武汉大学。
[0029] 实施例 2 :沙雷氏菌属细菌 DJ16(保藏编号：CCTCC M 2014578)，Biolog (GN2/GP2) 自动鉴定分析
[0030] 挑取待测菌株菌苔接种于Biolog平板上，28°C培养至对数生长期。用灭菌棉 签蘸取Biolog IF液体后将平板上菌苔刮下，再溶入Biolog IF液体中，振荡混匀；使用 Biolog浊度仪调浊度至指定范围（GP板：28% ±3%，GN板：52% ±3% );再用移液枪将菌 悬液加入Biolog鉴定板中，每孔150yL ;然后28°C培养16-24h时取出鉴定板，用Biolog MicroStation分析仪对鉴定板进行数据读取和分析。
[0031] 表 I :Biolog (GN2/GP2)自动鉴定结果
[0032]
[0033]
【主权项】
1. 一种耐受和富集重金属的格氏沙雷氏菌DJ16,保藏编号为CCTCC NO :M2014578。
2. 根据权利要求1所述的格氏沙雷氏菌DJ16,其特征在于，该细菌的16S rRNA的基因 核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO: 1所示。
3. 权利要求1所述的格氏沙雷氏菌DJ16在富集土壤和水体重金属中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种耐受和富集重金属的格氏沙雷氏菌及其应用，对该细菌进行了16S？rRNA基因序列分析，并得出其16S？rRNA的基因核苷酸序列如序列表中的SEQ？ID？NO:1所示。通过同源性分析得出该菌种属于格氏沙雷氏菌，将其命名为DJ16，已于2014年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？NO：M？2014578。本发明提供的格氏沙雷氏菌DJ16可用于富集土壤和水体重金属。CCTCC NO：M201457820141119
【IPC分类】B09C1-10, C02F101-20, C12N1-20, C12R1-425, C02F3-34
【公开号】CN104560796
【申请号】CN201410795638
【发明人】代俊, 张毅, 周梦舟, 陈雄
【申请人】湖北工业大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月18日