一种产淀粉酶的菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明总地涉及一种新的菌株，更具体地，涉及一种来源于红海沉积物的产淀粉 酶的菌株以及其应用。
【背景技术】
[0002] 淀粉酶（amylase)是指能水解淀粉，糖原等相关多糖的酶类总称，应用于淀粉 糖浆、传统酿造、食品加工、纺织退浆等行业，是用途最广产量最大的酶制剂之一。微生 物是工业淀粉酶的主要来源之一，已知众多细菌及真菌可以产生淀粉酶，且以芽孢杆菌 属（Bacillus)中细菌代谢产生淀粉酶的研宄报道居多。其中，凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans)、枯草芽抱杆菌（Β· subtilis)、嗜热芽抱杆菌（Β· stearothermophilus)、地衣 芽孢杆菌（B. licheninformis)等均能产生高温淀粉酶。
[0003] 淀粉酶具有广泛的应用领域，如：应用于淀粉加工业制造葡萄糖，麦芽糖等；应用 于食品工业制作果汁、香料、味精、面包等；应用于酿造发酵工业制作白酒、啤酒、酱油、醋 等；应用于医药领域制备诊断酶、消化药等。然而，如此广泛的应用要求淀粉酶不仅要活力 高，还要具备不同酸碱稳定性及热稳定性以适应不同行业的需求。因此，筛选产不同特性淀 粉酶的优良菌株仍非常必要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种新的能产淀粉酶的菌株，并提供该菌株的用途和培养 方法，以及利用该菌株生产淀粉酶的方法以及所产的淀粉酶。
[0005] 根据本发明的第一方面，提供一种新的菌株Phaeocystidibacter merougensis G18。该菌株分离自红海沉积物（站位：38° 53·8701'，Ν22° 16.9540'），并已于2014 年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路 I 号院3号，保藏编号为：CGMCC No. 9861。其16S rDNA序列如序列表中的SEQ ID NO: 1所 示，以其16S rDNA序列构建的系统发育树如说明书附图1所示。该菌株为革兰氏阴性菌， 需氧生长，菌体呈棒状（宽约0. 3?0. 5 μ m、长约0. 5?5. 5 μ m)。菌落呈黄色，表面光滑 湿润，中央略凸。最适生长pH和温度分别为6.0?8.0, 28?37°C。最适生长NaCl浓度 为2?5% (质量体积比）。最适生长Mg2+浓度为：0.005?0.05mol/L，最适生长Ca2+浓度 为0. 005?0. 02mol/L。不能发酵葡萄糖产酸，不能水解酪蛋白、几丁质、吐温80,可水解明 胶和淀粉。碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、酯酶、亮氨酸氨基肽酶、缬氨酸氨基肽酶、胱氨酸氨基 肽酶、胰蛋白酶、萘酚磷酸水解酶、β-半乳糖苷酶阳性，脂肪酶、α-胰凝乳蛋白酶、α-半 乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、α-葡糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶、 α -甘露糖苷酶、α -岩藻糖苷酶阴性。
[0006] 本发明人发现该菌株Phaeocystidibacter merougensis G18能够在含有淀粉的 培养环境下产生淀粉酶。该淀粉酶的反应条件为pH 8. 0?9. 5,70?75°C，最适条件为pH 8. 0,温度为70°C，属一种高温淀粉酶。进一步研宄发现，该菌产生的淀粉酶在较为宽泛的 pH范围内（4. 5?10.5)以及较高温度（如65°C下热处理45分钟）下性质稳定，表现出令 人满意的活性，具有广泛的应用前景。
[0007] 因此，根据本发明的第二方面，提供所述菌株Phaeocystidibacter merougensis G18用于生产淀粉酶的用途。
[0008] 根据本发明的第三方面，提供一种生产淀粉酶的方法。所述方法包括利用菌株 Phaeocystidibacter merougensis G18进行发酵的步骤和提取发酵液中的淀粉酶的步骤。 发酵在发酵培养液中pH 6. 0?8. 0、28?37°C的条件下恒温培养。所述发酵培养液包括以 每升海水计，2?IOg淀粉，5?15g胰蛋白胨和2?5g酵母粉。
[0009] 当培养液中的菌浓度达到一定值时可通过离心的方法获得上清液，并通过常规方 法提取和纯化上清液中的淀粉酶。这些方法都是本领域技术人员熟知的[1-3]，在此不再赘 述。
[0010] 根据本发明的最后一方面，提供通过上述方法获得的淀粉酶。
[0011] 本发明的菌株Phaeocystidibacter merougensis G18培养基成分简单，培养条 件宽松，增值快。在培养基中添加淀粉可诱导产生淀粉酶。所产生的淀粉酶能够在pH8. 0? 9. 5、70?75°C，优选pH8. 0、温度为70°C的条件下反应。对温度和pH值有较宽的耐受范围， 可在pH 4. 5?10. 5的范围内以及较高温度（如65°C下热处理45分钟）下保持较高活性。 因此，本发明的菌株以及由该菌株生产的淀粉酶在医药、化工和食品等众多的领域和工业， 特别是经历PH变化和/或较高加工温度的那些工艺中，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0012] 图 1 为 Phaeocystidibacter merougensis G18 的系统发育树。
[0013] 图2为菌株Phaeocystidibacter merougensis G18所产淀粉酶在不同温度下的 相对活性变化曲线图。
[0014] 图3为以不同温度处理菌株Phaeocystidibacter merougensis G18所产淀粉酶 对其活性的影响曲线图。
[0015] 图4为菌株Phaeocystidibacter merougensis G18所产淀粉酶在不同pH条件下 相对活性变化曲线图。
[0016] 图5为在不同pH条件处理菌株Phaeocystidibacter merougensis G18所产淀粉 酶对其活性的影响曲线图。
【具体实施方式】
[0017] 以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。
[0018] 以下实施例中淀粉酶活性测定及表征方法如下：
[0019] 利用DNS(3, 5-Dinitrosalicylic acid，3, 5-二硝基水杨酸）法测定淀粉酶活性。 在碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS)与还原糖发生氧化还原反应，生成的3-氨基-5-硝基 水杨酸在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系， 可用比色法测定还原糖含量。
[0020] 1个酶活单位（U)定义为：在70°C、pH8. 0条件下，Imin内酶解淀粉生成1 μ g还原 糖（以葡萄糖为标准）所需的酶量。
[0021] DNS试剂的配制：取适量去离子水煮沸IOmin后冷却至室温，用于DNS试剂配制。 称取6. 3g 3, 5-二硝基水杨酸溶于少量水中，加入21. Og氢氧化钠充分溶解于约500mL水 中，再依次溶解182. Og酒石酸钠，5. Og苯酚，5. Og亚硫酸钠，定容IL后储存棕色瓶中放置 于4°C保存、备用。
[0022] 葡萄糖标准曲线的制作：无菌去离子水分别配制0. 1、0.25、0.5、0.75、1和 1. 25 μ g/ μ L的葡萄糖溶液。以无菌去离子水为空白对照，各设3个平行，分别取250 μ L上 述溶液与450 μ L DNS溶液混合后置沸水浴中5min，冷却至室温，取50 μ L反应液于384孔 板中测定540nm处吸光度（Eon微孔板分光光度计，美国Bio Tek公司）。以葡萄糖质量为 纵坐标，以吸光度为横坐标，绘制标准曲线。
[0023] 实施例 I :Phaeocystidibacter merougensis G18 的分离鉴定
[0024] 取5g红海沉积物样品（站位：38° 53. 8701'，N 22° 16. 9540，），放入装有IOOmL 3% (质量体积分数）无菌氯化钠溶液及玻璃珠的250mL三角瓶中，置于200rpm摇床震荡 30min，使土样均匀分散后静置lOmin。10倍稀释法，涂布静置后的上清于培养基MA(5g胰 蛋白胨，2g酵母粉，IOg琼脂，IL海水）固体平板，置于37°C培养48h。挑取不同类型单菌落 反复划线于MA固体平板，置于37°C培养48h。重复三次得到纯培养的菌株并对其进行16S rDNA测序鉴定。具体方法可参考文献[4]。
[0025] 纯化得到的所述菌株G18经16S rDNA序列比对，与Phaeocystidibacter Iuteus PG2S01 有最高的相似性（为 94. 8%)，命名为 Phaeocystidibacter merougensis G18。该 菌株的16S rDNA请见序列表[序列编号No. 1]。
[0026] 菌株G18的碳源利