一种用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片及其应用的制作方法
【专利摘要】一种用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片，芯片主要由两层微通道网络构成，如图1所示，下层中的微通道网络为迂回的折线通道组合，作为浓度梯度生成单元；如图2所示，芯片上层中的微通道网络由逐层对称增加分支通道组合和6列迂回的折线通道及6个扩展通道相连，作为等量分配单元、荧光衍生反应单元和荧光检测窗。芯片的上下层微通道网络相互联通。该微流控芯片集成有自动浓度梯度生成和等量分配、酶区域固定、酶催化反应产物分离、产物荧光衍生化及荧光检测功能，并可用在标准的酶标仪上进行分析数据的采集。为工业、农业、医药及环境科学等各领域的相关分析提供了一套解决方案。
【专利说明】一种用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及酶催化反应分析技术，具体涉及包含一种用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片及其应用。
【背景技术】
[0002]酶催化技术广泛应用于工业、农业、医药及环境科学等各领域，酶催化产物分析更是酶催化反应的研究、酶抑制剂的筛选等的关键技术。荧光分析法在酶催化反应分析研究中被广泛采用，具有专一性强、灵敏度高等优点。但酶催化反应分析中应用荧光分析须具备一定的条件:能制备出有荧光的特定底物；或者在酶催化反应条件下产物能转化成有荧光的衍生物。稳定的荧光底物通常不易获得；而在酶催化反应环境中将产物能转化成有荧光的衍生物往往会影响酶催化反应，甚至改变反应。这些都是酶催化反应分析中荧光分析法应用所面对的问题。
[0003]微流控芯片，指的是把化学和生物等领域中所涉基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，可以控制流体流经整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能。微流控分析技术在微米级结构中操控纳升至皮升体积流体，可执行样品预处理、分离与检测等步骤，具有体积小、比表面积大、反应时间短、分析速度快、试剂和样品用量少、易集成化和自动化等优点。因此，将微流控技术与荧光分析法结合，可在一定程度上克服传统的微孔板中酶催化反应分析中应用荧光分析法所遇到的一些问题，近几年来已引起研究者的广泛关注。基于微流控芯片的酶分析技术具体一些优点:(1)酶催化反应在微通道中进行，由于其体积小，比表面积大，缩短了反应时间，提高了分析效率；(2)可将样品预处理、分离与检测等操作分区域集成化，能优化分析条件，避免干扰，提高分析的准确性；(3)操作简便，自动化程度高，能大大地节约试剂用量。
[0004]本发明的目的在于提供一种用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片及其应用，可作为酶、抑制剂活性分析及药物快速筛选的工具。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片及其应用。本发明集成了样品溶液的分配、浓度梯度的生成、酶的吸附固定、冲洗、孵育反应和产物荧光衍生反应等单元操作，通过连接微量注射泵自动运行，完成操作后可置于普通酶标仪上检测读取数据。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
[0007]—种用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片，芯片主要由两层微通道网络构成，其上设置输入输出小孔，在输入输出孔上装置可拆卸的连接接头，通过细管线与微量注射泵和废液回收池相接。整块集成化微流控芯片的尺寸与标准的多孔板相同以便能装进酶标仪里。[0008]集成化微流控芯片的结构如图1和图2所示；图3为用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片组装结构和透视示意图；4图是用聚甲基硅酮基材制作的实物图。
[0009]本发明将芯片设计成上下两层微通道网络结构，下层中的微通道网络为迂回的折线通道组合，这种迂回的折线通道从右至左(或从左至右)逐层分支增加一列，交错排列，作为浓度梯度生成单元；在其最右端(或最左端)设有2个输入口，试剂、酶和药物等由此输入口进入芯片下层微通道网络；迂回的折线通道增扩至6个出口，每列出口处有一个穿透芯片基材的孔，这些孔有两个功能:①作为酶固定和酶催化反应的主要区域联通上下两层微通道网络的通路。
[0010]芯片上层中的微通道网络分为两个功能单元，以下层6个联通孔相应的位置为界。左侧(或右侧)的微通道网络由逐层增加分支通道组合，作为等量分配单元，微通道网络左端(或左端)设有2个输入口，荧光衍生剂和相关试剂等由此输入口进入上层芯片微通道网络；每个通道的末端与另外6列迂回的折线通道相连。
[0011]上层芯片右侧(或左侧)的微通道网络由6列迂回的折线通道组合，起始端分别与下层6个联通孔对齐，作为荧光衍生反应区。迂回的折线通道的末端设计成扩展通道，作为酶标仪检测窗，共6个检测窗的间距与标准的微孔板的孔距相同，使芯片与标准的酶标仪兼容。通道最终汇聚于芯片上的废液口。
[0012]分别刻有上述微通道网络的两片聚甲基硅酮基材，连同最下层没有通道的第三片聚甲基硅酮基材精确对准，粘贴键合成本发明用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片。
[0013]所述用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片的应用过程如下:
[0014]1.将双通道微量注射泵的针头分别与芯片上输入口 C1、C2连接管线连通，与固定酶相关的通道修饰剂、交联剂、洗涤液等由注射泵经下层通道的输入口 C1、C2，恒速、定量地注入芯片下层微通道网络，液体流过芯片下层微通道网络后，经末端穿透芯片基材的孔进入上层芯片通道，此时上层芯片通道输入口 C3、C4关闭，液体由废液口 C5流出芯片。
[0015]2.打开上层芯片通道输入口 C3、C4，关闭废液口 C5。与固定酶相关的酶、稳定剂、缓冲液及洗涤液等由注射泵经下层通道的输入口 C1、C2，恒速、定量地注入芯片下层微通道网络，液体流过芯片下层微通道网络后，经末端穿透芯片基材的孔进入芯片上层微通道，再经上层芯片输入口 C3、C4流出芯片。
[0016]3.将两台双通道微量注射泵的针头分别与芯片上入口 Cl、C2 ;C3、C4连接管线连通，与酶催化反应相关的底物、抑制剂、缓冲液及洗涤液等由注射泵经芯片下层通道的输入口 C1、C2，恒速、定量地注入芯片下层微通道网络，底物与通道上固定的酶结合，发生酶催化反应，产物经末端穿透芯片基材的孔进入芯片上层通道。与此同时，与荧光衍生化反应相关的试剂等由注射泵经芯片上层通道的输入口 C3、C4，恒速、定量地注入芯片上层微通道网络，并与酶催化反应的产物汇合，混合后反应生成荧光衍生物。流体注入检测窗后经废液口C5流出芯片。
[0017]4.待酶催化的反应完成或达到平衡、荧光衍生化反应完成稳定后，拆除芯片上的连接接头及管线。将芯片装入标准的酶标仪，检测各检测窗的荧光信号，提供分析数据。
[0018]本发明具有如下优点:
[0019]1.本发明的微流控芯片集成了试剂自动浓度梯度生成和等量分配、酶区域固定、酶催化反应产物分离、产物荧光衍生化及荧光检测功能，为工业、农业、医药及环境科学等各领域的相关分析提供了一套解决方案。
[0020]2.本发明的微流控芯片设计成上下两层微通道网络，将酶催化反应与产物荧光衍生化分在不同区域进行，避免了荧光衍生化反应对酶催化反应的相互干扰，减少了分析误差。
[0021]3.本发明在微流控芯片的操作中利用微通道网络的流向控制，将酶固定在芯片的下层微通道中，将酶催化反应产生的产物带离酶催化反应区，随后产物与荧光衍生化试剂在上层通道特定区域反应生成荧光衍生物，荧光衍生物纯度高，荧光发光效率高，提高了荧光检测的灵敏度。
[0022]4.本发明的集成化微流控芯片所设计的荧光检测窗的排列与传统的多孔板一致，可应用在标准的酶标仪上进行分析数据的采集。与传统的多孔板技术相比，本发明省去了配制不同浓度样品溶液繁冗操作，同时在检测方法上又与传统的多孔板技术兼容，无需特殊操作和配备专用设备。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片下层微通道网络结构示意图。图中Cl和C2所示为连接下层道的输入口。当需要生成不同浓度的样品溶液时，Cl和C2分别输入最低和最高浓度的溶液。
[0024]图2为用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片上层微通道网络结构示意图。图中C3和C4所示为连接上层道的输入口，C5为废液口。荧光衍生化试剂由C3和C4输入芯片上层通道。图中所示的虚线圆圈为与下层通微道网络连通孔的连接位置。
[0025]图3为用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片组装顺序透视示意图。
[0026]图4为聚二甲基硅氧烷材料制成的用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片实物图。
[0027]图5用产物的荧光强度对底物的浓度作图，表征酶的活性。
[0028]图6用产物的荧光强度对抑制剂的浓度作图，表征的抑制剂活性。
【具体实施方式】
[0029]一种用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片，当需要一系列不同浓度的样品溶液时，只须配制最高和最低两个不同的样品溶液经Cl，C2输入，在流经芯片的下层微通道中的逐层增加分支的迂回的折线通道时，两个不同浓度的样品溶液经历了不断地定量分配、混合；再分配、再混合，最后生成一个浓度梯度的样品溶液供分析处理。
[0030]将酶固定在芯片的下层微通道中，酶催化反应产生的产物被带到上层微通道网络，不同浓度的产物与经C3、C4输入的等量的荧光衍生化试剂在上层通道反应生成荧光衍生物。生成的荧光衍生物在激发光照射时发出荧光，可记录到不同的强度荧光信号供数据分析处理。该用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片可作为酶、抑制剂活性分析及药物快速筛选的工具。
[0031]实施例1
[0032]将双通道微量注射泵的针头分别与芯片输入口 Cl、C2连接管线连通，输入口 C3、C4开启，液体由输入口 C3、C4和废液口 C5流出芯片。用0.1M NaOH冲洗通道30min，蒸馏水清洗后再用0.1M HCl冲洗30min，最后用0.01PBS缓冲液冲洗芯片通道。
[0033]完成上述通道冲洗后，将输入口 C3、C4关闭，液体由废液口 C5流出芯片。经输入口 C1、C2，以10μ L/min恒定流速，将BSA(lmg/mL)输入芯片下层微通道网络，并静置3.5小时。然后，再依次输入蛋白A (20 μ g/mL)和I %戊二醛的混合溶液、兔免疫球蛋白IgG (5 μ g/mL溶于0.01M PBS)溶液，孵育10分钟。后用洗涤液以50 μ L/min流速冲洗通道30s，洗去未被固定的兔疫球蛋白。
[0034]接着关闭废液口 C5，启开入口 C3、C4，液体由C3、C4流出芯片。将脲酶标记羊抗兔免疫球蛋白IgG抗体(5μ L/mL溶于含0.1% BSA的0.01M PBS)经输入口 C1、C2，以10 μ L/min的流速输入芯片通道,孵育10分钟。后用洗漆液在50 μ L/min流速下冲洗60s,洗去未结合的脲酶标记抗兔免疫球蛋白IgG。由于微通道具有较大的比表面积，脲酶标记的抗兔免疫球蛋白IgG很快地扩散，与兔免疫球蛋白IgG进行免疫反应而被固定。
[0035]实施例2
[0036]将按实施例1中所述操作步骤将脲酶固定于微流控芯片通道内，芯片置于37°C恒温槽内，两台双通道微量注射泵的针头分别与芯片上输入口 Cl、C2 ;C3、C4连接管线连通。由输入口 Cl、C2，将两种不同浓度脲(0mM、0.5mM)的0.2M磷酸盐缓冲溶液，以10 μ L/min恒定流速，输入下层微通道网络。经浓度梯度生成单元生成6列不同浓度的脲溶液与通道上固定的脲酶接触发生酶催化反应。孵育3min，脲被酶水解产生氨，经6个联通孔分别带到上层微通道网络。同时，将OPA试剂(即荧光衍生化试剂，由邻苯二甲醛100mg/mL无水乙醇溶液、巯基乙醇5 μ L/mL无水乙醇溶液和0.2M磷酸盐缓冲液按体积比1:1: 18混合)，经输入口 C3、C4，以10 μ L/min恒定流速输入上层微通道网络，流经等量分配单元生成6列相同浓度的OPA溶液，随后与水解产生的氨混合反应生成荧光衍生物。静置反应10min后，拆除芯片上的连接管线，关闭所有输入、输出口。将芯片置于酶标仪中，设置激发波长为420nm检测475nm波长的荧光信号，检测记录到6个不同强度的荧光信号分别对应氨的生成量。用荧光强度对底物的浓度作图(见图5)，可表征酶的活性。
[0037]实施例3
[0038]将按实施例1中所述操作步骤将脲酶固定于微流控芯片通道内，芯片置于37°C恒温槽内，两台双通道微量注射泵的针头分别与芯片上输入口 Cl、C2 ;C3、C4连接管线连通。由输入口 Cl、C2，将两种不同浓度的乙酰基羟肟酸(0mM、0.1mM)和相同浓度脲(0.1mM)的0.2M磷酸盐缓冲溶液，以10 μ L/min恒定流速注入下层微通道网络。经浓度梯度生成单元生成6列不同浓度的乙酰基羟肟酸和相同浓度脲的溶液，与通道上固定的脲酶接触发生酶催化反应，同时乙酰基羟肟酸对脲酶产生抑制作用。孵育3min，脲被酶水解产生氨，经6个联通孔分别带到上层微通道网络。同时，将OPA试剂经输入口 03工4，以1(^17!^11恒定流速输入上层微通道网络，流经等量分配单元生成6列相同浓度的OPA溶液，随后与水解产生的氨混合反应生成荧光衍生物。静置反应10min后，拆除芯片上的连接管线，关闭所有输入、输出口。将芯片置于酶标仪中，设置激发波长为420nm检测475nm波长的荧光信号，检测记录到6个不同强度的荧光信号分别对应氨的生成量。用荧光强度对抑制剂的浓度作图(见图6)，可表征的抑制剂活性，通过数据处理，得到抑制剂Ic5O 0.058±0.003mM。
【权利要求】
1.一种用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片及其应用，其特征在于:芯片主要由两层微通道网络构成， 设有2个输入口与芯片下层微通道网络连接，微通道网络为迂回的折线通道组合，这种迂回的折线通道由入输口端开始逐层延伸，每层增加一个分支，交错排列，作为浓度梯度生成单元，迂回的折线通道增扩至6列，每列末端处有一个穿透芯片基材的孔，这些孔有两个功能:作为酶固定和酶催化反应的主要区域、作为联通上下两层微通道网络的通道； 设有2个输入出口和I个废液口与芯片上层微通道网络连接，通道由输入出口端开始逐层延伸，每层增加一个分支，交错排列，作为等量分配单元，增扩至6列，继而改为6列迂回的折线通道延伸作为衍生化反应区，再续成扩展通道为检测窗口，6列通道最终汇聚于同一个废液口。
2.权利要求1所述用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片，其特征在于:芯片上下两层的微通道网络通过中间的连通孔相互连通，可通过改变芯片上的入输口和废液口的开启或关闭来控制芯片通道内液体的流向，具有将酶催化反应和产物衍生化反应分区域进行的功能，芯片上设置的检测窗口的排列和集成化微流控芯片的尺寸都与标准的酶标仪兼容。
3.一种用于酶催化产物荧光检测的集成化微流控芯片的应用，其特征在于:酶、酶固定剂、底物、药物、荧光衍生剂及洗涤液等依次经由微流控芯片上的输入口定量输入芯片通道； 只须配制最高和最低两个不同浓度的样品溶液经芯片下层输入口输入，可生成所需的不同浓度梯度的样品溶液供给下一个功能单元； 通过下层芯片输入口将与固定酶相关的通道修饰剂、交联剂、洗涤液等经由芯片下层输入芯片通道，关闭上层芯片输入出口，液体由废液口流出芯片；然后开启上层芯片输入出口，关闭废液口，将酶、稳定剂、缓冲液及洗涤液等经由芯片下层输入口输入芯片通道，关闭废液口，开启上层芯片输入出口，液体经上层芯片输入出口流出芯片，实现酶的区域固定；通过下层芯片输入口将底物、药物样品等溶液输入芯片通道，同时通过上层芯片输入出口将与产物衍生化相关试剂注入芯片通道，液体由废液口流出芯片，实现酶催化反应和产物衍生化反应分区域进行； 待酶催化反应完成或达到平衡、荧光衍生化反应完成稳定后，拆除芯片上的连接接头及管线，将芯片装入标准的酶标仪，采集、记录分析数据。
【文档编号】G01N21/64GK103801412SQ201210443857
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月8日 优先权日:2012年11月8日
【发明者】成志毅, 张琴, 唐修雯 申请人:中山大学