Cyp119酶表达载体及其纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及CYP119酶表达载体及其纯化方法。
【背景技术】
[0002] CYP119酶（cytochromeP450119)来自黄石公园火山口分离的嗜酸嗜热硫矿硫叶 菌（Sulfolobussolfataricus)，因此该酶具耐酸抗高温等作用。目前文献报道CYP119酶 在过氧化氢或假单孢氧还蛋白-还原酶（Pd/PdR)和辅酶NADPH条件下能催化月桂酸羟基 化和苯乙烯环氧化的反应。其突变体T214V能明显改善与苯乙烯的结合能力，过氧化氢途 径下的苯乙烯环氧化反应速率比野生型提高了近3倍。利用生物酶进行烷基的羟基化、环 氧化、氧化等反应，具有高度的区域选择性和立体选择性。其催化具有反应条件温和，环境 友好，选择性专一，过程高效等特点，在有机合成中应用广泛，是绿色化学发展的重要趋势， 因此CYP119酶和其突变酶是有机合成中具有潜力的生物催化剂候选。
[0003] 目前，国外有一些对CYP119酶进行大肠杆菌的克隆和表达的研究。如 McLean等（McLean MA, Maves SA,Weiss KE,et al.Biochemical and Biophysical Research. 1998, 252:166-172)将该酶基因构建到PUC18载体中定名为pKS119,在 E.coli TB-1细胞中进行表达。Koo LS等（Yano JK，Koo LS, Schuller DJ，et al. The journal of biological chemistry. 2000, 275:31086 - 31092)将该基因构建到pCWori 载体中进行表达。Rabe KS等（Rabe KS，Kiko K，Niemeyer CM. Chemical biology chemical. 2008, 9:420-425)将该基因构建到Gateway系统中的pD0NR221载体上在E. coli BL21 (DE3)中进行表达。之前的研究在构建原核表达载体时，都用了超长的引物设计，扩 增极其不便。并且目前的表达体系和方法的表达量较低，已报道的最高表达量是1L培养基 12. 5mg蛋白。
[0004] 同时，由于CYP119酶与咪唑会有一定程度的结合，而EDTA使酶活性中心金属 离子螯合，因此在进行酶的纯化中如何减少咪唑和不使用EDTA等螯合剂，不使酶变性失 活是技术的关键。McLean等（McLeanMA,MavesSA,WeissKE，etal.Biochemicaland BiophysicalResearch. 1998, 252:166-172)将粗酶液通过不同的浓度（順4)#04经盐析法 纯化后，溶液再过脱盐柱。KooLS等（YanoJK,KooLS,SchullerDJ，etal.Thejournal ofbiologicalchemistry. 2000, 275:31086 - 31092)报道，粗酶利用QS印harose和PBE94 柱和（NH4)2S04法进行纯化。RabeKS等（RabeKS，KikoK，NiemeyerCM.Chemicalbiology chemical. 2008, 9:420-425)利用Ni-NTA法纯化后，再过MonoQ离子交换柱后，其纯度方可 达到90%。以上的纯化方法都需要用到两次纯化柱甚至三次，在纯化过程中造成酶失活的风 险和酶的大量损失。
[0005] 目前本领域急需建立高效的CYP119酶表达和纯化体系。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是建立CYP119酶的高效表达体系。
[0007] 为解决本发明技术问题，本发明提供了含有CYP119酶编码基因的载体。
[0008] 其中，所述的CYP119酶的氨基酸序列为SEQIDNo. 2或SEQIDNo. 4所示。
[0009] 其中，上述的CYP119酶编码基因的核苷酸序列为：SEQIDNo. 1或SEQIDNo. 3所 /_J、i〇
[0010] 进一步的，上述的载体为表达载体。
[0011] 更进一步的，上述的载体为质粒。
[0012] 优选的，上述的质粒为pET30a。
[0013] 优选的，所述的pET30a的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示。
[0014] 再一个方面，本发明还提供了含有上述载体的宿主。
[0015] 进一步的，所述的宿主为大肠杆菌。
[0016] 为了更好地得到CYP119酶，本发明还提供了该酶的纯化方法，包括以下步骤： [0017]a、取发酵后的菌液离心收集菌体，PBS悬浮菌体，破碎细胞，获得粗酶液；
[0018]b、0. 22ym过滤膜过滤粗酶液，4°C下利用Ni-NTA亲和柱进行粗酶的纯化；
[0019] C、对洗脱液进行超滤膜浓缩，5000g4°C，离心60min，利用无咪唑的PBS溶液置换2 次，得到纯品。
[0020] 其中，步骤b中的洗脱条件为：平衡液I洗脱5个柱体积；将0. 22ym过滤膜过滤 后的粗酶液上柱；平衡液I洗5个柱体积；平衡液II洗5个柱体积；洗脱液I洗6~10个 柱体积；洗脱液II洗5个柱体积，收集洗脱液。
[0021] 具体的，平衡液I为 50mMPBS，pH7. 4,5mM咪唑；平衡液II为 50mMPBS，0. 5MNaCl， pH7. 4, 5mM咪唑；洗脱液I为 50mMPBS，pH7. 4, 20mM咪唑；洗脱液II为 50mMPBS，pH7. 4， 80mM咪唑。
[0022] 本发明中，步骤b中过柱纯化前先对柱子进行平衡，上样后，利用高盐进行平衡， 再利用低盐平衡，然后再进行。
[0023] 本发明的有益效果在于：本发明表达载体蛋白表达稳定，本底表达低，目标蛋白表 达量高，最高表达量可达20mg/L以上，大大优于现有技术。而本发明还通过巧妙的载体构 建，使得酶与Ni柱的亲和力降低，可以只使用低浓度的咪唑进行目标蛋白的洗脱，且减少 了杂蛋白，只过一根柱子就可以达到理想的纯度，节约了生产时间及成本，减少了酶的损失 且保留了酶的活性，具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0024] 图1、纯化CYP119酶SDS-PAGE电泳结果。泳道1 :粗酶液；泳道2 :Ni-NTA纯化后， 目标蛋白约43kDa。
[0025] 图2、纯化蛋白紫外吸收波长扫描图。实线代表纯化后CYP119的特征峰形，虚线表 示在通入C0之后，最大吸收峰漂移到450nm。
【具体实施方式】
[0026] 以下结合附图对本发明的【具体实施方式】进行进一步的详细说明。
[0027] 发明中主要使用的试剂和设备为：
[0028]限制性内切酶EcoRI、NotI、KpnI和XhoI，T4DNA连接酶，ExTaqDNA聚合 酶〇? 5U，购自TaKaRa(宝生物有限公司，大连）
[0029] 硫酸卡那霉素（Kan)、氨节青霉素（Amp)、氯霉素（Chl)，购自Ausable公司（美国）；
[0030] 异丙基-b-d-硫代半乳糖苷（IPTG)、三羟甲基氨基甲烷Tris、葡萄糖、琼脂Agar， 购自Sigma(西格玛公司，美国）；
[0031] 酵母提取物YeastExtract、胰蛋白胨Tryptone，购自0XID公司（美国）；
[0032] 丙烯酞胺，购自Bio-Rad(美国伯乐公司）；
[0033]N'，N' -亚甲基双丙烯酸胺购自Fluka公司（美国）；
[0034] 十二烷基硫酸钠（SDS)，无水乙醇，氯化钠、咪唑等其他化学试剂均购自四川科龙 化学试剂有限公司。
[0035]BL21 (DE3)plysS大肠杆菌，invitrogenCatalogC6565-03 (购自英俊公司，美国）
[0036]pET3〇a载体，Novagen公司Cat.No. 699〇9-3 (美国）
[0037]快速定点突变试剂盒（QuickchangeLightingSite-directedMutagenesis Kit)，安捷伦公司Catalog210518(AgilentTechologies，美国）
[0038]超滤管，MiUiporeAmicorTKUltra-15 (默克密理博公司，美国）
[0039]Ni-NTA，凯杰公司No. 30210 (Qiagen，德国）
[0040] 主要实验设备：PCR扩增仪，MastercyclerProS,eppendorf;高速冷冻离心机， eppendorfcentrifuge5417R/5810R;凝胶成像及分析系统，GelDocXR+，BI〇-RAD;超净工 作台，ThermoForma900Serise;HPS-280生化培养箱，哈尔滨东联电子；制冰机，SANYO;蛋 白质电泳仪，Bio-RadJY92-II超声波破碎仪，上海新芝生物技术研究所；紫外分光光度计 UV1700,上海凤凰光学科仪有限公司；紫外核酸蛋白分析仪，BeckmanDU800。
[0041] 实施例一CYP119酶的克隆及原核表达载体的构建
[0042]UCYP119酶基因的克隆
[0043] 嗜酸嗜热硫矿硫叶菌（Strain#35091)菌株购自美国ATCC(Americantype culturecollection，美国典型培养物保藏中心)，利用ATCC1304培养基对细菌进行培养， 并提取其基因组DNA。根据NCBI数据库中登录的CYP119酶基因的序列（GenebankNo: U51337)设计引物对该基因进行PCR扩增。电泳切下1200bp左右条带进行序列的测定，证 实该基因的正确性。
[0044] 根据酶切位点EcoRI和XhoI进行引物设计，引物序列为：
[0045]P1：CCGGAATTCATGTATGACTGGTTTAGTGA,
[0046]P2:CCGCTCGAGTTATTCATTACTCTTCAACCTGACC。
[0047]PCR反应条件：总体系 50iiL，10X反应缓冲液 4iiL，MgCl22. 5mmol?L_S dNTP2iimol.I71，引物 1iimol.L'DNA模版 1iiL，ExTaqDNA聚合酶 0? 5U(TaKaRa)。PCR 反应程序为：94°C预变性4min;94°C变性40sec，66°C退火50sec，72°C延伸2min，30个循 环；最后72°C延伸8min。PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒（Omega)对 其进行回收、纯化。
[0048]PMD19-T载体用T4DNALigase(TaKaRa)连接，并转入DH10B大肠