杆菌感受态细胞 中，筛选阳性菌落培养，提取质粒。并进行测序确认序列是正确可靠的。
[0049] 2、pET30a_CYP119 载体的构建
[0050] 利用EcoR I和Xho I对含CYP119基因的PMD19-T载体进行双酶切，产物用1%琼 脂糖凝胶电泳检测，切下含目的DNA片段的胶回收。同时对pET30a空载体进行双酶切。将 双酶切得到的DNA片段和pET30a片段连接，连接产物转入DH10B大肠杆菌感受态细胞中， 筛选阳性菌落。
[0051] 实施例二CYP119酶的突变酶的构建及原核表达载体的获得
[0052] (1) CYP119酶的突变：根据pET30a_CYP119载体设计突变位点的引物序列为：
[0053] PrimerF:GTAATGAGACTGTTACTAACTTAATATCAAACTCTGT
[0054] PrimerR:GATATTAAGTTAGTAACAGTCTCATTACCCGCTATGAG
[0055] (2)利用QuickchangeLightingSite-directedMutagenesisKit定点突变试剂 盒进行定点突变。
[0056] (3)挑选阳性克隆测序确认是否完成突变及突变后位点的准确性。
[0057] 实施例三CYP119酶的大量表达
[0058] (1)感受态细胞的转化
[0059] 将实施例获得的含野生型CYP119酶编码基因的pET30a质粒转化BL21 (DE3)plysS 大肠杆菌感受态细胞。野生型CYP119酶的核酸序列为SEQIDNo. 1所示，野生型CYP119 的氨基酸序列为SEQIDNo. 2所示。
[0060] (2)挑选阳性单菌落，接种于5mL双抗LB液体培养基中，37°C震荡培养过夜。取 2mL过夜培养的菌液于1L双抗的TB培养基培养基。加入250iiL/LTraceElement，37°C， 震荡培养至0D0. 6。加入0. 4mMIPTG至终浓度0. 4mM，32°C，诱导45h。
[0061] (3) 12000rpm，4°C离心lOmin，弃上清，加入 20mLPH7. 4,50mMPBS溶液充分悬浮 菌体。将样品置于冰水上，超声破胞仪，70%功率，5s-5s，30min分两次破完。破胞后在55°C 水浴中加热15min，12000rpm，4°C，离心40min，取上清液即为粗酶液。
[0062] 稀释201倍后酶的紫外分光光度计测得A415=0. 473,总共获得600微升浓缩酶，据 此算出酶量为23. 59mg/L。
[0063] 蛋白表达量的计算方法：根据朗伯比尔定律A=ebe。根据e415=1〇41111'每次纯 化后，吸取10UL纯酶稀释至2010yL。利用紫外分光光度计测定该酶在415nm的吸光度。 根据公式计算酶浓度，从而求得1L培养基所获得的酶量。
[0064] 实施例四CYP119-T214V突变酶的大量表达
[0065] (1)感受态细胞的转化
[0066] 将实施例二获得的含突变CYP119酶编码基因的pET30a质粒转化BL21(DE3)plysS 大肠杆菌感受态细胞。突变型CYP119酶的核酸序列为SEQIDNo. 3所示，突变型CYP119 的氨基酸序列为SEQIDNo. 4所示。
[0067] (2)挑选阳性单菌落，接种于5mL双抗LB液体培养基中，37°C震荡培养过夜。取 2mL过夜培养的菌液于1L双抗的TB培养基培养基。加入250iiL/LTraceElement，37°C， 震荡培养至0D0. 6。加入0. 4mMIPTG至终浓度0. 4mM，32°C，诱导45h。
[0068] (3) 12000rpm，4°C离心 10min，弃上清，加入 20mLPH7. 4,50mMPBS溶液充分悬浮 菌体。将样品置于冰水上，超声破胞仪，50%功率，3s-3s，20min分两次破完。破胞后在55°C水浴中加热15min，12000rpm，4°C，离心40min，取上清液即为粗酶液。
[0069] 稀释201倍后酶的紫外分光光度计测得A415=0. 5056,总共获得600微升浓缩酶， 据此算出酶量为25. 21mg/L。
[0070] 蛋白表达量的计算方法见实施例三。
[0071] 实施例五CYP119酶的纯化
[0072] 纯化柱子为Ni-NTA(QiagenNo. 30210)，采用自装柱，手动纯化。由于CYP119酶 与咪唑会一定程度的结合，而EDTA使酶活性中心金属离子螯合，因此在进行酶的纯化中如 何减少咪唑和不使用EDTA等螯合剂，不使酶变性失活是技术的关键。而本发明在载体构 建时只设计了C端6个His-tag标签，使得酶与Ni柱的亲和力稍微降低，以低浓度的咪唑 进行目标蛋白的洗脱，减少咪唑用量，且在洗脱杂蛋白之前通过利用高盐和低浓度咪唑梯 度洗脱的方法，减少了杂蛋白，只过一根柱子就可以达到理想的纯度，节约了生产时间及成 本，减少了酶的损失且保留了酶的活性。
[0073] 纯化所需试剂配方：
[0074]平衡液I:50mMPBS，PH7. 4, 5mM咪唑
[0075]平衡液II:50mMPBS，0. 5MNaCl，PH7. 4,5mM咪唑
[0076]洗脱液I:50mMPBS，PH7. 4, 20mM咪唑
[0077]洗脱液II:50mMPBS，PH7. 4,80mM咪唑
[0078] 纯化步骤：
[0079] 1)平衡液I洗脱5个柱体积。
[0080] 2)用灭菌的0.22i!m过滤膜过滤粗酶液，上柱。
[0081] 3 )平衡液I洗5个柱体积。
[0082] 4)平衡液II洗5个柱体积。
[0083] 5)洗脱液I洗6-10个柱体积。
[0084] 6)洗脱液II洗5个柱体积，收集洗脱液。
[0085] 将收集的洗脱液II用MilliporeAmicon?Ultra_1510K浓缩至500uL左右，再 用50mMPBS，PH7. 4置换缓冲液3次，浓缩至400iiL左右，酶液呈现鲜红色或红黑色。-80°C 保存。
[0086] 经过此纯化后，蛋白的纯度可达90%以上，能满足后续工作的要求。
[0087] 酶活性验证：
[0088] 1、将浓缩酶液稀释40倍，用紫外分光光度仪250nm-700nm扫描，得到P450119酶 的特征吸收谱图，在417nm处有最大吸收（图2)。
[0089] 2、将C0通入比色皿快速扫描，发现酶在417nm处的最高峰漂移到了 450nm处，说 明CYP119酶与C0结合后，发生了峰值的漂移，该酶是具有活性的（图2)。
[0090] 实施例六CYP119-T214V突变酶的纯化
[0091]CYP119-T214V突变酶的纯化过程与野生型CYP119酶一致，考虑到突变酶自旋态 的改变，仅在破胞时超声的功率和间歇时间有所变化。经过纯化后，蛋白的纯度也可以达到 90%以上。活性的验证方法与野生型酶一致。
[0092] 紫外扫描发现CYP119-T214V的最大吸收峰在417nm附近，由于突变酶改变了自旋 态因此其峰形与野生型有较大差异，但在C0结合最大吸收峰票已到了 450nm这点和野生型 酶是完全一致的，也表明CYP119-T214V突变酶同样保留了P450酶的基本特征。
[0093]通过上述实施例可以看出，本发明的表达体系的表达稳定，本底表达低，目标蛋白 表达量高，最高表达量可达20mg/L以上，大大优于现有技术报道的12. 5mg蛋白/L。此外， 本发明纯化方法只过一根柱子就可以达到理想的纯度，节约了生产时间及成本，减少了酶 的损失且保留了酶的活性，具有很好的应用前景。
【主权项】
1. 含有CYPl 19酶编码基因的载体。
2. 如权利要求1所述的载体，其特征在于：所述的CYP119酶的氨基酸序列为SEQ ID No. 2 或 SEQ ID No. 4 所示。
3. 如权利要求1或2所述的载体，其特征在于：所述的CYPl 19酶编码基因的核苷酸序 列为：SEQ ID No. 1 或 SEQ ID No. 3 所示。
4. 如权利要求1~3任一项所述的载体，其特征在于：所述的载体为表达载体。
5. 如权利要求1~4任一项所述的载体，其特征在于：所述的载体为质粒。
6. 如权利要求5所述的载体，其特征在于：所述的质粒为pET30a。
7. 如权利要求6所述的载体，其特征在于：所述的pET30a的核苷酸序列如SEQ ID No. 9 所示。
8. 含有权利要求1~7任一项所述载体的宿主。
9. 如权利要求8所述的宿主，其特征在于：所述的宿主为大肠杆菌。 10. CYPl 19酶的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤： a、 取发酵后的菌液离心收集菌体，PBS悬浮菌体，破碎细胞，获得粗酶液； b、 0. 22 y m过滤膜过滤粗酶液，4°C下利用Ni-NTA亲和柱进行粗酶的纯化； c、 对洗脱液进行超滤膜浓缩，5000g4°C，离心60min，利用无咪唑的PBS溶液置换2次， 得到纯品。
11. 如权利要求10所述的方法，其特征在于：步骤b中的洗脱条件为：平衡液I洗脱5 个柱体积；将〇. 22 y m过滤膜过滤后的粗酶液上柱；平衡液I洗5个柱体积；平衡液II洗5 个柱体积；洗脱液I洗6~10个柱体积；洗脱液II洗5个柱体积，收集洗脱液。
12. 如权利要求11所述的方法，其特征在于：平衡液I为50mM PBS，pH7. 4,5mM咪唑； 平衡液 II 为 50mM PBS，0. 5M NaCl，pH7. 4,5mM 咪唑；洗脱液 I 为 50mM PBS，pH7. 4,20mM 咪 唑；洗脱液 II 为 50mM PBS，pH7. 4,80mM 咪唑。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及CYP119酶表达载体及其纯化方法。本发明要解决的技术问题是建立CYP119酶的高效表达体系。为解决本发明技术问题，本发明提供了含有CYP119酶编码基因的载体。本发明还提供了含有前述载体的宿主。本发明还提供了CYP119酶的纯化方法。本发明可用于CYP119酶的生产。
【IPC分类】C12R1-19, C12N9-04, C12N15-63, C12N1-21
【公开号】CN104745615
【申请号】CN201310744163
【发明人】王钦, 张春, 李静, 何芳, 肖星茂
【申请人】泸州医学院
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年12月30日