重组人乳头瘤病毒6和11亚型蛋白毕赤酵母表达的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体而言，本发明涉及人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白， 其编码基因，及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 人乳头状瘤病毒（humanpapillomavirus,HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亚科的 一个无包膜的小型双链环状DNA病毒。HPV可通过人体间的密切接触传播，引起被感染者 的皮肤出现寻常疣和肛门生殖器尖锐湿疣等病变，被列为性传播疾病。1995年，国际癌症 研究中心公布的研究结果证实，HPV与宫颈癌有密切的因果关系。由此可见，HPV感染已成 为严重危害人类健康的病原体。因此，研制高效、廉价的HPV疫苗，对于预防女性宫颈癌和 HPV感染所引起的性传播疾病具有十分重要的意义。
[0003] 国内目前尚无系统的尖锐湿疣和HPV相关调查，但是各地区的分别调查基本可以 说明HPV6、11在尖锐湿疣中的重要作用。近期的深圳地区的流行病学调查结果显示HPV6、 11型感染者在尖锐湿疣患者中约占80% (深圳市人民医院352例尖锐湿疣患者生殖道人乳 头状瘤病毒基因亚型的分布及意义，唐敏；戴勇；吕晓萍；李体远；第三军医大学学报， 2007年21期);临沂地区的调查结果HPV6、11型感染者在尖锐湿疣患者中占85. 19%，（108 例尖锐湿疣患者HPV的基因分型及临床分析，熊瑛；社区医学杂志，2007年17期)。
[0004] 尖锐湿疣是最常见的性病之一，其发病率逐年上升，据统计，尖锐湿疣在我国年轻 成人中患病率可达0. 5%-1%，有些地区发病数占全部性病病人的20%-31%，而且按照流行病 学的统计原则，实际患者数量至少是统计数量的3倍甚至更多。庞大的发病人群加上几乎 空白的国内疫苗市场，针对尖锐湿疣的预防性疫苗有着巨大的市场前景。
[0005] 尖锐湿疣是一种发生于肛门、生殖器等部位的性传播疾病。研究表明许多型别HPV 的感染与尖锐湿疣发病相关，但国内外的流行病学研究结果显示以HPV6、11型最多见，相 关度可高达90%以上。因此，研制HPV6、11型疫苗将起到良好的预防尖锐湿疣作用。
[0006]HPV是无包膜二十面体对称病毒，其病毒基因组DNA为闭合环状，长度约 7200_8000bp，由早期编码区（earlyregion)、晚期编码区（lateregion)和位于两者之间 的长调控区（longcontrolregion)组成。其中晚期编码区含两个开放阅读框（0RF)，编码 病毒衣壳蛋白LI、L2。L1蛋白分子量约55kDa，为主要衣壳蛋白，以72个五聚体的形式支 撑整个病毒衣壳结构，在不同型别中氨基酸序列高度保守，能够刺激机体产生保护性抗体。 L2蛋白分子量较小，多位于L1蛋白内部。HPV直径约为45~55nm，呈球形，无包膜，衣壳为 由72个壳微粒组成对称偏斜的20面体。其病毒颗粒衣壳由主要衣壳蛋白（L1)和次要衣 壳蛋白（L2)组成。王要衣壳蛋白L1在细胞中表达后能自动组装成衣壳颗粒，称为病毒样 颗粒（VLPs)。
[0007] 昆虫表达系统、酵母表达系统、原核表达系统和哺乳动物细胞等多种表达系统都 可以通过单独表达主要衣壳蛋白L1或联合表达L1+L2的方式获得病毒样颗粒（VLPs)。L1 单独表达得到的VLPs与天然病毒衣壳结构类似，可用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的 高效价病毒中和抗体应答。
[0008] 因此，鉴于在不同基因型的L1蛋白内部高度保守，并且能够单独表达形成 (VLPs)，以L1蛋白作为HPV疫苗研发的目标蛋白具有较高的可行性。不过，以表达重组病 毒蛋白得到的VLPs作为HPV疫苗的商业化开发与生产需要解决许多技术问题，其中第一个 必须克服的困难就是重组病毒蛋白的表达水平。
[0009] 尽管现有技术中已经开发了一些针对HPV的疫苗，然而普遍还存在HPV蛋白表达 效率低下，表达获得的蛋白活性低，无法组装成病毒样颗粒或组装获得的颗粒免疫效果不 理想等问题。因此，本领域还有必要开发改进的HPV疫苗产品。
【发明内容】
[0010] 利用毕赤酵母作为表达重组蛋白的表达系统，具有表达量高、操作简便、成本低等 特点，并且相较于更高等的昆虫细胞与哺乳动物细胞而言更利于大规模工业化生产。由于 不同物种间氨基酸密码子使用频率不一，在利用毕赤酵母表达重组蛋白的时候，往往根据 目的蛋白的氨基酸序列经过密码子优化调整后得到更利于翻译的DNA序列。因此，本发明 的经过密码子优化后的HPV6和11L1基因在毕赤酵母中可以获得较高的表达水平，更有利 于针对HPV6和11的预防性疫苗的研发与生产。
[0011] 根据本发明的第一方面，提供一种分离的基因，其编码人乳头状瘤病毒主要衣壳 蛋白L1，所述的基因具有毕赤酵母偏爱的密码子。
[0012] 在优选的实施方式中，所述分离的基因为能够在毕赤酵母中表达的HPV6和11L1 基因，所述基因分别具有SEQIDN0 :2和4所示的核苷酸序列。
[0013] 在本发明的第二方面，提供一种表达载体，所述的表达载体中含有所述的基因的 序列。
[0014] 在一优选的实施方式中，所述的表达载体是毕赤酵母表达载体。
[0015] 在本发明的第三方面，提供一种基因工程化的宿主细胞，所述的细胞含有所述的 表达载体，或其基因组中整合有所述的基因。
[0016] 在一优选的实施方式中，所述表达载体含有本发明的HPV6或11L1基因。
[0017] 根据本发明的一个具体实施方案，所述含有本发明的HPV6或11L1基因的表达载 体来源于pPICZaB载体。
[0018] 在本发明的第四方面，提供一种基因工程化的宿主细胞，所述的细胞含有所述的 表达载体，或其基因组中整合有所述的基因。
[0019] 在一优选的实施方式中，所述的细胞是毕赤酵母细胞。较佳地，所述的毕赤酵母菌 株选自毕赤酵母X-33、GS115、KM71或SMD1168菌株。最佳的，所述的毕赤酵母菌株是毕赤 酵母X-33。
[0020] 在一优选的实施方式中，所述宿主细胞含有本发明的HPV6或11L1基因或表达载 体的毕赤酵母菌株，所述菌株能够高水平地表达生产HPV6或11L1蛋白。
[0021] 在本发明的第五方面，提供一种具有免疫原性的大分子（即病毒样颗粒），该大分 子的直径为50-80nm，主要由人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1自我装配而成，所述的人乳 头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1是毕赤酵母表达的。
[0022] 在一优选的实施方式中，所述的具有免疫原性的大分子通过以下方法制备获得： (1) 培养所述的宿主细胞，从而在宿主细胞内表达所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋 白L1，并组装形成具有免疫原性的大分子； (2) 分离所述的具有免疫原性的大分子。
[0023] 在本发明的第六方面，提供一种制备所述的具有免疫原性的大分子的方法，所述 方法包括： (1) 培养所述的宿主细胞，从而在宿主细胞内表达所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋 白L1，并组装形成具有免疫原性的大分子； (2) 分离所述的具有免疫原性的大分子。
[0024] 在本发明的第七方面，提供一种具有免疫原性的组合物，所述的组合物中含有： (i) 有效量的所述的具有免疫原性的大分子；和 (ii) 药学上可接受的载体。
[0025] 在一优选的实施方式，所述的药学上可接受的载体包括至少一种免疫刺激剂或佐 剂。
[0026] 在一优选的实施方式中，所述的佐剂是铝佐剂。
[0027] 在一优选的实施方式中，所述的组合物是疫苗。
[0028] 在本发明的第八方面，提供所述的具有免疫原性的大分子的用途，用于预防或治 疗人乳头状瘤病毒感染相关疾病。
[0029] 在一优选的实施方式中，所述的人乳头状瘤病毒感染相关疾病选自：尖锐湿疣、肿 瘤（如宫颈癌、阴道癌、肛门或肛周的癌症、口咽部的癌症、上颌窦癌、肺癌）或宫颈上皮内 瘤样病变。
[0030] 在本发明的第九方面，提供了一种在毕赤酵母中表达HPV6和11L1基因的方法， 包括下述步骤： (1) 将本发明的HPV6或11L1基因克隆入表达载体中； (2) 将步骤（1)所得的表达载体转化至毕赤酵母菌株中； (3) 使用抗生素对步骤（2)所得的转化菌株进行筛选，获得生长情