水稻基因OsVHA1在延缓植物叶片衰老和提高植物耐盐性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程和水稻分子育种技术领域，尤其涉及一种水稻基因 OsVHAI在延缓植物叶片衰老和提高植物耐盐性中的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是最重要的粮食作物之一，世界上超过一半的人口以稻米为主食。在我国，随 着人口的不断增加和土地面积的减少，对于水稻产量增加的要求越来越迫切，国家粮食安 全战略也就显得尤为重要。因此，培育高产优质水稻品种，不断提高水稻单产，是确保我国 粮食安全的第一重任。叶片是水稻最重要的光合器官，据理论推算，水稻籽粒灌浆的60%~ 80%营养物质来自叶片的光合作用。所以，水稻抽穗到灌浆期间，功能叶的过早衰老，将影 响水稻灌衆速度，进而导致产量和品质下降（ThomasHandSmartCM.Cropsthatstay green.AnnApplBiol，1993,123 :193-219)。研宄表明，若在水稻籽粒灌浆后期设法延长水 稻功能叶片的寿命1天，稻谷产量可以增加1%~2%左右（刘道宏.植物叶片的衰老.植 物生理学通讯，1993, 2 :14-19 ;马跃芳和陆定志.灌水方式对杂交水稻衰老及生育后期一 些生理活性的影响，中国水稻科学，1990, 2 :56-6)。
[0003] 叶片衰老是一个细胞程序性死亡的过程，是水稻在长期进化和适应环境的基础上 形成的，是其生长发育的一个必经阶段。水稻叶片衰老常常伴随着水解化合物的大量重组 并向植物生长部分运输，例如幼嫩的叶片和发育的种子等，因此，叶片的衰老对水稻营养物 质分配再利用与生殖发育有重要意义（LimP0，KimHJ，NamHG.Leafsenescence.Annu RevPlantBiol，2007, 58:115-136)。叶片自然衰老，依赖年龄的方式进行，并由诸多环境 因素诱导，受生长发育时期复杂的内外因素之间的相互作用影响（YoshidaS.Molecular regulationofleafsenescence.CurrOpinPlantBiol，2003,6 :79_84;LimP0,KimH J，NamHG.Leafsenescence.AnnuRevPlantBiol，2007,58:115_136)D 外界因素包括 持续黑暗、涝害、干旱、盐害、极端温度和紫外线等，内部因素包括内源激素和大量衰老相关 基因等（LimP0，KimHJ，NamHG.Leafsenescence.AnnuRevPlantBiol，2007,58 : 115-136;WuXY，KuaiBK，JiaJZ，JingHC.Regulationofleafsenescenceandcrop geneticimprovement.JIntegrPlantBiol，2012,54 :936_952)〇Liu等（LiuL，ZhouY， ZhouG，YeR，ZhaoL，LiX，LinY.Identificationofearlysenescence-associated genesinriceflagleaves.PlantMolBiol，2008,67:37-55)利用抑制差减杂交法鉴定 获得533个叶片衰老相关的差异表达基因，其功能涉及大分子物质代谢、调控蛋白质合成、 能量代谢、调苄基因、解毒、病原性和逆境、细胞骨架构成和花发育等。
[0004] 质子泵是依赖于ATP水解释放的能量驱动逆浓度梯度转运氢离子通过膜的膜整 合糖蛋白，从而造成膜两侧的pH梯度和电位梯度，进而调控植物生长发育。在植物细胞中 存在三类质子泵，分别是位于质膜上的质膜质子泵（PlasmaMembraneH+-ATPase)、位于液 泡膜上的H+_PPase(VacuolarH+-pyrophosphatse)以及囊泡型H+_ATPase(Vacuolar-type H+-ATPase)(GaxiolaRA，PalmgrenMG，SchumacherKS.Plantprotonpumps.FEBS Letters，2007, 581 :2204-2214)。其中囊泡型H+-ATPase不仅是植物细胞中最古老也是最 复杂的蛋白复合体，在结构上及组成上与F-typeATPase类似，由V0和VI两个蛋白复合体 组成，前者位于膜内，由a、c、c"、d和e等5种亚基组成，总分子量约260kD，负责质子转运； 后者是位于膜外的亲水性复合体，由A-H等8种亚基组成，总分子量640kD，负责ATP的水解 (SchumacherK?KrebsM.TheV-ATPase：smallcargo，largeeffects.CurrOpinPlant Biol. 2010,13 :724-730)。在双子叶模式植物拟南芥和单子叶模式植物水稻中，分别由28 个和 24个基因编码 13个亚基（SchumacherK，KrebsM.TheV_ATPase:smallcargo,large effects.CurrOpinPlantBiol. 2010,13:724-730)。因此，囊泡型H+-ATPase作为质子泵 中的重要成员之一，最重要的功能是驱动H+逆浓度梯度泵入液泡腔中，酸化液泡，为物质运 输提供能量，从而影响膨压和细胞扩增；以及维持高尔基体、溶酶体、吞饮小泡和突触小泡 等细胞器内的低pH值，为溶酶体的消化功能或受体介导的内吞后受体再循环或高尔基体 加工蛋白质等生理活动提供必要条件（RatajczakR.Structure，functionandregulation oftheplantvacuolarH(+)-translocatingATPase.BiochimBiophysActa. 2000?1465 ： 17-36；NishiT，ForgacM.Thevacuolar(H+)-ATPases-nature!smostversatile protonpumps.NatRevMolCellBiol. 2002, 3:94-10)DD 现有的研究显示，植物囊泡型 H+-ATPase的主要功能为：其一是囊泡型H+-ATPase在转运H+的基础上调节液泡和细胞质中 的pH，以及调节细胞质中的Na+、Ca2+和K+等离子浓度，响应盐胁迫（ApseMP，AharonGS， SneddenWA?BlumwaldESalttoleranceconferredbyoverexpressionofavacuolar Na+/H+antiportinArabidopsis.Science. 1999, 285 :1256-1258;YangMF，SongJ，Wang BS.Organ-specificresponsesofvacuolarH-ATPaseintheshootsandrootsofC halophyteSuaedasalsatoNaCl.JIntegrPlantBiol. 2010,52:308-314);其二是囊泡 型H+-ATPase的活性与众多激素息息相关，能够响应GA、ABA和SA(CooleyMB，YangH，Dahal P，MellaRA，DownieAB，HaighAM，BradfordKJ.VacuolarH(+)_ATPaseisexpressed inresponsetogibberellinduringtomatoseedgermination.PlantPhysiol. 1999， 121 :1339-1348);其三是囊泡型H+-ATPase的活性与NO信号传导紧密相关，响应非生 物胁迫（ChenJ，XiaoQ，WuF，DongX，HeJ，PeiZ，ZhengH.Nitricoxideenhances saltsecretionandNa(+)sequestrationinamangroveplant，Avicenniamarina， throughincreasingtheexpressionofH(+)-ATPaseandNa(+)/H(+)antiporterunder highsalinity.TreePhysiol. 2010, 30 :1570-1585;ZhangY，WangL，LiuY，ZhangQ， WeiQ?ZhangW.Nitricoxideenhancessalttoleranceinmaizeseedlingsthrough increasingactivitiesofproton-pumpandNa+/H+antiportinthetonoplast. Planta. 2006,224 :545-555);其四是囊泡型H+-ATPase在细胞壁形成中扮演重要角色 (Schachtschabel等，2012 ;Chen等，2013);其五是囊泡型H+_ATPase还在植物叶片的保卫 细胞中起到重要作用，可以调节气孔的开闭（ChenGl，LiuX，ZhangL，CaoH，LuJ，Lin F.InvolvementofMoVMA11，aPutativeVacuolarATPasecfSubunit，inVacuolar AcidificationandInfection-RelatedMorphogenesisofMagnaportheoryzae.PLoS One. 2013,8:e67804);以及囊泡型H+-ATPaseala2双突变将导致叶尖以及花均出现不同 程度的坏死（KrebsM，BeyhlD，（:i6iiichE，Al-RasheidK，MartenI，StierhofY，Hedrich R，SchumacherK.ArabidopsisV-ATPaseactivityatthetonoplastisrequired forefficientnutrientstoragebutnotforsodiumaccumulation.PNAS，2010,107 : 3251-3256)〇
[0005]囊泡型H+_ATPase的A亚基（YacuolarH+_ATPaseA_subunit，简称VHA)和B亚 基主要参与ATP水解，A亚基是催化ATP水解的亚基，而B亚基则为非催化亚基，两者均 有ATP结合位点。在单子叶水稻和玉米中均有2个基因编码A亚基，而在双子叶拟南芥 中则仅有 1 个基因编码A亚基（SchumacherK，KrebsM.TheV-ATPase:smallcargo， largeeffects.CurrOpinPlantBiol. 2010，13 :724_730)，其在苹果（DongQL，WangCR， LiuDD，HuDG，FangMJ，YouCX，YaoYX，HaoYJ.MdVHA-AencodesanapplesubunitA ofvacuolarH(+)-ATPaseandenhancesdroughttoleranceintransgenictobacco seedlings.JPlantPhysiol. 2013,15 ;170 :601_609)、甜菜（KirschM，AnZ，Viereck R，LowR，RauschT.SaltstressinducesanincreasedexpressionofV-type H(+)_ATPaseinmaturesugarbeetleaves.PlantMolBiol. 1996,32:543_547)、拟 南芥（MagnottaSM，GogartenJP.Multisitepolyadenylationandtranscriptional responsetostressofavacuolartypeH+_ATPasesubunitAgeneinArabidopsis thaliana.BMCPlantBiol. 2002,2:3)和番前（BageshwarUK，Taneja-BageshwarS， MoharramHM?BinzelMLTwoisoformsoftheAsubunitofthevac