一个调控水稻叶片衰老的基因OsSWEET5及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物基因工程领域，具体涉及到一个调控水稻叶片衰老的基因OsSWEET5及应用。该基因的核酸序列如SEQ?ID?NO：1的1-1363位所示，其编码的蛋白质序列如SEQ?ID?NO：2所示。构建了由CaMV35S启动子驱动该基因表达的双元表达载体，利用农杆菌介导法转化水稻宿主，得到超量表达的转基因水稻植株。检测结果表明，转基因水稻植株叶片衰老进程明显加速，说明该基因在水稻中具有调控叶片衰老的功能。本发明得到的超量表达转基因植株改变了叶片衰老进程，为基因工程和分子育种提供了新的资源。
【专利说明】—个调控水稻叶片衰老的基因0sSWEET5及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程【技术领域】，具体涉及水稻叶片衰老相关基因0sSWEET5及应用。
【背景技术】
[0002]高等植物的叶片是进行光合作用合成光合产物(主要是糖类)的主要器官。光合产物在源叶片中合成后，首先从叶肉细胞运至韧皮部，然后经韧皮部的装载、运行、卸载后，输送到库器官，以供库器官的生长发育。如果增大农作物源的装载能力或库的卸载能力，将会有更多的光合产物输入库器官，这将对提高农作物的产量有很大的帮助。而叶片衰老会导致光合作用的下降，减少碳同化，从而影响农作物的产量。因此，有计划的控制叶片衰老的发生，使光合产物朝人们所希望的方向转运，对于控制农作物的产量具有重要的意义。
[0003]单糖是大多数异养生物中碳源和能源的主要来源，也是植物生长发育的基本能量和营养物质(Bilttner 等，Monosaccharide transporters in plants: structure, funct1nand phys1logy.B1chimica B1physica Acta, 2000, 1465:263-274)。由于单糖在运输的过程中很容易被水解，而且常会引起细胞渗透压的变化，因而通常转变为蔗糖或其衍生物的形式进行长距离运输；当其到达库器官后，又被重新水解成单糖，由单糖转运蛋白转运到库器官，从而被吸收和利用(王俊刚等，植物单糖转运蛋白，植物生理学通讯，2007，43(6):1195-1200 ;郭婷等，甘蔗单糖转运蛋白基因ShPST2a克隆及亚细胞定位，热带作物学报，2013，34 (3):429-432)。因此，单糖在植物体内的运输与分配显得非常重要。单糖转运蛋白影响着单糖的转运、积累和分配，从而对植物的生长发育有着重要的影响。
[0004]MtN3/sal iva/SWEET家族蛋白普遍含有2个MtN3/sal iva跨膜结构域的，其成员广泛存在于动植物和微生物中。最近有研究者分析了各个物种中的MtN3/sal i va/SWEET家族，鉴定了一些可以转运单糖的 MtN3/saliva/SWEET 蛋白(Yuan 等，Rice MtN3/Saliva/SWEETfamily genes and their homologs in cellular organisms.Mol Plant, 2013，6:665—674 ;Yuan Rice MtN3/saliva/SWEET gene family:Evolut1n, express1n profling, andsugar transport.J Integr Plant B1l, 2014，56:559-570)。研究表明一些MtN3/saliva/SWEET蛋白可以作为单糖转运蛋白来影响植物的生长发育。AtSWEET16定位于液泡，可以转运葡萄糖、果糖和蔗糖，超表达AtSWEET16的转基因植株中单糖和蔗糖含量都发生明显改变，同时萌发率和耐寒性都显著增强(Klemens等，Overexpress1n of the vacuolarsugar carrier AtSWEET16 modifies germinat1n, growth, and stress tolerance inArabidopsis.Plant Phys1l, 2013, 163:1338-1352)。AtSffEET17 是拟南芥中的一个液泡果糖转运蛋白，能将果糖从液泡内转运到细胞质中，它的突变体植株生长迟缓，叶片糖含量发生明显变化，而且种子产量受到了影响，说明AtSWEET17可以调控拟南芥叶片中果糖的含量，在植物碳水化合物的分配过程中起着重要的作用(Chardon等，Leaf fructosecontent is controlled by the vacuolar transporter SWEET17 in Arabidopsis.CurrB1l,2013, 23:697-702)。
[0005]水稻是人类主要的粮食作物之一，采用分子遗传调控的手段来控制叶片的衰老，使光合产物朝人们所希望的方向转运，这对于控制农作物的产量具有重要的意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一个水稻叶片衰老相关基因在调控水稻叶片衰老进程中的应用。
[0007]在 申请人:之前的研究中，一个MtN3/saliva/SWEET基因0sSWEET5编码一个可以转运半乳糖，而不能转运蔗糖的蛋白，同时0sSWEET5的超量表达转基因植株不仅叶片衰老进程加速，而且叶片中单糖和鹿糖含量都发生了明显改变(Zhou等，Overexpress1nof 0sSWEET5 in rice causes growth retardat1n and precoc1us senescence.PLoSOne, 2014,9:e94210)。本发明就是利用有关分子生物学方法，构建了由CaMV35S启动子驱动0sSWEET5表达的双元表达载体，并用农杆菌介导法转化水稻，并将之用于水稻的基因工程改良，从而调控水稻叶片糖类的分配和衰老进程。
[0008]上述调控叶片衰老的基因来源于水稻，它是下列核苷酸之一:
[0009]1)SEQ ID NO:1的1-1363位所示的核苷酸序列；
[0010]2) SEQ ID NO:2所示的蛋白质序列。
[0011]3)此外，本发明还涉及水稻叶片衰老相关基因0sSWEET5的表达载体构建，该载体包含有超量表达的如序列表SEQ ID N0:1的1-1363位所述核苷酸序列的基因。
[0012]本发明克隆的水稻叶片衰老相关基因0sSWEET5具有以下开发前景:
[0013]I)为了便于对转基因的细胞或植物进行筛选，可以对所使用的载体进行改造，例如加入植物可选择性标记(例如Bar基因、⑶S基因、GFP基因和Lux基因等，这些基因都是报道的常见标记基因)；
[0014]2)为了改变目的基因0sSWEET5的表达量，可在其转录起始核苷酸前使用不同的启动子，如增强型启动子、诱导型启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、发育时期特异性启动子等。
[0015]3)带有本发明的0sSWEET5基因的表达载体除了可以通过农杆菌Ti质粒介导法来转化外，还可以通过Ri质粒、植物病毒载体、显微注射等方法来转化不同的植物细胞或组织，并将其育成植株，以获得加速叶片衰老的转基因植物。
[0016](4)本发明还涉及所述水稻叶片衰老相关基因0sSWEET5表达载体的水稻转基因植株。
[0017](5)本发明的基因在调控植物叶片衰老进程方面有重要应用，其中，被转化的宿主可以是单子叶植物，如水稻、玉米、小麦和草坪草等；也可以是双子叶植物，如拟南芥、杨树、大豆和棉花等，但不局限于以上所述物种。
[0018]本发明的具体技术方案如下:
[0019](I)以全长cDNA克隆J023023E05为模板，经PCR扩增0sSWEET5的全长cDNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0020](2)将步骤(1)中得到的DNA片段连接到载体pCAMBIA1300s上，得到pl300s-0sSWEET5，然后将其导入农杆碱型的根癌农杆菌EHA105(由CAMBIA惠赠)，利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述的载体pl300s-0sSWEET5导入水稻品种中花11，获得转基因植株；
[0021](3)利用Northern blot的方法检测转基因水稻植株及野生型(未转基因)植株中0sSWEET5基因的表达量。
[0022](4)测定转基因植株叶片的叶绿素含量，观察其表型并拍照，分析转基因植株和野生型植株叶片衰老情况的差异。
[0023](5)测定苗期野生型和转基因植株叶片中各种糖的含量，比较转基因和野生型植株叶片中糖含量的差别。
[0024]本发明的优点在于:
[0025](I)本发明鉴定了一个叶片衰老相关基因0sSWEET5，可为后续的研究者提供参考。
[0026](2)本发明中鉴定叶片裳老相关基因的方法，可为后续的研究者提供参考。
[0027](3)本发明得到了一个编码糖转运蛋白的基因，它的表达量可以控制叶片中糖的分配，为今后碳水化合物的分配研究奠定基础。
[0028](4)本发明得到的超量表达转基因植株叶片中各种糖的含量发生了明显变化，为分子育种提供了新的资源。
[0029](5)本发明得到的超量表达转基因植株改变了水稻叶片衰老进程，为基因工程和分子育种提供了新的资源。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的基因0sSWEET5的全长cDNA序列。长度为1363bp ;其 CDS 区域从 337 bp - 1050 bp,长度为 714 bp。
[0031]序列表SEQ ID NO:2是本发明克隆的0sSWEET5蛋白序列，编码237个氨基酸。
[0032]图1:是原始pCAMBIA1300s的载体图。
[0033]图2:是改造后的重组载体pl300s-0sSWEET5的构建简图。
[0034]图3:是水稻野生型(非转基因)和T2代(转基因)的0sSWEET5超量表达转基因植株在萌发后15 d的图片。图中标记Bar值代表10 cm。图3中从左至右依次WT-野生型(非转基因)植株；0X1-转基因植株；0X2-转基因植株；0X3-转基因植株；0X4-转基因植株。
[0035]图4:是用Northern blot的方法分析超量表达水稻转基因植株中0sSWEET5的表达量。图中标记=WT表示野生型(非转基因)植株；0X1 - 0X4表示转基因植株。RNA样品来自于T2代单拷贝家系和野生型植株苗期的第二片叶。
[0036]图5:是0sSWEET5超量表达水稻转基因植株和野生型中叶片叶绿素含量的测定。样品来自于图3中转基因植株的第二片叶。试验设置3个重复。“**”表示t测验的P值小于0.01，差异极显著。
[0037]图6:是0sSWEET5超量表达水稻转基因植株和野生型水稻植株中叶片糖含量的测定结果。试验设置3个重复。表示t测验的P值小于0.05，差异显著；“**”表示七测验的P值小于0.01，差异极显著。
【具体实施方式】
[0038]实施例1:候选片段的获得
[0039]0sSWEET5基因来源于Liu等人的构建的SSH文库(参见:Liu等，Identificat1nof early senescence-associated genes in rice flag leaves.Plant MolB1l, 2008，67:37-55)，其 LOC 号为 L0C_0s05g51090。 申请人:利用其 LOC 号在 TIGR(http: //rice, plantb1logy.msu.edu)中搜索，得到 0sSWEET5 的 CDS 序列，随后在 KOME(http://cdnaOl.dna.affrc.g0.jp/cDNA/)中进行比对，得到0sSWEET5的全长cDNA,克隆号码为J023023E05，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0040]以全长cDNA克隆J023023E05为模板，经PCR扩增0sSWEET5的全长cDNA。扩增该片段的引物的 DNA 序列为:F:5’ -ggtaccGGTGCTCTGCCTCTCCATTA-3’；R:5’ -tctagaCCCGTCACAGTTACATGCAC-3’。回收PCR产物后，将其连入pGEM-T载体(购自Promega公司);将连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，通过抗性筛选、酶切及测序检测(为常规方法)，得到0sSWEET5基因的阳性TA克隆。对阳性TA克隆进行测序，结果表明，该阳性TA克隆含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0041]实施例2:0sSWEET5基因超量表达载体的构建
[0042]为了能更好地阐明该基因的功能， 申请人:将该基因0sSWEET5在水稻中超量表达，从转基因植株的表型来验证其功能。
[0043]具体操作如下:
[0044](I)将实施例1中含有0sSWEET5基因的阳性TA克隆用Kpn I和Xba I双酶切后，与经Kpn I和Xba I双酶切的载体pCAMBIA1300s (由澳大利亚CAMBIA惠赠)骨架片段连接。pCAMBIA1300s 载体改造自 pCAMBIA1300 (http: //www.cnk1.net/,叶水锋,水稻 CDPKs 基因的表达谱分析和黑藻Hvppc2转基因水稻的培育和功能分析。[博士学位论文]。武汉:华中农业大学图书馆，2009)，其载体图如图1所示。
[0045](2)将步骤(1)中的连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。
[0046](3)通过抗性筛选和酶切检测证实，以重组载体pl300s-0sSWEET5为载体pCAMBIA1300s的Kpn I和Xba I位点间插入了如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，重组超量表达载体pl300s-0sSWEET5的T-DNA区结构示意图如图2所示。
[0047]实施例3:重组超量表达载体pl300s-0sSWEET5的转化
[0048]将实施例2构建好的pl300s_0sSWEET5重组载体导入农杆碱型的根癌农杆菌EHA105，构成转化菌株。农杆菌介导的遗传转化方法主要参照本 申请人:华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室发表的“农杆菌介导的遗传转化操作手册”所示的方法(林拥军等，农杆菌介导的牡丹江8号高效转基因体系的建立，作物学报，2002，28 =294-300)。具体步骤如下:
[0049](I)试剂和溶液缩写
[0050]本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下:6-BA (6-BenzyIaminoPurine, 6-苄基腺嘌呤)；CN (Carbenici 11 in,羧节青霉素)；KT (Kinetin,激动素)；NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸)；IAA(Indole-3_aceticacid, 口引哚乙酸)；2, 4-D (2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2，4_ 二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone,乙酸丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate,水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B,潮霉素)；DMS0 (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亚讽)；N6max (N6 大量兀素成分溶液)；N6mix (N6微量元素成分溶液)；MSmax (MS大量元素成分溶液)；MSmix (MS微量元素成分溶液)。
[0051](2)主要溶液配方
[0052]I) N6培养基大量元素母液(按照10 X浓缩液配制):
[0053]
硝酸狎(KNO3)28,3 g
——————钾(KlI2PO4)4.0 g
硫酸铵((NH4)2SO4)4.63 g
硫酸镁(MgSO4IH2O)1.85 g
氣化钙(CaCIrZII2O)1.66 g
[0054]将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000 ml。
[0055]2) N6培养基微量元素母液(按照100 X浓缩液配制)
[0056]
?I他钾(H)OJSg
硼酸(H3BO3)CUig
硫酸猛(MnS04-4Ib0)0.44 g
硫酸锌(ZnS04-7H20)0.15 g
[0057]将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000 ml。
[0058]3)铁盐(Fe2+EDTA)贮存液(按照10X浓缩液配制)
[0059]将3.73 g 乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA.2H20)和 2.78 g FeSO4.7H20 分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000 ml，至70°C温浴2 h，4°C保存备用。
[0060]4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)
[0061]
烟酸(Nicotinicacid)0.1 g
维生素BI (Thiamine HCl)0.1 g
维(Pyridoxine IICl)0.1 g
甘^[酸(Glvcine)0.2 g
肌醇(Inositol)10 g
[0062]加蒸馏水定容至1000 ml，4°C保存备用。
[0063]5) MS培养基大量元素母液(按照10 X浓缩液配制)
[0064]
硝酸铵(NH4NO3)16.5 g
硝酸钾(KNO3)19.0 g
[0065]馨酸二氢钾(KH2PO4)1.7g
硫酸钱(MgSO4+)3.7 g
氣化钙(CaCl2)4.4 g
[0066]将上述试剂在室温下溶解,并用蒸懼水定容至1000 ml ο
[0067]6) MS培养基微量元素母液(按照100 X浓缩液配制)
[0068]
硫酸猛 (MnSOv 411,0)2.23 g
硫酸粹(ZnSOj.7113O)0J6g
硼酸(H3BO3)0.62 g
碘化钾(KI)0.083 g
ftl酸钠(Na2MoO4H2O)0.025 g
?!酸I! (CiiSO4-SH2O)0.0025 g
--(化钴(CoCl:r6H20)0.0025g
[0069]将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000 ml ο
[0070]7)2，4_D 贮存液(I mg/ml)的配制:
[0071]称取2，4-D 100 mg，用I ml I N氢氧化钾溶解5 min，然后加10 ml蒸馏水溶解完全后定容至100 ml,于室温下保存。
[0072]8)6-BA|C存液(I mg/ml)的配制:
[0073]称取6-BA 100 mg，用I ml I N氢氧化钾溶解5 min，然后加10 ml蒸馏水溶解完全后定容至100 ml,室温保存。
[0074]9)萘乙酸(NAA)忙存液(I mg/ml)的配制:
[0075]称取NAA 100 mg，用I ml I N氢氧化钾溶解5 min，然后加10 ml蒸馏水溶解完全后定容至100 ml，4°C保存备用。
[0076]10) 口引哚乙酸(IAA)忙存液(I mg/ml)的配制:
[0077]称取IAA 100 mg，用I ml I N氢氧化钾溶解5 min，然后加10 ml蒸馏水溶解完全后定容至100 ml，4°C保存备用。
[0078]11)葡萄糖贮存液(0.5 g/ml)的配制:
[0079]称取葡萄糖125 g，然后用蒸馏水溶解定容至250 ml，灭菌后4°C保存备用。
[0080]12) AS贮存液的配制:
[0081]称取AS 0.392 g，加入DMSO 10 ml溶解，分装至1.5 ml离心管内，4°C保存备用。
[0082]13) IN氢氧化钾贮存液
[0083]称取氢氧化钾5.6 g,用蒸懼水溶解定容至100 ml,室温保存备用。
[0084](3)用于水稻遗传转化的培养基配方
[0085]I)诱导培养基
[0086]
【权利要求】
1.一个来源于水稻的0SSWEET5基因在调控叶片衰老进程中的应用，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
2.一个来源于水稻的OsSWEET5基因的编码蛋白在调控叶片衰老进程中的应用，其特征在于，所述的基因编码蛋白质的序列如序列表SEQ ID N0:2所不。
3.一个超量表达载体pl300s-0sSWEET5，其特征在于，该载体含有如权利要求1所述的基因。
4.如权利要求1所述的基因OsSWEET5的应用，其特征在于，将含有权利要求1所述基因OsSWEET5的表达载体转入水稻，以超量表达该基因从而加速叶片衰老进程。
5.一种改变目的植物叶片衰老进程的方法，其特征在于，通过提高权利要求1所述基因OsSWEET5的表达量来加速叶片衰老进程。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述的单子叶植物为水稻、玉米、小麦和草坪草。
8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述的双子叶植物为拟南芥、杨树、大豆和棉花。
【文档编号】C12N15/82GK104131013SQ201410364872
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】林拥军, 周勇 申请人:华中农业大学