专利名称：：一种动物药的仿生酶解产物及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种动物药的仿生酶解产物及其在抗病毒药物中的应用，属于中药领域。
背景技术：
：动物药作为传统中药，临床应用很广泛，在入药的方式上通常采用原药材粉碎后直接服用，或水提或醇提或水提醇沉后服用，其所采取的提取方法比较传统。现在研究表明，小分子的寡肽类物质和氨基酸是很容易被小肠吸收的，而大分子的蛋白类在小肠里很难被吸收。传统的原粉直接服用，原药粉中大分子蛋白，只有少量在体内经过胃肠道的分解，变成小分子的寡肽而被吸收，由于药材粉碎的细度、胃肠道pH的变化造成水解的不完成，有效成分被吸收利用的少，造成大量药材的浪费疗效大大降低。水提、水提醇沉的提取工艺使得有大部分不溶入水、醇的蛋白被滤过除去，造成大量的药材浪费，疗效同样大大降低。随着人们对动物药的认识深入，有人从动物药中提取的单一的蛋白制成制剂，但制成口服制剂，由于经过胃肠道，容易被胃酶、胰酶酶解掉，其活性损失；若制成注射液，由于大分子的蛋白类容易引起免疫原性，存在一定的安全隐患。应用酶解法水解动物蛋白，获得具有一定生理活性的生物活性肽是目前国内外研究的热点。由于不同的酶水解的部位不一样，得到的酶解产物也大不相同，比如胃蛋白酶主要酶解的部位为苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸组成的肽键，胰蛋白酶主要酶解的部位为精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸组成的肽键，用单一的胃蛋白酶、胰酶或其他蛋白酶来酶解，均不能使蛋白被有效的吸收利用，这样就迫切的需要一种新的酶解方法——在动物或人体生物进化过程中已被证实、疗效确切的、模拟人体的消化过程的仿生酶解方法，将动物药中有效成分更容易吸收，更加安全的利用，同时更加充分利用原药材。
发明内容本发明的第一目的在于提供一种更有效的、安全的动物药仿生酶解产物，该仿生酶解产物是动物药经过仿生酶解而得到的。第二目的是提供该仿生酶解产物在制备治疗抗HBV、HCV、HDV、HPV、HSV等病毒药物方面的应用。具体的说本发明主要涉及一种动物药仿生酶解产物，该仿生酶解产物是按以下方法制备的取动物药，加水匀桨，调节pH至1.03.0，加入胃蛋白酶于3545。C保温酶解0.54小时，调节pH至7.58.5，加入胰酶或胰蛋白酶于405(TC保温酶解28小时。3进一步优选，该提取物按以下方法制备取动物药，加水匀浆，调节pH至1.52.5，加入动物药量0.55%的胃蛋白酶于3545'C保温酶解13小时，再调节pH至7.58.5，加入动物药量0.55%的胰酶或胰蛋白酶于4050'C保温酶解36小时，即得。再优选，该酶解产物按以下方法制备取动物药，加水匀浆，调节pH至2.0，加入动物药量12%的胃蛋白酶于40'C保温酶解13小时，再调节pH至8.0,加入动物药量12%的胰酶或胰蛋白酶于5(TC保温酶解36小时，即得。发明人经过试验筛选，动物药药材加水匀浆后，可预先加热至80100°C，保温1530分钟，再放冷至酶解所需温度，按以上操作酶解，其效果更强。按本发明技术方案进行酶解，当胃蛋白酶的酶活力达到1200U/g，胰蛋白酶的酶活力达到2500U/mg，胰酶的酪蛋白转化力达到25.0时，效果较为充分；酶活力越高，酶解速度越快、效果越好。按本发明的方法操作，动物药的抗凝血、活血、抗炎、抗病毒等活性大大增强，优于以往常用的动物药原粉、水提液、醇提液及水提醇沉液。本发明中的动物药选自水蛭、地龙、土鳖虫、全蝎、蜈蚣、蜱蜕、僵蚕、斑蝥、鹿角、羚羊角、海参、蛤蚧等，其均具有抗病毒功效，并具有坚实的临床应用基础。本领域技术人员可以方便地将本发明的仿生酶解产物配合适当的药用辅料，制备成注射剂、冻干粉剂、口服制剂及外用制剂等，如a、将酶解液直接喷雾干燥，加入适量的常规辅料如淀粉、乳糖、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠等制成胶囊剂、颗粒剂、片剂等制剂。b、将酶解液加热至85'C杀酶后，滤过，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量5kD以下的溶液，可加入等渗调节剂、pH调节剂、防腐剂等制成注射液；也可加入甘露醇、乳糖等冻干制成冻干粉针剂。c、将酶解液滤过，滤液以超滤膜超滤，截留分子量10kD以下的溶液，或滤液直接加卡波姆、壳聚糖等常规药用辅料，制成凝胶剂、湿敷剂、喷雾剂等制剂。本发明提供的动物药仿生酶解产物可以单独使用，也可以与其他药物成分联合使用，艮口在药物活性成分中，可以只有该产物，还可以是其与其他药物的混合物，达到配合治疗、辅助治疗的目的。本发明中的动物药仿生酶解产物，针对其抗病毒的作用可以用于治疗各种尖锐湿疣、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、肝癌、宫颈癌、各种疱疹等疾病。有益效果为进一步验证本发明产物相对于现有技术的进步效果，发明人进行了动物药效学的对比实验，实验中的"仿生酶解组"即为按本发明技术方案制得的动物药酶解产物。试验一、抗HBV病毒作用的药效比较试验(土鳖虫)1、药品与试剂供试样品的制备未酶解组取土鳖虫药材细粉(80目)50g，加入10倍量生理盐水，匀浆30分钟，搅匀，取l/5量，微孔滤膜(0.45pm)滤过，即得；胃蛋白酶酶解组取i/5匀浆液，加入土鳖虫药材量的1%胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为4(TC土2。C，保温同时搅拌酶解4h，85。C保温20min,放冷，微孔滤膜(0.45pm)滤过，即得；胰蛋白酶酶解组取l/5匀浆液，加入土鳖虫药材量的1%胰蛋白酶，同时调节pH至8.0，温度为5(TC土2'C,保温同时搅拌酶解4h，85'C保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45pm)滤过，即得；胰酶酶解组取l/5匀浆液，加入土鳖虫药材量的1%胰酶，同时调节pH至8.0，温度为50°C±2°C，保温同时搅拌酶解4h，85'C保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45pm)滤过，即得；仿生酶解组取l/5匀浆液，加入土鳖虫药材量的1%胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为40'C士2。C,保温同时搅拌酶解4h，然后调pH至8.0，加入土鳖虫药材量的1%胰蛋白酶，温度为5(TC土2。C,保温同时搅拌酶解4h，85-C保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45jim)滤过，即得；胎牛血清；DMEM培养基(Gibco公司产品)；HBeAg检测试剂盒；朋V-DNA克隆转染的人肝癌细胞细胞株H印G厂2.2.15。2、试验方法HBV-DNA克隆转染的人肝癌细胞H印G厂2.2.15细胞培养于含10%胎牛血清及双抗(100U/mL青霉素和100ng/mL链霉素)的DMEM培养液中，于37'C、5%0)2条件下培养。取对数生长期的癌细胞，用含1(W胎牛血清的DMEM培养液稀释成5X107mL单细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100tiL,贴壁培养24h后弃去上清液，加入不同体积药物，样品用3%二甲亚砜溶解配制成lmg/mL的母液，补加DMEM培养液至终体积为200pL。每个浓度平行6孔，对照组加入等体积的DMEM培养液。吸取培养板上清液5nL，按HBeAg检测试剂盒方法检测e抗原的吸光度(A)值，按下式计算细胞增殖抑制率。细胞抑制率=(1-加药细胞的A值/对照细胞的A值)X100%3、试验结果具体试验结果见下表。5表l对HepG2-2.2.15细胞的抑制率结果表组别抑制率(％)未酶解组56.31*胃蛋白酶酶解组63.42本胰蛋白酶酶解组67.67*胰酶酶解组69.69*仿生酶解组75.37林注与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。上述试验结果表明，仿生酶解产物具有较强的抗HBV作用，与不加药物仅加等体积DMEM培养液的对照组比较，在10叫/mL的药物浓度显示出显著差异，较其他单酶酶解产物的作用强，提示本发明仿生酶解产物具有较好的抗HBV病毒作用。试验二、抗HPV病毒作用的药效比较试验(斑蝥)1、药品与试剂供试样品的制备未酶解组取斑蝥药材细粉(80目)50g，加入10倍量生理盐水，匀浆30分钟，搅匀，取l/5量，微孔滤膜(0.45pm)滤过，即得；胃蛋白酶酶解组取l/5匀浆液，加入斑蝥药材量的1%胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为40。C士2'C，保温同时搅拌酶解4h,85。C保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45pm)滤过，即得；胰蛋白酶酶解组取l/5匀浆液，加入斑蝥药材量的W胰蛋白酶，同时调节pH至8.0，温度为5(TC士2'C，保温同时搅拌酶解4h，85'C保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45pm)滤过，即得；胰酶酶解组取l/5匀浆液，加入斑蝥药材量的1°/。胰酶，同时调节pH至8.0，温度为50'C士2。C，保温同时搅拌酶解4h,85。C保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45pm)滤过，即得；仿生酶解组取l/5匀浆液，加入斑蝥药材量的1%胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为4(TC±2°C，保温同时搅拌酶解4h，然后调pH至8.0，加入斑蝥药材量的1%胰蛋白酶，温度为50°C±2°C，保温同时搅拌酶解4h，85。C保温20min，放冷，微孔滤膜(0.45fxm)滤过，即得标本采自皮肤科门诊CA患者，经荧光定量PCR鉴定为HPV6/11型，在无菌条件下，将标本剪碎，研磨匀浆制成3ng/ml的CA混悬液。FQ-PCR检测试剂盒；全自动实时荧光定量PCR仪。2、试验方法取CA混悬液100ul于lml离心管中，共5组，分别加入上述样品溶液100ul，振摇均6匀，于37"培养箱培养，分别于作用疣体l日、3日、7日，进行HPV-DNA定量扩增试验。从恒温箱中取出经药品作用的CA混悬液50y1，加入等体积DNA提取液混匀，沸水浴10min，10000r/min离心5min，取上清液2u1作为HPV-DNA扩增模板。各组分别取HPV-PCR反应管一支，分别加入处理后的样品、不同浓度的标准品(1X103、1X104、1X105、1X106、1X107)和阴阳性质控品各2ii1，6000r/min离心lmin，将各反应管放入PCR仪器的反应槽中。循环条件93'C变性2min，然后93°C5s，57'C，40s，循环40次，反应结束后，电脑软件自动记录数据并分析结果。3、试验结果具体试验结果见下表。表2对HPV病毒作用结果表(n=3)(拷贝/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>上述试验结果表明，结果<50病毒被破坏或被杀灭，其DNA扩增被抑制。结果提示本发明仿生酶解产物具有较好的抗HPV病毒作用。试验三、试验3:对102例生殖器疱疹的临床观察试验临床资料观察生殖器疱疹病例102例，男56例，女46例，年龄2350岁，平均32岁。女性不包括合并妊娠者，随机分为实验组和对照组，实验组63例，对照组39例。两组间年龄分布，男女比例，局部病变及发病时间经统计学检验无明显差异。供试样品取蜈蚣药材50g，加入10倍量生理盐水，匀浆30分钟，搅匀，加入蜈蚣药材量的W胃蛋白酶，同时调节pH至2.0，温度为4(TC土2'C，保温同时搅拌酶解4h，然后调pH至8.0，加入蜈蚣药材量的1%胰蛋白酶，温度为50'C士2'C，保温同时搅拌酶解4h，85°C保温20min，放冷，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量10kD以下的溶液，加卡波姆，润胀12小时，调PH增加粘度，混匀，制成凝胶剂。每天至少外抹5次。对照药口服阿昔洛韦片，每次0.2g，每天5次。治愈后随访4个月，査看复发率。观察结果见下表组别愈合率复发率3-7d8-14d治疗组63(100%)*02(3.17%)对照组28(71.79%)11(28.21%)6(15.38%)注p<0.05经上表可以看出，本发明仿生酶解产物具有较好的抗HSV病毒作用。具体实施方式以下通过具体的实施例进一步说明本发明，但以下实施例仅用于说明本发明而对本发明没有限制。实施例1取地龙200g，粉碎成细粉，加10倍量水匀浆，调节pH至2.0，加入地龙量的2%的胃蛋白酶于40'C保温酶解2小时，调节pH至8.0，加入地龙量的2X的胰酶于5(TC保温酶解5小时，喷雾干燥，加入适量的淀粉，制粒，干燥，整粒，填装胶囊。实施例2取全蝎500g，粉碎成细粉，力n8倍量水匀浆，调节pH至2.6，加入全蝎量的1%的胃蛋白酶于37'C保温酶解3小时，调节pH至7.5，加入全蝎量的1^的胰蛋白酶于4(TC保温酶解6小时，喷雾干燥，加入适量的微晶纤维素，制粒，干燥，整粒，压制成片。实施例3取水牛角500g，粉碎成细粉，加15倍量水匀浆，调节pH至3.0，加入水牛角量的5%的胃蛋白酶于40'C保温酶解2小时，调节pH至8.5，加入水牛角量的50/^的胰蛋白酶于45X:保温酶解5小时，加热至85'C保温15分钟，滤过，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量5kD以下的溶液，制成注射液。实施例4取土鳖虫500g，粉碎成细粉，加15倍量水匀浆，调节pH至1.5，加入土鳖虫量的0.5%的胃蛋白酶于4(TC保温酶解1小时，调节pH至8.0，加入土鳖虫量的1.5X的胰蛋白酶于50'C保温酶解3小时，加热至95'C保温30分钟，滤过，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量5kD以下的溶液，加入甘露醇，冷冻干燥，制成冻干粉针剂。实施例5取僵蚕500g，斑蝥200g，粉碎成细粉，加15倍量水匀浆，调节pH至2.5，加入药材量的48^的胃蛋白酶于4(TC保温酶解2小时，调节pH至8.5，加入药材量的5X的胰蛋白酶于45'C保温酶解6小时，加热至85'C保温15分钟，滤过，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量5kD以下的溶液，制成喷雾剂。实施例6取蝉蜕500g，粉碎成细粉，加10倍量水匀浆，调节pH至2.0，加入蛑蜕量的2%的胃蛋白酶于40'C保温酶解2.5小时，调节pH至8.0，加入蝉蜕量的2X的胰酶于5(TC保温酶解5小时，喷雾干燥，加入适量的淀粉，制粒，干燥，整粒，填装胶囊。实施例7取全蝎500g，粉碎成细粉，加12倍量水匀浆，调节pH至2.5，加入全蝎量的2.5%的胃蛋白酶于39t:保温酶解2.5小时，调节pH至8.0，加入全蝎量的3^的胰蛋白酶于4(TC保温酶解6小时，喷雾干燥，'加入适量的微晶纤维素，制粒，干燥，整粒，压制成片。实施例8取斑蝥500g，粉碎成细粉，加15倍量水匀浆，调节pH至2.0，加入斑蝥量的2.5%的胃蛋白酶于40'C保温酶解3小时，调节pH至8.5，加入斑蝥量的2.5^的胰酶于5(TC保温酶解6小时，喷雾干燥，加入适量的糖粉和糊精，制粒，干燥，整粒，制成颗粒剂。实施例9取全蝎250g、蜈蚣100g，加15倍量水匀浆，调节pH至2.0，加入总药量的1%的胃蛋白酶于4(TC保温酶解2小时，调节pH至8.0，加入总药量的1X的胰酶于5(TC保温酶解4小时，加热至85'C保温15分钟，滤过，滤液以超滤膜超滤，分取截留分子量10kD以下的溶液，加卡波姆，润胀12小时，调PH增加粘度，混匀，制成凝胶剂。实施例10取实施例9所制得凝胶剂治疗生殖器疱疹73例。结果73例患者中，痊愈62(84.93%)，显效8例(10.96%)，有效1例(1.37%)，无效2例(2.74%),总有效率97.26%。实施例11取实施例5所制得喷雾剂治疗尖锐湿疣89例。结果89例患者中，痊愈74(83.15%),显效7例(7.87%)，有效5例(5.62%),无效3例(3.37%)，总有效率96.63%。实施例12取实施例1所制得胶囊剂治疗宫颈癌21例。结果21例患者中，痊愈16(76.19%)，显效3例(14.29%)，有效1例(4.76%)，无效1例(4.76%)，总有效率95.24%。9权利要求1、一种动物药的仿生酶解产物，其特征在于该产物是按以下方法制备的取动物药，加水匀浆，调节pH至1.0～3.0，加入胃蛋白酶于35～45℃保温酶解0.5～4小时，再调节pH至7.5～8.5，加入胰酶或胰蛋白酶于40～50℃保温酶解2～8小时，即得。2、根据权利要求1所述的动物药仿生酶解产物，其特征在于该产物是按以下方法制备的取动物药，加水匀桨，调节pH至1.52.5,加入动物药量0.5%5%的胃蛋白酶于3545°。保温酶解13小时，再调节pH至7.58.5，加入动物药量0.5%5%的胰酶或胰蛋白酶于4050。C保温酶解36小时，即得。3、根据权利要求2所述的动物药仿生酶解产物，其特征在于该产物是按以下方法制备的取动物药，加水匀浆，调节pH至2.0，加入动物药量1%2%的胃蛋白酶于40°(:保温酶解13小时，再调节pH至8.0，加入动物药量1%2%的胰酶或胰蛋白酶于501:保温酶解36小时，即得。4、根据权利要求1至3中任一所述的动物药仿生酶解产物，其特征在于将动物药加水匀浆后先加热至8010(TC并保温1530分钟后，再放冷至所需温度进行酶解。5、根据权利要求1至3中任一所述的动物药仿生酶解产物，其特征在于所用的胃蛋白酶的酶活力不低于1200U/g,胰蛋白酶的酶活力不低于2500U/mg，胰酶的酪蛋白转化力不低于25.0。6、根据权利要求1至5中任一所述的动物药仿生酶解产物，其特征在于所述的动物药为水蛭、地龙、土鳖虫、全蝎、蜈蚣、蝉蜕、僵蚕、斑蝥、水牛角、鹿角、海参、蛤阶中的至少一种。7、根据权利要求1至6中任一所述的动物药仿生酶解产物，其特征在于被加入常规药用辅料制成注射剂、冻干粉剂、口服制剂及外用制剂。8、权利要求1至6中任一所述的动物药仿生酶解产物在制备用于治疗抗HPV病毒药物中的应用。9、权利要求1至6中任一所述的动物药仿生酶解产物在制备用于治疗抗HBV、HCV、HDV病毒药物中的应用。10、权利要求1至6中任一所述的动物药仿生酶解产物在制备用于治疗抗HSV病毒药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种动物药的仿生酶解产物及其在抗病毒药物中的应用，属于中药领域。其技术方案是采用仿生酶解的方法，取动物药，加水匀浆后，在适当的条件下，先以胃蛋白酶保温酶解，再以胰酶或胰蛋白酶保温酶解。所得的仿生酶解物产物较目前现有技术的产物具有更强的生物活性，在抗病毒方面具有较好的治疗效果。文档编号A61K35/32GK101647813SQ20081011814公开日2010年2月17日申请日期2008年8月13日优先权日2008年8月13日发明者张加余,李钦青申请人:北京凯瑞创新医药科技有限公司