专利名称：农杆菌介导的侵染月季芽点转基因的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程中对植物进行转基因的方法，特别是涉及一种农杆菌介导的侵染月季芽点转基因的方法。
背景技术：
将外源基因或者经过修饰后的内源基因转入植物体内以改变植物某一特性，是改善作物品质的重要途径。自1983年首次培育出世界第一个转基因植物一转基因烟草以来，科学家试图不同的转基因方法，将外源基因或经体外修饰后的内源基因导入植物，改良植物的性状，并探索出了多种植物转基因方法。基因导入植物的方法主要有两大类:根癌农杆菌介导的遗传转化和DNA直接导入的转化法，后者主要包括基因枪法、花粉管通道法、子房注射法、PEG法、电 击法、阳离子转化法、超声波介导法等。目前绝大部分的转基因木本植物都是通过农杆菌侵染来进行的，也有一些植物用基因枪法，还可以通过电击法和PEG[1_3]法用原生质体进行转化。从目前的研究来看，农杆菌介导的木本植物转基因技术更加成熟有效，还没有一个更好的直接转化的方法可以代替它。在进行农杆菌介导的转基因试验时，要根据植物种类来挑选不同的农杆菌，环境因子如温度、PH值也会对转化效率产生影响[4]。采用一些特殊处理也会影响转化效率，Yu等发现将桔子的上胚轴径向切开，可以显著提高转化效率[5]。从细胞全能性的理论出发，所有外植体均可以作为受体进行转基因试验。目前应用较多的外植体有叶片、叶柄、上胚轴、下胚轴、子叶、胚、胚性愈伤组织、体细胞胚、原生质体等材料。Pythoud等在1987详细研究了根癌农杆菌对针叶树细胞的侵染过程，发现虽然被侵染部位不一定被诱导出明显的肿瘤，但Ti质粒上的部分DNA片断是可以转移到针叶树细胞中去[6]。Pena等在2001年将LFY和APl基因导入到枳橙中，缩短了植株的童期，促使植株提前开花，且这些性状在后代中也得到了稳定的表达。Costa等在2002年成功将几种与类胡萝卜素合成有关的基因转入到柚子中，提高了转基因植株胡萝卜素的表达水平。2005年叶霞等获得了转铁结合蛋白(Ferritin)基因的苹果，该基因已经在植株叶片中得至IJ表达m。对柑橘的研究表明，相同条件下，未成熟外植体的转化效率要比成熟外植体的转化效率高。但如果选用未成熟的外植体，还需要等待相当长的时间才能开花结果，因此选用合适的外植体，提高成年外植体的转化效率或者缩短外植体的童期都是比较可行的方法。距今为止，有关月季转基因的报道还很少，目前只有日本学者在2007年利用月季茎尖分生组织为外植体通过农杆菌介导的植物转基因方法通过筛选成功的获得了开蓝色花的月季转基因植株M，但是并没有详细介绍其转基因的过程。由以上报道不难看出，木本植物尤其是月季转基因的完善的体系还没有完全建立，本专利所发明的这种月季茎尖生长点转基因方法克服了以前方法周期长、操作复杂、成本高的缺陷，优化了木本植物转基因过程，简化了木本植物转基因的操作，并探索出了木本植物基因高转化率的新途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的侵染月季芽点转基因的方法。将月季的枝条冲洗干净，经过消毒处理后剪成2 4cm的茎段，随后在超净台中将茎段形态学的下端插入MS固体培养基上。待茎段上长出芽点时，将其从茎段上切下，用刀片将芽点划伤，然后将其浸入农杆菌侵染液中，通过抽真空处理后，将浸染过农杆菌侵染液的芽点接种在MS固体培养基上进行共培养，共培养后再经过筛选得到转基因阳性植株，经过生根后将其移栽至温室，本发明避免了通过单细胞和愈伤组织的植株再生的繁杂过程，缩短了木本植物的童期，简便快捷，转化的后代可直接成株，克服了现有技术中工作量大、耗时长的植物组织培养过程。木本植物芽点转基因技术体系构建时间较现有技术显著缩短，转化效率也较高，不受季节影响，可应用于各种常见的木本植物，因此对木本植物遗传育种具有重大意义。本发明提供的一种农杆菌介导的侵染月季芽点转基因的方法包括如下步骤:
获得木本植物芽点转基因所需无菌茎段；将茎段接种至MS固体培养基使其长出芽点；
将芽点从茎段上切下，并将其划伤；制备用于木本植物芽点转基因的农杆菌侵染液B ;真空条件下用侵染液B侵染受伤的芽点；然后将侵染过根癌农杆菌侵染液B的芽点及根癌农杆菌共培养；将共培过的芽点接种在筛选培养基C上进行筛选培养；经过筛选后的生根苗移栽至温室中；对经过木本植物芽点转基因的木本植物植株做分子检测；具体步骤:
I)外植体茎段的制备:将月季的茎杆或枝条的叶子去除掉，先用自来水冲洗1(Γ30分钟，用剪刀将其剪成2飞cm的茎段，接着用75%的乙醇溶液浸泡30秒进行表面消毒，用无菌水冲洗2 4次，再用2% (m/v)的次氯酸钠浸泡8 10分钟，然后用无菌水冲洗4次以上后所得的无菌茎段。2)外植体茎段的培养:将无菌月季的茎段接种至经过高温高压灭菌的MS固体培养基中，使其长出芽点。使其长出 芽点是指在无菌操作的条件下将无菌的月季茎段形态学的下端插入经过高温高压灭菌的MS固体培养基中，使茎段直立在培养基中，将其密封好，放在组培室中培养7天左右，待茎段上长出长度为0.5cm左右的幼芽。3)外植体芽点的获得:在无菌操作的条件下将长有幼芽的月季茎段从MS固体培养基中取出放在无菌滤纸上，用无菌的刀片将芽点从茎段上切下或剥落，然后用无菌刀片或无菌的7号针头将月季幼芽的生长点划伤或刺伤。4)侵染液B的制备:挑取携带有质粒pCambia2300的根癌农杆菌EHA105单菌落接种于50ml卡那霉素浓度为100mg/L的LB液体培养基中，水浴摇床28摄氏度、150转/分钟，12^16小时，培养至根癌农杆菌菌液0D_=0.6^0.8时，取出后在离心机上以4000转/分钟的转速离心10分钟后将上清倒掉，然后加入与上清液等体积的MS液体培养基后将农杆菌充分悬浮后所得的悬浊液。5)外植体芽点与农杆菌共培养和转化:将划伤或刺伤的月季的幼芽浸泡在浸染液c中，保持无菌的情况下放入真空泵，打开真空泵处理20-30分钟；将浸染过的幼芽先用无菌的MS液体培养基冲洗一次，放在无菌滤纸上晾干后接种在MS固体培养基上在25-30摄氏度、黑暗条件下培养3-7天。6)抗性芽的筛选:将经过共培养的芽点在无菌条件下从MS固体培养基上转移至含有100mg/L的硫酸卡那霉素的MS固体培养基上，每隔20天更换一次含硫酸卡那霉素的MS固体培养基，直至未转基因的幼芽全部死掉。7)抗性植株的驯化与筛选:将经筛选培养基培养后仍存活的植株移植至新的MS固体培养基上培养2-3周至生根后将其从培养基中取出，用自来水将根部培养基冲洗干净后移栽至花盆的栽培基质(蛭石:珍珠岩:营养土 = 4:1:1)中，经过一周的驯化，其光照强度4500 Lx, 250C，光周期为昼/夜=12h/12h，空气湿度80%，后放入温室中，以后每周浇水2 3次。8)转基因植株的分子生物学鉴定:对所得月季植株进行基因组PCR检测，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析验证。所述的单菌落为通过平板划线的方法在含有100mg/L硫酸卡那霉素的LB固体培养基上分离出来的生长最快的菌落。所述的含100mg/L的LB液体培养基组成为:10g/L胰蛋白胨(Tryptone) +5g/L酵母提取物(Yeast extract) +10g/L氯化钠(NaCl) +pH5.4 (高压灭菌处理冷却至50摄氏度后)+ 100mg/L 硫酸卡那霉素(Kanamycin Sulfate)。所述的含100mg/L的LB固体培养基是指:10g/L胰蛋白胨(Tryptone) +5g/L酵母提取物(Yeast extract) +10g/L氯化钠(NaCl) +15g/L琼脂+ρΗ5.4 (高压灭菌处理冷却至50摄氏度后)+ 100mg/L硫酸卡那霉素(Kanamycin Sulfate)。本发明提供的一种农杆菌介导的侵染月季芽点转基因的方法，避免了组织培养和植株再生的繁杂过程，简便快捷，转化的后代可直接成株，省掉现有技术中工作量大、耗时长的植物组织培养阶段。生产周期短，操作简单，便于管理和控制，且转化率高(4%左右)，成活率也高，是一种低成本、具有较大推广价值的转基因方法。
图1质粒pCambia2300不意图。图2为用木本植物月季芽点转基因的方法转入JicA#基因后植物基因组PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果(500bp左右)。图中M:markerIII ; P:正对照；WT:负对照1- 13为木本植物芽点转基因处理后转基因月季基因组PCR琼脂糖凝胶电泳结果图，图中490bp处条带为检测到的目的基因条带；1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13是木本植物芽点转基因月季基因组PCR阳性植株。
具体实施方式
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本发明参照实施例详细说明如下:
本发所述的的质粒pCambia2300(商业化购买)为图2所示，其上的T- DNA区含有新霉素磷酸转移酶基因糖II,为载体本身携带),Atchyb基因为本实验室连接上去的目的片段，其序列网上已公布。所述的根癌农杆菌为EHA105 (为本实验室保藏菌株，其特征在互连网上已经公布)。实施例1
I)用于月季芽点转基因的方法根癌农杆菌EHA105菌液的获得:载体pCambia2300-Atchyb的构建及转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞过程如下:以基因(网上已公布其序列号)为模板，上下游引物两端分别引入BamH I和Pst I酶切位点进行PCR扩增。然后，PCR产物与pCambia2300质粒分别BamH I和Pst I双酶切，将二者酶切产物连接:16°c，连接16h。连接产物转化raWi Competent Cell (购买于天根生化科技有限公司Cat#CB104，Lot#J8713)，涂布于含卡那霉素的LB平板。以目的基因为模板进行PCR得到490bp产物，用BamH I和Pst I酶切鉴定得到1209bp目的条带，最后测序验证结果表明载体构建正确。然后将构建好的质粒载体通过电激转化的方法转入根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，设置电击转化参数为25 yF,400 olm, 1500 V, 5 ms。1将携带质粒pCambia2300_Atchyb (如图2所示)土壤根癌农杆菌EHA105复壮，挑取_80°C保存的菌种，取少许冰冻的菌块接种于IOml含硫酸卡那霉素100mg/L的培养基a 上，28°C，150r/min，水浴摇床遥至菌液 OD6tltl=0.6 1.0。培养基a:10g/L胰蛋白胨(Tryptone) +5g/L酵母提取物(Yeast extract) +IOg/L 氯化钠(NaCl) + 100mg/L 硫酸卡那霉素(Kanamycin Sulfate) + ρΗ5.4。I平板划线分离生长状态优良的ΕΗΑ105菌株
用接种环蘸取培养好的菌液在含有相应抗生素的培养基b上接种，放入28°C恒温培养箱，黑暗条件下培养三天后观察菌落生长情况。培养基b: 10g/L 胰蛋白胨(Tryptone) +5g/L 酵母提取物(Yeast extract)+10g/L 氯化钠(NaCl)+15g/L 琼脂(agar)+ 100mg/L 硫酸卡那霉素(Kanamycin Sulfate)+pH5.4。'T挑取最大且边缘光滑的一个农杆菌EHA105菌落接种在装有50ml的培养基B的玻璃三角瓶中，放在28°C、150转/分钟的水浴摇床培养12 16小时，待菌液达到最适浸染浓度OD6qq=0.6^0.8时取出备用。2)获得月季芽点转基因的所需的无菌茎段
将月季的茎杆或枝条的叶子去除掉，先用自来水冲洗15分钟左右，用剪刀将其建成2飞cm的茎段，接着用75%的乙醇溶液浸泡30秒进行表面消毒，用无菌水冲洗2 4次，再用2% (m/v)的次氯酸钠浸泡8 10分钟，然后用无菌水冲洗4次以上后的茎段。3)将茎段接种至固体MS培养基上使其长出芽点；
在无菌操作的条件下将无菌的月季茎段形态学的下端插入经过高温高压灭菌的固体MS培养基中，使茎段直立在培养基中，将其密封好，放在组培室中培养7天左右，待茎段上长出长度为0.5cm左右的幼芽。4)将芽点从茎段上切下，并将其划伤
在无菌操作的条件下将长有幼芽的茎段从培养基中取出放在无菌滤纸上，用无菌的刀片将芽点从茎段上切下或剥落，然后用无菌刀片或无菌的7号针头将幼芽的生长点划伤或刺伤，使其易于农杆菌易于附着并侵染月季幼芽的生长点。5)制备用于木本植物芽点转基因的农杆菌侵染液c
取50m步骤I)所得的农杆菌EHA105的菌液倒入经高温高压灭菌的离心管中，在离心机上以4000转/分钟的转速离心10分钟后将上清倒掉，在无菌条件下加入与上清液等体积的MS液体培养基后将农杆菌充分悬浮，然后将所得的农杆菌悬浊液倒入无菌的IOOml的广口玻璃瓶备用。6)真空条件下用侵染液c浸染受伤的芽点
将用无菌刀片划伤或用无菌针头刺伤的月季的幼芽浸泡在侵染液c中，保持无菌的情况下放入真空泵，打开真空泵处理30分钟左右。7)浸染过根癌农杆菌浸染液c的芽点与根癌农杆菌共培养
在无菌条件下将浸染过的幼芽先用无菌的MS液体培养基冲洗一次，放在无菌滤纸上晾干后接种在MS固体培养基上在28摄氏度、黑暗条件下培养3天。8)芽点转基因月季植株的抗生素筛选
将经过共培养的芽点在无菌条件下从MS固体培养基上转移至含有100mg/L的硫酸卡那霉素的MS固体培养基上，每隔20天左右更换一次MS固体培养基，直至未转基因的幼芽全部死掉。7)移栽:将经筛选培养基培养后仍存活的植株移植至新的MS固体培养基上培养数周至生根后将其从培养基中取出，用自来水将根部培养基冲洗干净后移栽至花盆的栽培基质(蛭石:珍珠岩:营养土 = 4:1:1)中，经过一周的驯化(光照强度4500 Lx，25°C，光周期为昼/夜=12h/12h，空气湿度80%左右)后放入温室中，以后每周浇水2 3次。8)对经木本植物芽点转基因方法所得月季植株做分子检测
对经木本植物芽点转基因方法所得月季植株进行基因组PCR检测，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，过程如下:
一、CTAB法提取转基因月季植株叶片基因组
I取IOOmg新鲜月季叶片，剪成小块置于研钵中，用液氮磨至粉末状，转入1.5 ml离心管中。
f加入2% CTAB提取液600 μ I,混匀。'I在65 °C水浴中温浴I h。I冷却到室温后，加入600 μ I的氯仿-异戊醇，充分振荡混匀。'ο 离心:室温，12000 r/min, 10 min。I取上清，重复步骤3，再次抽提。:Γ取上清，加等体积异丙醇或无水乙醇，室温沉淀10-30 min,室温,12000 r/min,离心10 min。-1弃上清，用75%乙醇洗两次。I烘干沉淀，溶于50-100 μ IddH2O中备用。二、转基因月季植株叶片基因组PCR 以月季叶片基因组为模板进行PCR扩增 Atchyb基因引物:
Atchyb基因上游引物为SEQ ID N0.2所示的序列-Atchyb基因下游引物为SEQ IDN0.3所示的序列。PCR 反应体系(25 μ L):
组分名称加入体积
IOXBuffer2.5 μ L
dNTP (2.5 mM)2 μ L
引物(Forward) 10 μ MIuL引物(Reverse) 10 μ MI μ L
植物基因组溶液I μ L
Taq Polymerase(5 U/μ L)0.25 μ L
ddH2017.25 μ L
PCR程序:
预变性94°C4 min
变性9 4°C30 s
退火58 °C30 s
延伸72 °CImin
循环重复步骤2-430次
总延伸72 °C8 min
保持4°CIh
取5 UL PCR产物进行凝胶电泳验证。琼脂糖浓度0.7%
电压120V
电泳时间30min
三、原位转基因月季植株叶片基因组PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证电泳结束后取出胶片，在凝胶成像系统中查看结果，并拍下照片，结果在490bp大小处出现特异的目的片段，可初步认为用原位转基因法将目的基因成功转入月季中(结果如图2所示)。
权利要求
1.一种农杆菌介导的侵染木本植物芽点转基因的方法，其特征在包括如下步骤:获得木本植物芽点转基因所需无菌茎段；将茎段接种至培养基A使其长出芽点；将芽点从茎段上切下，并将其划伤；制备用于木本植物芽点转基因的农杆菌侵染液B ;真空条件下用侵染液B侵染受伤的芽点；然后将侵染过根癌农杆菌侵染液B的芽点及根癌农杆菌共培养；将共培过的芽点接种在筛选培养基C上进行筛选培养；经过筛选后的生根苗移栽至温室中；对原位转基因月季植株做分子检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的获得木本植物芽点转基因所需无菌茎段是指将木本植物的茎杆或枝条将叶子去除掉，先用自来水冲洗1(Γ30分钟，用剪刀将其建成2飞cm的茎段，接着用75%的乙醇溶液浸泡30秒进行表面消毒，用无菌水冲洗2 4次，再用2% (m/v)的次氯酸钠浸泡8 10分钟，然后用无菌水冲洗4次以上后的茎段。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的将茎段接种至培养基使其长出芽点的培养基是指经过高温高压灭菌的MS固体培养基，其基本成分是MS+7g/L琼脂。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的将茎段接种至培养基使其长出芽点是指在无菌操作的条件下将无菌的茎段形态学的下端插入经过高温高压灭菌的固体MS培养基中，是茎段直立在培养基中，将其密封好，放在组培室中培养7天左右，待茎段上长出长度为0.5cm左右的幼芽。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的将芽点从茎段上切下，并将其划伤是指在无菌操作的条件下将长有幼芽的茎段从培养基中取出放在无菌滤纸上，用无菌的刀片将芽点从茎段上切下或剥落，然后用无菌刀片或无菌的7号针头将幼芽的生长点划伤或刺伤。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的制备用于木本植物芽点转基因的农杆菌侵染液B是指挑取携带有质粒pCambia2300的根癌农杆菌EHA105单菌落接种于50ml含100mg/L卡那霉素的LB培养基中，水浴摇床28摄氏度、150转/分钟，12 16小时，培养至根癌农杆菌菌液OD6tltl=0.6^0.8时，取出后在离心机上以4000转/分钟的转速离心10分钟后将上清倒掉，然后加入与上清液等体积的MS液体培养基后将农杆菌充分悬浮后所得的悬浊液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的真空条件下用浸染液B浸染受伤的芽点是指将用无菌刀片划伤或用无菌针头刺伤的木本植物的幼芽浸泡在浸染液B中，保持无菌的情况下放入真空泵，打开真空泵处理30分钟左右。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的将浸染过根癌农杆菌浸染液B的芽点及根癌农杆菌共培养是指在无菌条件下将浸染过幼芽先用无菌的MS液体培养基冲洗一次，放在无菌滤纸上晾干后接种在含有MS固体培养基上在28摄氏度、黑暗条件下培养3 7天。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的将共培过的芽点接种在筛选培养基C上是指将经过共培养的芽点在无菌条件下从MS固体培养基上转移至含有100mg/L的硫酸卡那霉素的MS固体培养基上，每隔20天做更换一次培养基。
10.一种农杆菌介导的侵染月季芽点转基因的方法，其特征在于它包括的步骤: I)获得月季芽点转基因的所需的无菌茎段:将月季的茎段的叶子先剪掉，然后通过自来水冲洗后剪成2 5cm的茎段，并进行75%酒精表面消毒、2%次氯酸钠灭菌后备用；2)将茎段接种至固体MS培养基上使其长出芽点:在无菌操作的条件下将I)中所得无菌茎段形态学的下端插入经过高温高压灭菌的固体MS培养基中，使茎段直立在培养基中，将其密封好，放在组培室中培养7天左右，待茎段上长出长度为0.5cm左右的幼芽； 3)将芽点从茎段上切下，并将其划伤:在无菌操作的条件下将长有幼芽的茎段从培养基中取出，用无菌的刀片将芽点从茎段上切下或剥落，然后用无菌刀片或无菌的7号针头将幼芽的生长点划伤或刺伤； 4)制备用于月季芽点转基因的农杆菌侵染液 5)真空条件下用浸染液浸染受伤的芽点:将用无菌刀片划伤或用无菌针头刺伤的月季的幼芽浸泡在浸染液中，保持无菌的情况下放入真空泵，打开真空泵处理30分钟左右； 6)将浸染过根癌农杆菌浸染液的芽点和根癌农杆菌共培养3 7天； 7)对芽点转基因月季植株进行抗生素筛选 8)移栽经筛选后仍能存活的转基因植株 9)对经月季芽点转基因方法所得月季植株做分子检测 对经月季芽点转基因方法所得月季植株进行基因组PCR检测，Atchyb基因PCR引物为: 上弓丨 5 -3 tcaaccgccg ttacattc 下弓丨 5 -3 cgagaccatc gtggacaa 并对PCR产物进行 琼脂糖凝胶电泳分析抗性植株的转基因成功与否。
全文摘要
本发明涉及一种农杆菌介导的侵染月季芽点转基因的方法。首先获得月季芽点转基因所需无菌茎段；将茎段接种至固体培养基使其长出芽点；将芽点从茎段上切下，并将其划伤；制备用于月季芽点转基因的农杆菌侵染液；真空条件下用侵染液侵染受伤的芽点；然后将侵染过根癌农杆菌侵染液的芽点及根癌农杆菌共培养；将共培过的芽点接种在筛选培养基上进行筛选培养；经过筛选后的生根苗移栽至温室中；对月季芽点转基因的月季植株做分子检测。本发明的方法对月季的芽点进行转基因，通过对被转基因的幼芽行筛选转基因植株和分子检测进一步验证PCR阳性植株，方法简单高效，转化率可达4%，对木本植物基因工程和遗传育种具有重大意义。
文档编号C12N15/84GK103146748SQ20131005773
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月25日 优先权日2012年4月13日
发明者季静, 王罡, 武卫党, 张迅强 申请人:天津大学