专利名称：一种动员间充质干细胞的制剂及分离方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，主要涉及一种动员间充质干细胞的制剂及分离方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是具有强大的增殖能力和多向分化潜能的成体干细胞。由于在一定条件下可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、神经等组织，MSCs已成为组织工程与再生医学十分有潜力的种子细胞。MSCs临床应用前景广阔:治疗骨、关节、肌腱缺损与损伤；促进神经细胞、心肌细胞、肝细胞再生；支持造血，促进造血干细胞植入；预防及治疗造血干细胞移植后移植物抗宿主病(GVHD);免疫调节治疗自身免疫紊乱性疾病等。骨髓为MSCs最为丰富的来源，在目前的临床试验与应用中，从供者或自身抽取一定量骨髓、体外分离培养为获取MSCs的主要途径。此方法可行易掌握，但也存在一些缺点:细胞来源受限、培养步骤繁琐、扩增到所需细胞量需要时间较长、培养液添加物非人源化、污染问题、致瘤风险等。MSCs体内动员方法的建立可以避免体外培养后移植治疗的诸多缺点，为MSCs的临床应用开辟新途径。动员(Mobili zation)是指干细胞由原组织位点进入外周循环的过程。干细胞动员是十分有潜力的疾病治疗方法，如造血干细胞动员目前已广泛应用于临床。间充质干细胞动员指应用动员剂或采用动员措施促使骨髓中MSCs释放并迁移到外周血。有效的MSCs动员可以避免体外培养后输注治疗存在的细胞污染、培养时间过长容易错过最佳治疗时间窗等缺点。MSCs体内动员具有体外培养后移植无法比拟的低创和高效性，因此对MSCs体内动员方法的研究十分有意义。许多研究者也曾尝试采用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员MSCs，但结果令人失望。目前尚缺乏有效而临床可行的MSCs动员剂。在前期研究中，我们首创性地发现缺氧诱导因子I a (HIF-1 α )是间充质干细胞动员中的关键因子(Stem Cells Dev.2011 20 (11): 1961-71)。我们建立了缺氧诱导大鼠MSCs动员的动物模型，通过检测缺氧诱导MSCs动员的动力学，我们发现短期缺氧即可动员大鼠MSCs，经过鉴定动员进入外周血MSCs的免疫表型及成骨、成脂、成软骨能力与骨髓来源MSCs基本相似。在进一步的机制研究中，我们证实了 HIF-1a在缺氧诱导MSCs动员中起枢纽作用，而 HIF-1 a下游通路基质细胞衍生因子-1 a (SDF-1 a )及其受体CXCR4参与MSCs动员。HIF-1是一个包含有HIF-1 a与HIF-1 β两个亚基的异源二聚体。HIF-1 β是许多转录因子所共有的亚基，在细胞内呈构成性表达。HIF-1a则为HIF-1的调节亚基与活性亚基。HIF-1的生理活性主要取决于HIF-1 a亚基的活性和表达。HIF-1a表达量增加的调节主要在蛋白翻译后水平，即通过增加蛋白的稳定性，抑制其降解来实现。细胞处于常氧状态时，在脯氨酰轻化酶(prolyl hydroxylase, PHD)的作用下，HIF-1 α分子中402位和564位的脯氨酸残基被羟化。被羟化的HIF-1a可与肿瘤抑制蛋白von HippelLindau (VHL)结合，后者可被识别发生泛素化降解。在该降解途径中，PHD是起关键作用的酶。PHD属于Fe2+、2_酮戊二酸依赖的双加氧酶超家族，是HIF-1 α降解反应的限速酶。PHD抑制剂可以稳定HIF-1 α的表达。研究发现，铁螯合剂氯化钴(CoCl2)可以抑制PHD的活性，而抑制HIF-1 α的羟化，减少常氧状态下HIF-1 α的降解，被称为“缺氧模拟剂”。SDF-1/ CXCR4轴在干细胞体内动员中起着重要的作用。基质细胞衍生因子(SDF-1)是由骨髓基质细胞产生的CXC型趋化因子，CXC族细胞因子受体4 (CXCR4)是目前所知的SDF-1的唯一受体。研究证实，SDF-1在内皮细胞受转录因子HIF-1直接调控。AMD3100为SDF-1 a /CXCR4轴的小分子拮抗剂，能够有效阻断SDF-1 α与CXCR4的相互作用而对CXCR4没有激动作用。虽然根据文献报道和我们前期研究结果可知HIF-l/SDF-1 a -CXCR4轴在MSCs动员中起关键作用，但是目前尚缺少一种有效的MSCs动员制剂，仍缺乏可行的MSCs动员方法。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明人首次发现缺氧模拟剂氯化钴(CoCl2)可以诱导大鼠MSCs动员至外周血，而CoCl2联合CXCR4的抑制剂AMD3100可显著提高动员效率。本发明提供了一种动员间充质干细胞的制剂及分离方法。一种用于间充质干细胞动员的制剂，包括CoCl2。所述的CoCl2为缺 氧模拟剂，剂量范围5_20mg/kg。所述的CoCl2与八1 3100联合使用。所述的 AMD3100 剂量为 5 mg/kg。一种利用所述的制剂分离间充质干细胞的方法，利用所述的制剂促使间充质干细胞动员进入外周血然后进行分离。所述的分离步骤如下:采取外周血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含有20%胎牛血清的DMEM培养基重悬，接种至培养瓶，培养7天后换液，第10天得到外周血间充质干细胞。所述的外周血间充质干细胞高表达⑶90、⑶29、⑶44，不表达⑶45、⑶34 ;具有体外成骨、成脂、成软骨分化能力。本发明的有益效果:具有较高的MSCs动员效率，为组织工程与再生医学等提供了一种有效的制剂和方法。
图1为氯化钴(CoCl2)诱导大鼠MSCs动员至外周血，而CoCl2联合CXCR4的抑制剂AMD3100可显著提高动员效率。图1 A:各处理组大鼠外周血CFU-F数。图中，CFU-F:成纤细胞样集落。NS组:生理盐水处理组。CoCl2组:CoC12 10mg/kg/dX 7d处理组。AMD:AMD3100处理组即第f 7天给予相应体积生理盐水，第8天给予AMD31005mg/kg。AMD+ CoCl2:AMD3100 联合 CoCl2 组，先给予 CoC12 10mg/kg/dX 7d，第 8 天腹腔注射 AMD3100 5mg/kg。* 表示与 NS 组相比，Ρ〈0.05。** 表示与 AMD3100 组相比，Ρ〈0.05。#表示CoCl2组相比，Ρ〈0.05。图1B:各处理组大鼠外周血⑶45TD90+细胞的比例示意图。
图中，NS组:生理盐水处理组。CoCl2组:CoCl2 10mg/kg/dX7d处理组。AMD:AMD3100处理组即第1~7天给予相应体积生理盐水，第8天给予AMD3100 5mg/kg。AMD+CoCl2:AMD3100 联合 CoCl2组，先给予 CoCl2 10mg/kg/dX 7d，第 8 天腹腔注射 AMD3100 5mg/
kg 图2为动员外周血来源MSCs的免疫表型。图中，动员外周血来源MSCs高表达CD90、CD29、CD44，而不表达CD45、CD34。图3为动员外周血来源MSCs可以向成骨、成脂、成软骨分化。图3A =PB-MSCs成骨诱导分化第14天光镜照片(100X )。图3B =PB-MSCs成骨诱导分化第14天Von Konssa染色结果图(100 X )。图3C =PB-MSCs成脂诱导分化第21天光镜照片(200X )。图3D =PB-MSCs成脂诱导分化第21天油红O染色结果示意图(200X )。图3E =PB-MSCs成软骨诱导分化第21天光镜照片。图3F =PB-MSCs成软骨诱导分化第21天甲苯胺蓝染色染色结果。(400X )。
具体实施例方式以下结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。具体MSCs动员技术方法如下: 1.将CoC12粉剂(购于国药集团化学制药有限公司)用生理盐水配成浓度为4mg/ml
的溶液，AMD3100 (购于Sigma公司)用生理盐水配成lmg/ml的溶液。以大鼠为实验对象，CoCl2动员组:每天给予大鼠腹腔注射CoCl2溶液10mg/kg ；CoCl2联合AMD3100动员组:先给予CoCl2 10mg/kg/dX7d,第8天腹腔注射AMD3100 5mg/kg ;设立相应对照组。2.采集各组大鼠外周血，采用成纤维样细胞集落形成培养法(CFU-F法)与流式细胞术检测两种方法检测各组外周血MSCs的数量，证实CoCl2及CoCl2联合AMD3100对MSCs的动员作用。3.将动员出的外周血成纤维样集落进行传代培养，通过流式细胞术检测其表面标记⑶44、⑶29、⑶90、⑶34、⑶45的表达，鉴定免疫表型。4.将动员出的外周血成纤维样集落进行传代培养，进行成脂、成骨、成软骨诱导分化，鉴定动员外周血来源MSCs的多向分化能力。实施例1 1.试剂配制
(I)CoCl2:称取400mg CoCl2粉剂，加IOml生理盐水，配成40mg/ml的储存液，0.22 μ m滤器过滤后分装，_20°C保存。动物给药时将储存液用生理盐水稀释10倍将浓度调至4mg/ml ο(2)AMD3100:5g粉剂加5ml生理盐水，配成lmg/ml的溶液，0.22μπι滤器过滤分装，-20°C保存。生理盐水稀释4倍至1.25mg/ml用于小鼠给药。2.动物分组
Cl)为检测CoCl2及CoCl2联合AMD3100对MSCs的动员作用，将大鼠分为4组，每组5只，分别为:①生理盐水组即NS组:每天给予大鼠腹腔注射生理盐水(与CoCl2同体积)，共7天；②CoCl2 7d组:每天给予腹腔注射CoCl2溶液10mg/kg,共7天；③AMD3100组 第7天给予相应体积生理盐水,第8天腹腔注射AMD3100 5mg/kg, 1小时后准时采集外周血；④ CoCl2 联合 AMD3100 组:先给予 CoCl2 10mg/kg/dX 7d，第 8 天腹腔注射 AMD3100 5mg/kg,I小时后准时采集外周血。3.大鼠外周血细胞提取
各处理组到达相应处理时间后，分别取外周血单个核细胞进行CFU-F法检测MSCs数量与流式细胞术检测⑶45TD90+细胞群比例。4%水合氯醛10ml/kg腹腔注射麻醉SD大鼠，用IOml注射器从后腔静脉取血8 10ml，淋巴细胞分离液分离单个核细胞(MNCs)，吸取白膜层，PBS洗涤3次后，计数。4.CFU-F 法
将6ml外周血中所含MNCs用5ml含有20% FBS、1%青链霉素的LG-DMEM培养基重悬，接种于底面积为12.5cm2的塑料培养瓶中，置于37°C含5%C02孵箱培养。培养7天后换液，倒置显微镜下观察，于第10天时计数外周血CFU-Fs。将呈成纤维细胞样形态、生长密集、>50个细胞的集落记为CFU-F。一个MSCs贴壁即扩增形成一个CFU-F，基于此理论，CFU-F培养法已成为检测外周血MSCs数量的经典方法。CFU-F法检测结果发现:给予CoCl2 10mg/kg/dX 7d，大鼠外周血 CFU-Fs 数量较对照组显著增加(2.37±0.19 vs.1.27±0.08 CFU-Fs/ml, P〈0.05)。与生理盐水对照组相比，AMD3100组外周血中CFU-Fs数量并无明显增加。与单用CoC12组相比，CoC12联合AMD3100可以显著增加MSCs动员效率(3.83±0.32 vs.2.37±0.19 CFU-Fs/ml, Ρ〈0.05),参见图1A。本申请者研究发现:CoCl2 10mg/kg给予7天可增加大鼠外周血MSCs的数量。CoCl2联合CXCR4抑制剂AMD3100可以增加MSCs动员效率。5.流式细胞术检测大鼠外周血及骨髓中⑶45XD90+细胞群比例
将计数后大鼠外周血 单个核细胞用PBS调整细胞浓度至107/ml。加100 μ I调整后细胞至1.5ml EP管，同时设置单色及双色同型对照组。流式抗体染色:⑶90-PE每管5μ1，CD45-FITC每管2 μ I。避光室温孵育30min后，PBS洗涤2次，用400 μ IPBS重悬后加入流式管，上机检测。流式细胞术检测发现:CoCl2 10mg/kg给予7天可以使外周血中⑶45_CD90+细胞群比例升高，参见图1B ;且总数增加(2.93 ± 0.40 vs.1.46 ± 0.16X 104/ml P〈0.05)，参见下表。(:0(:12与41 3100联用后，大鼠外周血中⑶45TD90+细胞群比例较(:0(:12组进一步上调，参见图1B ;数量也明显增加(4.71 ± 0.11 vs.2.93 ± 0.40 X 104/ml, Ρ〈0.05)，见下表I。此结果也进一步证实了 CoCl2 10mg/kg给予7天可以诱导大鼠MSCs动员。CoCl2联合CXCR4抑制剂AMD3100可以增加MSCs动员效率。表I各处理组大鼠外周血单个核细胞数量与⑶45TD90+细胞群变化
权利要求
1.一种用于间充质干细胞动员的制剂，其特征在于，它包括CoCl2。
2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述的CoCl2为缺氧模拟剂，剂量范围5_20mg/kg。
3.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述的CoCl2与AMD3100联合使用。
4.根据权利要求3所述的制剂，其特征在于，所述的AMD3100剂量为5mg/kg。
5.一种利用权利要求1或2所述的制剂分离间充质干细胞的方法，其特征在于，利用所述的制剂促使间充质干细胞动员进入外周血然后进行分离。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的分离步骤如下:采取外周血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含有20%胎牛血清的DMEM培养基重悬，接种至培养瓶，培养7天后换液，第10天得到外周血间充质干细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的外周血间充质干细胞高表达CD90、⑶29、⑶44，不表 达⑶45、⑶34，具有体外成骨、成脂、成软骨分化能力。
全文摘要
本发明提供一种动员间充质干细胞的制剂及分离方法。一种用于间充质干细胞动员的制剂，包括CoCl2。所述的CoCl2为缺氧模拟剂，剂量范围5-20mg/kg。所述的CoCl2与AMD3100联合使用。所述的AMD3100剂量为5mg/kg。一种利用所述的制剂分离间充质干细胞的方法，利用所述的制剂促使间充质干细胞动员进入外周血然后进行分离。所述的分离步骤如下采取外周血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含有20%胎牛血清的DMEM培养基重悬，接种至培养瓶，培养7天后换液，第10天得到外周血间充质干细胞。所述的外周血间充质干细胞高表达CD90、CD29、CD44，不表达CD45、CD34；具有体外成骨、成脂、成软骨分化能力。本发明具有较高的MSCs动员效率，为组织工程与再生医学等提供了一种有效的制剂和方法。
文档编号C12N5/0775GK103146646SQ201310057178
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月22日 优先权日2013年2月22日
发明者黄河, 刘丽珍, 余勤 申请人:浙江大学