专利名称：盐藻肌醇磷酸合酶基因、其编码蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有耐盐功能的基因、其编码蛋白及其应用。特别涉及一种盐藻^Dunaliella Firit/is)肌醇憐酸合酶(myo-1nositol-l-phosphate synthase, MIPS)基因DvMIPS,其编码蛋白及其应用。
背景技术：
世界人口日益增长，耕地面积日趋减少，提高农作物产量成为了解决这对矛盾的重要途径。然而土壤盐溃化、干旱、营养贫瘠和极端温度等各种环境胁迫严重影响了农作物的生长和发育，并降低其产量。世界可耕土地中有20%出现严重的盐溃化，严重影响了农作物的产量。研究生物的抗盐机制，利用分子生物学技术来获得抗性基因，揭示生物与逆境之间的关系，辅助作物育种，已经成为了提高农作物产量的有效途径之一。植物在长期的进化过程当中，针对盐胁迫产生了一整套的应答机制。如激活植物胁迫应答的细胞信号通路，引起细胞应答如积累大量的渗透保护物质、维持细胞内离子动态平衡、修复被破坏的蛋白和膜系统、清除活性氧自由基等。目前人们已经通过对拟南芥等模式植物的研究，在植物耐盐方面取得了巨大的研究成果。但是以非盐生植物作为研究的模式植物，不可能完全揭示植物的耐盐机制。盐生模式植物正受到世界范围内学者们的关注。其中杜氏藻属是自然界中广泛存在的真核单细胞绿藻。它广泛分布于盐湖、海洋、盐土等高盐度的环境中，是高盐水域中的主要的生物种群，很容易从自然环境中分离得到。^MQDunaliella ririt/is)是杜氏藻属中具有代表性的一个种。该种又称杜氏盐藻、绿色杜氏藻、盐生绿色杜氏藻等。盐藻对环境具有极强的适应能力，可在从0.05mol/L到饱和NaCl (约5.5 mol/L)的条件下生长,是已知最耐盐的真核生物之一。盐藻极强的耐盐能力、简单的细胞结构以及便利的培养条件使盐藻成为研究植物适应高盐胁迫的分子机制的重要模式生物。盐藻很容易从自然环境中分离得到，也可以向藻种保存中心索取。因此，盐藻成为了一个重要的耐逆基因资源宝库。
肌醇憐酸合酶(myo-1nositol-l-phosphatesynthase, MIPS)是一种在真核和原核生物界高度保守的酶。在大多数真核生物和个别原核生物系统中，MIPS的催化反应需要NAD+辅因子。NAD+辅因子的结合基序在MIPS氨基酸序列的功能域中是保守的。MIPS可以催化六憐酸葡萄糖(glucose 6-phosphate)向肌醇憐酸(L-myo-1nositol 1-phosphate)的转化。肌醇及其衍生物参与多种生物化学及生理学过程，包括:细胞内信号转导、膜建成和转运、膜相关蛋白定位以及细胞壁的形成等。植物细胞中的肌醇分子还参与了更多的生命过程，包括形成植酸等储存物质、调节植物细胞抗逆、促进种子脱水、修饰生长素、参与细胞壁组成等。在植物组织中已报导的MIPS有两种:细胞质类型和叶绿体类型。叶绿体类型与类囊体膜相关，受光条件的调控，而细胞质类型参与各种重要代谢反应。在生物学和免疫学的特性上，叶绿体类型与细胞质类型的MIPS是相似的。它们在胁迫反应中起着重要作用，如耐盐，耐干旱，参与细胞程序化死亡的过程等。在肌醇和肌醇衍生物的合成过程中，MIPS基因的合成受光和盐的调控。目前还没有文献报道盐藻中MIPS蛋白的功能。克隆分析盐藻中基因有助于深入理解盐藻抗盐机制，同时也为生物耐盐基因工程和分子育种提供了新的基因资源。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种盐藻肌醇磷酸合酶(myo-1nositol-1-phosphatesynthase,MIPS)基因。该基因是从盐藻iMmmliella virit/is)中分离出来的,爾、％DvMIPS。本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。本发明的目的之三在于提供该基因在催化六磷酸葡萄糖(glucose 6-phosphate)向肌醇磷酸(L-myo-1nositol 1-phosphate)转化中的应用。本发明的目的之四在于提供了该基因在提高生物耐盐性状中的应用。为达以上目的，本发明通过下述方案实现:
O 一种盐藻肌醇磷酸合酶基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO I所示的碱基序
列；
2)—种上述的基因的编码蛋白，该蛋白为SEQ ID NO 2所不的氣基酸序列；
3)上述的基因，具有可以 催化六磷酸葡萄糖(glucose 6-phosphate)向肌醇磷酸(L-myo-1nositol 1-phosphate)转化的肌醇磷酸合酶的应用功能。4)上述的基因在提高生物耐盐性状中的应用。本发明通过盐胁迫处理，采用酵母功能互补系统，首次从盐藻中克隆到了一个肌醇磷酸合酶基因，并通过实验证明了该基因还具有提高生物耐盐性状的应用价值。
图1为本发明基因编码的肌醇磷酸合酶蛋白进化树分析图。图2为本发明融合His标签的伽#//5基因编码蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。M:蛋白 marker ;1:pET32a 未诱导的全菌；2:pET32a 全菌；3:pET32a 上清；4:pET32a 沉淀；5:pET32a_DvMIPS 未诱导的全菌；6:pET32a_DvMIPS 全菌；7:pET32a_DvMIPS上清；8:PET32a-DvMIPS沉淀；箭头所示为诱导表达融合His标签的办#//5基因编码蛋白。图3为本发明基因编码蛋白的肌醇磷酸合酶活性测定图。**表示融合His标签的基因编码蛋白与空载蛋白相比，两者的肌醇磷酸合酶活性具有极显著的差异(Ρ〈0.01)。图4为本发明基因在酵母突变体G19中的耐盐功能分析。即 .含DvMIPS完整ORF的EST序列(Contig 187)插入到酵母表达载体pAJ401中，转化酵母盐敏感突变体G19，在含不同浓度NaCl的 表型展示培养基上进行耐盐表型测定。具体实施方法
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)或酵母遗传学方法(Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual,Adams A et.al.编，Cold Spring Harbor Laboratory, 1998 出版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一全长编码区的克隆与分析
对盐藻(ft ririi/is)受不同浓度盐诱导的cDNA文库EST序列(表达序列标签)进行分析，重点分析表达量明显受盐诱导的序列。通过序列比对，从编号contig 187的EST序列中分离到了一个盐藻肌醇磷酸合酶基因，命名为DvMIPS。DvMIPS的开放阅读框(ORF)为1548 bp，cDNA全长2194 bp，含有绿藻基因特异的加尾信号TGTAA及poly (A)结构。实施例二编码的蛋白结构、同源分析
Vector NTI软件的分析结果显示:该基因编码一个含516个氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小为56.9 kDa，等电点为5.38。与其他物种的MIPS基因具有较高的同源性，该基因编码的蛋白还具有 inos-1-P-synth domain 和 NAD_binding-5 domain。DvMIPS 在同源区段中含有在所有物种肌醇-1-磷酸合成酶中都有保守的GWGGNNG氨基酸基序，是NAD+的结合活性位点。在DvMIPS的序列中还发现了在真核生物肌醇-1-磷酸合成酶中高度保守的NGSPQNTFVPGL基序、SYNHLGNNDG基序和LWTANTERY基序，暗示该蛋白在物种进化上是高度保守的。图1为本发明的基因编码的蛋白进化分析图，表明该编码蛋白属于inos-1-P-synth蛋白超家族。实施例三'DvMIPS编码蛋白的定位预测及原核表达分析
通过WoLFPSORT软件预测，DvMIPS定位于细胞质中。通过PCR的方法，在DvMIPS基因的ORF两端加入限制性内切酶位点EcoRl和通ο I，连接T载体测序正确后，EcoRl和通ol双酶切目的片段连接到同样双酶切的原核表达载体pET32a上，得到重组质粒pET32a-1V#775。重组质粒转化进入大肠杆菌表达菌株BL21中，I mM IPTG，16 °C诱导8 h后，加入适量体积的PBS缓冲液超声破碎菌体。离心得到的上清即为粗蛋白提取物。图2为融合His标签的DvMIPS蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。 实施例四'DvMIPS编码蛋白的肌醇磷酸合酶活性测定
1.将100-200 Ug提取的粗蛋白溶液与相应体积的酶活反应液[50 mM Tris.HCl(PH=7.5), 14 mM NH4Cl, 0.8 mM NAD+, 5 mM β -ME, 5 mM G-6-P]混合，总体积为 500 ul，37°C反应I h。同时设置对照:空白对照O (无蛋白，仅加入PBS缓冲液)，对照I (在反应Oh时加入TCA终止反应。)
2.1 h后加入200 ul TCA终止酶活反应。3.12000 rpm离心2 min,上清转移至新的离心管(约700 ul)
4.加700 ul NaIO4,(设对照2不加NaIO4,改加同体积的水)37 °C反应I h。5.加入1.4 ml Na2SO3，(设对照3加入同体积水)总体积为2.8 ml。加入等体积p1-reagent [H2SO4 (6N):10% 抗坏血酸:2.5% 钥酸铵:H20=1:1:1:2]，37°C反应 1.5 h。6.分光光 度计测定OD66tl。DvMIPS编码蛋白的肌醇磷酸合酶活性测定值见图3。实施例五在酵母盐敏感突变体中的功能分析 (一)酵母表达载体的构建
将含有仇说775完整ORF的EST序列(Contig 187)利用其限制性内切酶位点I和Xho I构建到酵母表达载体PAJ401中。(二)转化酵母
使用LiAc热激转化法将含有Contig 187的重组克隆转化到酵母盐敏感突变体G19(Mat , ura3 his3 trpl ade2 enal Δ::ena4 Δ)中。
(三)酵母转化子的耐盐表型鉴定
所用基本培养基为AP培养基，并加入所需氨基酸，筛选标记为尿嘧啶营养缺陷。转入载体为PAJ401的转化子表型展示培养基，添加2%的半乳糖作为碳源。所用表型展示培养基:以不含NaCl的AP培养基为对照，加入不同浓度NaCl的AP培养基，用以分析酵母转化子的耐盐表型。首先将酵母转化子在AP培养基中培养至OD6tltl=0.6，以5 μ I为一个滴度，并以5倍稀释度为系列稀释滴度，在表型展示培养基上展示酵母转化子的耐盐表型。在PAJ401组成型强表达启动子启动下，Contig 187成功互补了酵母盐敏感突变体G19的表型(图4);结果表明转化了含办#//5完整ORF的EST序列的酵母盐敏感突变体在280 mM NaCl胁迫下仍然有表型，说明了基因能够部分恢复酵母盐敏感突变体的功能，证明了DvMIPS像够有效地提高生物体的耐盐能力。尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
权利要求
1.一种盐藻肌醇磷酸合酶基因，其特征在于该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO I所示的碱基序列。
2.一种根据权利要求1所述的基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白具的氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一种根据权利要求1所述的基因在催化六磷酸葡萄糖向肌醇磷酸转化中的应用。
4.一种根据权利 要求1所述的基因在提高真核生物酵母耐盐能力中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种盐藻(Dunaliellaviridis)肌醇磷酸合酶(myo-Inositol-1-phosphatesynthase,MIPS)基因DvMIPS、其编码蛋白及其应用。该基因为SEQIDNO1所示的DNA序列。本发明首次从盐藻(Dunaliellaviridis)中分离到肌醇磷酸合酶(myo-Inositol-1-phosphatesynthase，MIPS)基因DvMIPS，并通过转化酵母细胞证明该基因不但具有肌醇磷酸合酶功能，还具有提高生物耐盐性状的应用价值。
文档编号C12P9/00GK103146731SQ201310057038
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月22日 优先权日2013年2月22日
发明者李平, 孙文杰, 李松, 俞頔, 王超, 宋任涛, 许政暟 申请人:上海大学