专利名称：测定肌醇六磷酸(ihp)的方法
测定肌醇六磷酸(IHP)的方法本发明涉及测定可注射进人或动物中之产品或该产品之级分(特别是红细胞悬液)中的肌醇六磷酸(或IHP)的方法。IHP是血红蛋白的强效变构效应物。因此，它可用于降低血红蛋白与氧的亲和力并使组织中的氧释放增加。在癌症学(特别是缺氧肿瘤(hypoxic tumor))中，它可用作放射治疗辅药。W0-A-2006/016247描述了将IHP包封于作为生物运载体的红细胞中。包封IHP之红细胞的临床应用需要知道所存在的IHP量，从而能够根据处方剂量确定所要输注的悬液体积。此外，由于IHP是一种金属螯合剂(例如钙螯合剂)，如果以游离形式施用可能会潜在地具有有害作用，因此测定最终药物产品中存在的细胞外IHP也是很有必要的。文献中已描述了多种测定IHP的方法。这些方法大多是为了测定食物提取物中存在的IHP而开发的。根据方法是直接的、间接的或者酶促的，这些方法可分为3类。在直接法中，特别地涉及质谱法、核磁共振法、电导分析法和折射分析法，这些方法都需要待分析的样品是高纯度的，因而需要很长的实施时间。间接法是基于IHP与金属离子的络合能力，可以通过比色法或荧光分析法对形成的[金属离子-IHP]络合物进行测量。Kenan Dost, Ozge Tokul (Analytica Chimica Acta 558(2006) :22-27)描述了间接测定小麦和基于小麦之产品中的IHP的方法。该方法是基于存在IHP时无色络合物[Fe(III)-肌醇六磷酸]置换有色络合物[Fe(III)-硫氰酸盐] 的反应。通过与UV-可见光分光光度检测仪偶联的高效液相色谱法(HPLC)进行读数。^S 由 Plaami 等人(Journal of the association of official analytical chemists, the association, Arlington, VA, US, 1991，74，32-36)已知测定谷物中存在的肌醇六磷酸的方法。该公开的方法是基于用电感耦合等离子体原子发射光谱法(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry, ICP-AES)测定肌醇六磷酸中所含的磷。还由Park 等人(Butterworth，London, 2006，17 (9)，727-732)已知用于测定儿童食品中肌醇六磷酸之量的多种方法。所描述的方法之一是根据Latta和Eskin(J. Agric. Food. Chem.，1980，28，1315-1317)的分光光度法，其需要利用离子交换树脂进行色谱分析的步骤。根据Park等人测定肌醇六磷酸的最佳方法是AOAC法。酶促法是基于利用称为“肌醇六磷酸酶”的酶使IHP水解；这些方法不适用于测量红细胞内的IHP。文献中所描述的有关农产品中的测定方法不能直接转用到含有IHP之药物产品的情形中，特别是因为其组成存在显著差异。本文中的这些著述不应视为评价本发明之专利性的有力证据。还可以在文献中找到涉及利用直接法测定红细胞中IHP的研究，这些直接法具有某些缺陷，使其不适用于药物产品生产的常规测定中。S. Villa 等人(Adv Exp Med Biol. 1992 ；326 :41-49)描述了通过 HPLC 测量红细胞中IHP的简便、可靠的方法。所提出的分析方法包括下列步骤 通过裂解掺有IHP的红细胞并用高氯酸提取来制备样品，
制备流动相，并使HPLC柱平衡， 使样品通过柱， 通过折射分析法测量IHP的浓度。但是，这种方法需要通过HPLC分离样品，因此其实施时间很长。需要指出的是，制备标定范围需要测定10个不同的IHP浓度，每个浓度测试数次；估计其持续时间可为6小时。此外，该方法的检出限(0.5mM)不足以对终产品中存在的细胞外IHP进行定量。该方法不能满足工业规模生产对测定快速性和灵敏度提出的要求。B. Teisseire 等人(J. Appl. Physiol. 1985 年 6 月；58 (6) :1810-7)评估了向仔猪中输注入掺有IHP之红细胞的生理作用。该文章描述了一种测量红细胞中IHP的方法，其基于测定IHP掺入之前和之后细胞内磷酸盐的浓度。这两个浓度之间的差异是由IHP引起的。这种估计程度很大的方法不适用于对治疗用产品的红细胞中IHP进行测量。Mosca 等人(Adv Exp Med Biol. 1992 ；326 19-26)和 R. Nano 等人(Adv Exp Med Biol. 1992 ；326 :35-39)描述了与B. Teisseire等人所描述相同的测定红细胞中IHP的方法，只是其中通过NMR测量磷酸盐浓度。除了缺少B. Teisseire方法已提及的精确性之外， 该方法还存在与NMR设备相关的实施以及费用过高的难题。本发明的第一目的是提供一种快速且可靠的测定方法。本发明的第二目的是提供易于自动化的上述方法。本发明的第三目的是提供一种能够满足ICH(International Conference on Harmonizaiton)制定之指导原则的手动或自动的上述方法。因此，本发明的一个主题是测定可注射进人或动物中之产品或该产品之级分中的肌醇六磷酸(IHP)的方法，其中将金属化合物加至所述产品的样品或级分中，随后检测所述金属化合物与所存在之IHP的络合反应，由此测定产品或其级分中存在的IHP。“可注射进入或动物中的产品”的表述意指可含有IHP作为活性成分或作为杂质的药物产品。本发明首先主要涉及测定产品或其级分中作为活性成分存在的IHP。术语“级分”是指可含有IHP之产品的一部分，并且其IHP含量应当是已知的。本发明特别地涉及测定由负责递送IHP之运载体的悬液或溶液形成的产品中的IHP。其可以是含有或包封有 IHP的运载体，或者是通过任意键合(包括反离子)结合IHP的运载体。在一种重要的模式中，利用本发明之测定方法来测定运载体悬液中的总IHP，或者测定运载体外介质(特别是上清液或悬液液体)和载体之一或两者的级分中的IHP。优选地，其涉及运载体(例如脂质体、微球或纳米球、微囊或纳米囊、红细胞等)悬液。本发明还涉及在含有IHP运载体之产品的上清液中测定游离的IHP。根据本发明的一个优选实施方案，所述络合产生络合物，其显色与初始金属化合物不同。可以对络合物相对于初始金属化合物的吸光度变化进行测量。根据一个有利的特征，通过分光光度法来检测吸光度的变化。根据一个实施方案，试剂是有色的Fe(III)化合物。特别地，其是使得能够产生肌醇六磷酸络合物的金属化合物，具体可参考F Crea等人，2008，Coordination Chemistry Reviews 252，1108-1120。就试剂而言，可提及的是例如！^ (III)-硫氰酸盐和 !^e (III)-5-磺基水杨酸(采用!^e (III)-磺基水杨酸盐溶液的形式)。在一个实施方案中， 试剂是I^e(III)-硫氰酸盐。
在一个实施方案中，试剂是!^e (III)-磺基水杨酸盐。根据一个实施方案，利用所述测定方法来测定红细胞悬液中的IHP。本发明特别地用于测定加载有IHP并旨在用于患者治疗的红细胞悬液中存在的IHP。利用该方法对细胞内IHP和/或细胞外IHP的总IHP进行测定。根据一个实施方案，利用该方法测定一定体积悬液中存在的IHP。此测定可用于根据患者处方的IHP剂量(同时考虑到细胞外IHP含量)来确定待施用的悬液量。根据另一实施方案，利用该方法测定上清液中存在的IHP。用于测定总IHP的方法可特别地包括-在细胞外介质存在下使红细胞裂解，-获得含有IHP但不含血红蛋白和细胞碎片的级分，-将已知量的金属化合物加至该级分中，使其与所存在的IHP形成络合物，-测定总IHP含量。用于测定红细胞内IHP的方法可特别地包括-去除细胞外介质，回收红细胞级分，-使红细胞裂解，-获得含有IHP但不含血红蛋白和细胞碎片的级分，-将已知量的金属化合物加至该级分中，使其与所存在的IHP形成络合物，-测定红细胞内IHP含量。用于测定细胞外IHP的方法可包括-回收细胞外级分，-将已知量的金属化合物加至该细胞外级分中，使其与所存在的IHP形成络合物，-测定细胞外IHP含量。类似步骤可用于任何其它类型含IHP的运载体(例如脂质体或微球)，还可用于测定含有与IHP结合之运载体的产品的上清液中的游离IHP。如果联合测量同一红细胞悬液中的细胞外IHP和总IHP，则可从中推算出红细胞内的IHP含量。具体地使用下列等式
权利要求
1.测定可注射进人或动物中之产品中或该产品之级分中的肌醇六磷酸(IHP)的方法， 其中将金属化合物加至所述产品的样品或级分中，随后检测所述金属化合物与所存在之 IHP的络合反应，由此测定所述产品或其级分中存在的IHP。
2.根据权利要求1的方法，其中所述络合反应产生络合物，其显色与金属化合物的显色不同。
3.根据权利要求2的方法，其中测量所述络合物相对于初始金属化合物的吸光度变化。
4.根据权利要求3的方法，其中所述吸光度的变化通过分光光度法检测。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述试剂是狗(III)化合物。
6.根据权利要求5的方法，其中所述!^e(III)化合物是狗(III)_硫氰酸盐。
7.根据权利要求5的方法，其中所述!^e(III)化合物是狗(III)_磺基水杨酸盐。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品是红细胞悬液。
9.根据权利要求8的方法，其用于测定总IHP，该方法包括 -使所述红细胞裂解，-获得含有所述IHP但不含血红蛋白和细胞碎片的级分，-将已知量的所述金属化合物加至该级分中，使其与所存在的IHP形成络合物，-测定总IHP含量。
10.根据权利要求8的方法，其用于测定红细胞内IHP，该方法包括 -去除细胞外介质，回收红细胞级分，-使所述红细胞裂解，-获得含有所述IHP但不含血红蛋白和细胞碎片的级分，-将已知量的所述金属化合物加至该级分中，使其与所存在的IHP形成络合物，-测定红细胞内IHP含量。
11.根据权利要求9或10的方法，其中所述血红蛋白通过在酸存在下使蛋白质沉淀的步骤去除。
12.根据权利要求8的方法，其用于测定细胞外IHP，该方法包括 -回收细胞外级分，-将已知量的所述金属化合物加至该细胞外级分中，使其与所存在的IHP形成络合物， -测定细胞外IHP含量。
13.根据权利要求8的方法，其联合权利要求12之细胞外IHP测量和权利要求8之总 IHP测量，利用如下等式获得红细胞内IHP含量[细胞内=[总/朋]XlOO -[细胞外ffl/>]x(100 -血细胞比容)血细丨包比容
全文摘要
本发明涉及一种测定可注射进人或动物中之产品或该产品之级分中的肌醇六磷酸(inositol hexaphosphate，IHP)的方法，在该方法中将金属化合物加至所述产品的样品或级分中，随后检测所述金属化合物与所存在之IHP的络合反应，由此测定所述产品或其级分中存在的IHP。本发明使得可以在悬液或溶液中(特别是在红细胞悬液的不同区室中)测定IHP。
文档编号G01N33/80GK102428367SQ201080019629
公开日2012年4月25日 申请日期2010年4月6日 优先权日2009年4月3日
发明者扬·戈德弗兰, 瓦内萨·布尔若 申请人:爱瑞泰克药物公司