专利名称：一种与植物耐盐性相关的miRNA——tsa-miRn280及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种与植物耐盐性相关的miRNA，其为ー种来源于盐芥的、能够调节植物耐逆性尤其是与耐盐性相关的新的miRNA，通过该miRNA的转基因操作可提高作物的耐逆性；本发明还涉及此miRNA的前体、其前体的编码基因及其用途，属于生物技术领域。
背景技术：
土壤盐溃化已成为影响农作物生长发育、产量和品质的ー个重要因素，是农作物减产的主要原因之一。目前，世界上约有20%的可耕地和至少40%的灌溉田具有不同程度的盐溃化，随着人口的剧增及エ业化的高速发展，可耕地面积急剧下降，不合理灌溉、エ业污染的加剧和化肥使用不当，造成了大量良田的次生盐溃化，预计到2050年全球将有50%的耕地发生不同程度的盐溃化(Zhu，2001)。自然界中，植物对盐的适应有明显的差异，适应范围非常广泛，既有盐敏感的甜土植物，又有耐盐的盐生植物(Zhu，2001)。由于大多数农作物为盐敏感的甜土植物，盐依然是影响农作物产量的主要限制因子。目前，对植物耐盐机理的研究已有相当的进展，例如朱健康实验室关于拟南芥S0S1、S0S2、S0S3途径的发现及其耐盐机理的阐明(Zhu，2002)，Blumwald实验室过量表达AtNHXl对于提高植物耐盐型所产生的影响(Blumwald’et al，1999)等。但目前国际上对植物耐盐机理的研究，主要集中于甜土植物，因而对于植物耐盐性机理的了解还存在一定的局限性。miRNA为广泛存在于真核生物中大约21_24nt的非编码RNAs，植物miRNAs大多为靶向转录因子等调控蛋白，从而处于植物基因表达调控的中心位置。而逆境胁迫(盐、硫或磷匮乏和氧化胁迫等)不仅会诱导植物蛋白质编码基因的表达，也诱导ー些非蛋白质编码基因miRNA的表达。 植物miRNAs是目前国际研究的热点，但仅有少数实验室关注耐盐相关miRNAs，且主要是以模式植物拟南芥和水稻等为试材，例如在拟南芥、水稻和杨树等物种中克隆到与盐、磷缺乏、硫缺乏、氧化和力学胁迫等相关的miRNAs ;结果表明miRNAs作为革巴蛋白的负调节因子，其调节功能不仅在于植物发育、也在对盐等逆境胁迫的应答等过程中担任重要的调控作用(Sunkar, et al, 2004, 2005, 2007; Jones-rhoades, et al, 2004;Mica, etal,2006)。盐芥(Thellungiella salsuginea)是与拟南芥近缘的植物耐盐分子遗传学研究的新模式系统(Bressan，et al, 2001)，盐芥的基因组测序已由美国农业部在2011年底完成，其基因组序列网站參见:http://www.phytozome.net/thellungiella.php。盐芥和拟南芥同为十字花科植物，在cDNA水平上两者存在90% 95%的相似性。但相对于甜土植物拟南芥，盐芥为ー种典型的盐生植物，能天然适应于盐胁迫的环境，即使短时间暴露于500mMNaCl也可完成其生长史(Inan，et al，2004 ；Taji, et al，2004)。随着盐芥基因组测序的完成，盐芥功能基因组学尤其是耐盐相关基因的功能已成为其研究工作的重点。鉴于土壤盐溃化已成为限制农业生产的主要因素之一，通过研究植物耐盐胁迫的生理生化和分子生物学机制，挖掘耐盐基因资源，并运用基因工程手段培育耐盐作物，对于提高农作物的产量具有重要的现实意义。因而，以盐芥这ー耐盐分子遗传学研究的新模式系统为试材，进行其miRNAs及其与耐盐性关系的研究，具有一定的前瞻性和创新性。另外，在可检索的现有技术中，对盐芥miRNAs的研究还未见报道。主要參考文献:Zhu J.K.Plant salt tolerance.Trends in Plant Sci，2001，6:66-71.
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发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了 ー种与植物耐盐性相关的、来源于盐芥的miRNA——tsa-miRn280，以及其前体序列及其前体序列的编码基因，利用该miRNA进行作物的遗传转化可培育耐盐作物，从而对提高作物的产量有重要意义。
本发明是通过以下技术方案实现的:ー种与植物耐盐性相关的miRNAs，命名为tsa-miRn280，其具有序列表中SEQ IDNO:1所示的序列。上述与植物耐盐性相关的miRNAs前体序列，其具有序列表中SEQ ID NO: 2所示的序列。编码上述与植物耐盐性相关的miRNAs前体序列的DNA序列，其具有序列表中SEQ ID NO: 3所示的序列(SEQ ID NO: 3所示的序列为编码tsa_miRn646前体的DNA，tsa-miRn646前体在DNA的负链上)。上述与植物耐盐性相关的miRNAs在培育耐盐转基因作物中的应用。作为上述应用的一种优选技术方案，在作物如小麦、水稻、玉米、棉花中过表达SEQID NO:1所示的miRNA或者SEQ ID No:2所示的miRNA前体，或抑制SEQ ID NO:1所示的miRNA或者SEQ ID No:2所示的miRNA前体的表达，培育出具有高耐盐性的转基因作物。本发明的实验证明，Solexa测序具有高灵敏度和准确性的优点，从Solexa测序结果可看出tsa-miRn280受盐胁迫的调节，说明其在盐芥的耐盐性机制中担任重要作用。鉴于此，可利用该基因进行耐盐转基因作物的培育，进而对于提高作物的产量具有潜在的应用价值。本发明的优点在于:本发明采用先进的Solexa高通量测序技术及随后的生物信息学分析和实时定量PCR技术等，首次从盐芥中鉴定了 tsamiRn280，tsamiRn280在盐处理后表达下调:在盐处理的小RNAs库中其计数为0，而在对照即非盐胁迫处理的小RNAs库中其计数为84,说明tsa-miRn280的表达在盐处理后其表达强烈受抑。预测tsamiRn280的革巴基因为WRKY转录因子，已有研究证明靶标WRKY蛋白參与生物和非生物胁迫的应答及植物发育、衰老等一系列 生命活动。因而，本发明提供的tsamiRn280可能在植物耐逆性尤其是耐盐性中担任重要作用，从而在耐盐作物的培育中具潜在的应用价值。
图1:tsa-miRn280前体序列的ニ级结构图，阴影部分为成熟miRNA所在位置。其前体序列折叠成ー种稳定的茎环结构，能量值为-62.8。属于miRNA前体典型的ニ级结构，符合miRNA前体的结构特征。图2:Solexa测序显示tsa_miRn280在对照和盐处理(200mMNaCl)情况下的表达丰度。图3:tsa-miRn280对靶基因WRKY转录因子的mRNA降解示意图。
具体实施例方式以下实施例详细说明本发明，但不限于此。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1:盐芥种子采集和种植在山东省东营市黄河三角洲盐碱地收集野生型盐芥(Thellungiellasalsuginea,山东生态型)种子，晒干,经过表面消毒:70%酒精,处理lmin, l%NaC10溶液，润旋10_15min,灭菌双蒸水冲洗后播种于MS培养基的培养皿中，光照培养箱的温度设定:白天25°C，16h，晚间22°C，8h。待长出2片真叶后转移到Hogland液体培养基上，培养5周左右后，Hogland营养液中加入NaCl使其终浓度为200mM，培养24小时，对照仍为不含NaCl的Hogland营养液。实施例2:盐芥miRNA文库的构建和Solexa测序将盐芥对照组(CL)和NaCl处理组(TL)的样品，送往深圳华大基因研究所构建miRNA文库，进行Solexa测序。测序后去除3’接头、污染序列、小于18nt序列和poIyA序列后，在盐芥CL miRNA文库中总共获得高质量小RNA序列(sRNA) 12010658条，在TL miRNA文库中总共获得高质量小RNA序列(sRNA) 12330771条。生物信息学预测结果显示tsa-miRn280成熟体序列为AUUCCGGAACCCUAGAGACCAUA，其前体序列为CUCAGCCUCAAUUCCGGAACCCUAGAGACCAUAGA⑶AUUGAAGACUAUAAAUACUUGUCAUUUAGGUC⑶UUUUAGGGACAACCCUUCAUACUUUACAAAAACCCUUUUCCUUUAGCCGUUUUUAUGCGAUUUUU⑶AGAAGAUUUGUUCAAGUCCGA⑶UCUUCAAUAGAGAAGCUUUCUUCAUCUCUUUUCUUUACU⑶UUUUGAUUACUUUUAUUAAAACCAAUGAUGAUGUCGACCUCAGCUAUGUCUCAGUAGAUCCCGAGUUGGGCUUAGA，在基因组中位置为:scaffold_7:10736233:10736510:-。根据tsamiRn280的前体和成熟体序列，用软件RNAstructure画出tsa_miRn280前体的ニ级结构,如图1所示，阴影部分为成熟miRNA所在位置，其前体序列折叠成ー种稳定的茎环结构，能量值为-62.8。属于miRNA前体典型的ニ级结构，符合miRNA前体的结构特征。测序结果显示tsa_miRn280在正常条件下的测序丰度为84，盐处理后的测序丰度为0，表明tsa-miRn280的表达在受到盐胁迫后严重受抑制(图2)。预示着tsa_miRn280在盐芥适应盐胁迫的机制中起重要作用。在农作物(例如玉米、小麦、水稻、油菜、大豆等)中过量或者抑制tsa-miRn280的表达，将影响作物对盐胁迫的适应能力。实施例3:tsa-miRn280祀基因的验证和功能分析
利用miRNA和靶基因的互补性，可以通过生物信息学的方法在盐芥全基因组水平预测 tsa_miRn280 的革E基因。按照 Schwab 等的方法(Schwab R et al., Specific effectsof microRNAs on plant transscriptome.Dev.Cell, 2005)使用以下规则:sRNA 与祀基因间的错配不得超过4个(G-U配对认为0.5个错配)；在miRNA/靶基因复合体中不得有超过2处发生相邻位点的错配；在miRNA/靶基因复合体中，从miRNA的5’端起第2_12个位点不得有相邻位点都发生错配；miRNA/靶基因复合体的第10-11个位点不得发生错配；在miRNA/靶基因复合体中，从miRNA的5’端起第1_12个位点不得有超过2.5个错配;miRNA/靶基因复合体的最低自由能(MFE)应不小于该miRNA与其最佳互补体结合时MFE的75%。用Mireap软件在盐芥全基因组水平预测靶基因。预测结果见表1，tsa_miRn280预测到I个靶基因——WRKY转录因子(核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 4所示,氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 5所示),tsa_miRn280对靶基因的切割位点在WRKY的编码区(图3:tsa-miRn280对靶基因WRKY转录因子的mRNA降解示意图XWRKY蛋白是植物所特有的超级转录调控因子家族，在拟南芥和水稻基因组中分别拥有至少74个和97个成员。WRKY基因以家族形式出现，參与因外界环境改变所导致的分子信号传递或调控基因的转录表达，參与生物和非生物胁迫的应答以及植物的发育和衰老等一系列生命活动。tsa-miRn280祀向WRKY转录因子,预示着tsa_miRn280在盐芥耐盐等生物和非生物胁迫应答等方面具有很重要的作用，因而具有广泛的生物学意义和应用前景。
表I tsa_miRn280靶基因预测
权利要求
1.ー种与植物耐盐性相关的miRNA，其特征在于:其具有序列表中SEQ ID NO:1所示的RNA序列。
2.权利要求1所述的与植物耐盐性相关的miRNA的前体序列，其特征在于:其具有序列表中SEQ ID N0:2所示的RNA序列。
3.编码权利要求2所述的与植物耐盐性相关的miRNA的前体序列的DNA序列，其特征在于:其具有序列表中SEQ ID NO:3所不的DNA序列。
4.权利要求1所述的与植物耐盐性相关的miRNA在促进转录因子WRKY基因的mRNA降解中的应用；所述转录因子WRKY基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。
5.权利要求1所述的与植物耐盐性相关的miRNA在抑制转录因子WRKY基因表达中的应用；所述转录因子WRKY基因的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:5所示。
6.权利要求2所述的与植物耐盐性相关的miRNA的前体序列在促进转录因子WRKY基因的mRNA降解中的应用；所述转录因子WRKY基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 4所示。
7.权利要求2所述的与植物耐盐性相关的miRNA的前体序列在抑制转录因子WRKY基因表达中的应用；所述转录因子WRKY基因的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:5所示。
8.权利要求1所述的与植物耐盐性相关的miRNA/权利要求2所述的与植物耐盐性相关的miRNA的前体序列/权利要求3所述的编码与植物耐盐性相关的miRNA的前体序列的DNA序列在耐盐转基因植物培育中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:在作物中过表达SEQID N0:1所示的miRNA或者SEQ ID No: 2所示的miRNA前体，或在作物中抑制SEQ ID NO:1所示的miRNA或者SEQ ID No:2所示的miRNA前体的表达，从而培育出具有高耐盐性的转基因植物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述作物为小麦、水稻、玉米或棉花。
全文摘要
本发明公开了一种来源于盐芥的与植物耐盐性相关的miRNA，命名为tsa-miRn280，其具有序列表中SEQ ID NO:1所示的RNA序列，其前体序列具有序列表中SEQ ID NO:2所示的RNA序列。本发明的tsa-miRn280可促进转录因子WRKY基因的mRNA降解，抑制转录因子WRKY基因的表达。在作物如小麦、水稻、玉米、棉花中过表达SEQ ID NO:1所示的miRNA或者SEQ ID No2所示的miRNA前体，或抑制SEQ ID NO:1所示的miRNA或者SEQ ID No2所示的miRNA前体的表达，可培育出具有高耐盐性的转基因作物。本发明的tsa-miRn280在耐盐作物的培育中具有重要的意义和潜在的应用价值。
文档编号C12N15/113GK103114090SQ201310057480
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月22日 优先权日2013年2月22日
发明者张荃, 王兴军, 赵彦修, 赵传志, 孙伟, 赵宝添, 张权, 刘艳 申请人:山东师范大学