专利名称：一种增强植物抗旱、耐盐的基因及其编码产物与应用的制作方法
一个增强植物抗旱、耐盐的基因及其编码产物与应用
本发铜涉及荔枝厶itabscisic acid-,stress-,and ripening-induced gene,力5r)序列的获得、表达分析、植物表达载体的构建及转化拟南芥鉴定抗旱、耐盐性。[背景技术]
加(abscisic acid-,stress-,and ripening-induced gene)(脱落酸、胁迫、成熟诱导基因)是近年来从植物中发现的一类基因，自从Iusem等首次从番茄果实中分离了番茄后(Iusemet a1,1993)，在不同植物中克隆了许多爿w ，例如杏(Mbeguie-A隱Mbeguieetal.， 1997)、百合(Wang et al.， 1998; Chang etal.， 1999)、水稻(Vaidyanathanetal.， 1999)、梨(Itaietal.， 2000)、葡萄(Cakiretal.， 2003)、银杏(Shen et al., 2005)等。
近年来关于^w的研究不断深入，在胁迫方面的研究报道较多。据文献报道该基因的表达受冷、渗透压、脱落酸处理等胁迫诱导。在这些胁迫信号中干旱和低温胁迫信号是通过依赖ABA和不依赖ABA两条途径调控各种基因表达的(KShinozakietal.， 1997)。在依赖ABA途径中，Xw的表达受ABA诱导。Cakk等发现葡萄中的ASR蛋白VvMSA是糖和ABA信号途径中的一个转录调节因子(Cakir etal.， 2003)。 Yang等将百合(Zz7/wm/o"g折oraw)的Jw a丄j")转化拟南芥，结果发现该基因可调节胁迫条件下的ABA信号途径，并且转基因植株抗旱和耐盐性增强(Yangetal.， 2005)。在不依赖ABA途径中，Xsr的表达不受ABA诱导，它在干旱胁迫、盐胁迫或冷胁迫条件下就能表达。另有研究发现，Jw的表达不只受到一种胁迫信号诱导。水稻中的一个Zw (OsAsrl),在茎中受外源ABA、盐胁迫、甘露醇诱导均上调表达(Vaidyanathanetal.， 1999)。银杏中的一个A^ (GbAsr)，在根、茎、叶中受甘露醇、盐胁迫、外源ABA诱导均上调表达。盐胁迫代表离子渗透导i的逆境，它通过ABA诱导调控，而甘露醇代表非离子渗透胁迫，不依赖于ABA途径，这表明了这些Aw的诱导表达不只是通过一个信号转导途径。
Jw在果实成熟过程中的调控作用也有报道。在非跃变型果实中，果实的成熟衰老主要受ABA调控(Thiman,1980),它是唯一一种从转色期到成熟后期含量增加的内源激素，这个变化与糖的积累相一致。例如葡萄中的一个ASR基因M^！的mRNA在转色期之前开始大量累积，这种信号一直持续到收获期(Cakir et a1,2003)，该基因的表达量的变化与ABA的变化是相同的，这说明了 Jw的表达在果实成熟过程中是受ABA诱导的。以上研究结果显示As/"不仅与非跃变型果实成熟密切相关，而且在植物各种非生物胁迫方面也起着重要作用。
荔枝("tc力ic/^/je/wis)是我国南方重要的亚热带水果，种植面积逐年增大，产量逐年增多。但是荔枝保鲜和储运困难，尤其是荔枝采后果皮褐变严重，降低了荔枝的商品价值，影响荔枝产业发展。针对荔枝果皮褐变研究报道最多的是果皮褐变与果实失水有关(ScottKJ etal. 1982; Underhill S J R et al. 1993)，而果实失水由主要发生在果皮中(Jiang YMetal.l999;张昭其等，1997)。本研究构建了荔枝果实采后0天果皮的cDNA文库，随即挑取11676个独立克隆点制芯片，提取采后不同失水时期的果实表皮总RNA，反转录cDNA标记探针并与芯片杂交。杂交结果获得大量差异表达基因，对这些差异表达基因进行核算测序，获得一个与ABA、衰老禾口成熟诱导基因(Abscisic acid, stress and ripening inducible gene，A "高度同源的cDNA序列，生物信息学分析该序列具有典型的Asr基因特征，将其命名为ZWsr。推测该基因可能在荔枝水分代谢、果实成熟及其他非生物胁迫过程中具有重要作用。
为了提高植物抗旱、耐盐能力，分离植物抗旱、耐盐相关基因十分必要，通过对这类基因功能研究，及转基因研究，将对提高植物的抗旱、耐盐能力，培育抗旱、耐盐新品种具有重要意义。
本发明提供的技术方案为构建荔枝果实采后O天果皮的cDNA文库，采用芯片杂交技术筛选得到一个与ABA诱导、胁迫诱导表达基因同源性较高的cDNA序列，利用RT-PCR方法研究该基因在采后荔枝果皮不同失水时的表达特性，将该基因转入拟南芥鉴定该基因抗旱、耐盐功能。
1. 荔枝果实采后果皮cDNA文库构建采用CTAB法提取荔枝采后Oh果皮总RNA，电泳检测RNA质量，质量检测完毕后贮于-76'C备用。应用Clontech公司的SMARTTMcDNA Library Construction Kit构建cDNA文库，所有试剂均按说明书使用。
2. 芯片技术筛选荔枝果皮在采后不同时期差异表达基因
选取荔枝果实采后Oh果皮cDNA文库独立克隆11676个点制在芯片上，根据荔枝果皮含水量的变化，分别提取釆后0h、 48h的荔枝果皮总RAN反转录cDNA标记探针，，与芯片上11676个克隆杂交，芯片用LuxScan 10KA双通道激光扫描仪(Capita旧io公司)进行扫描，采用GenePix Pro 4.0图像分析软件(AxonInstruments公司)对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号，对原始扫描荧光数值扣除背景，仅选取扣除背景后荧光值大于400的克隆数据进行后续分析，选取差异表达克隆测序、分析。
3. h'A^在采后荔枝果实不同失水时的表达从差异表达基因分析中得到一个与ABA、衰老和成熟诱导基因(Abscisicacid， stress and ripening inducible gene， As"高度同源的cDNA序列，生物信息学 分析为一个ABA、衰老和成熟诱导基因，命名为"A r。荔枝采收后， 一部分果实室 温裸露放置，分别在0h、 8h、 16h、 24h、 32h、 40h和48h取蕩枝果皮，分别提取总 RNA;另一部分用聚氯乙烯(PVE)膜包装室温存放，在l、 2、 3、 5、 7天时取果 皮，分别提取总RNA，分析两种不同储藏条件下Zissr的表达。
4. ZiAw植物表达载体构建
根据"似r基因的全长序列及所用载体的酶切位点，设计能扩增包含整个ORF (去除终止子)的引物LcasrP3、 LcasrP4，在引物的5'、 3'端分别加上限制性内 切酶酶切位点S戸/、7Vco /。将PCR产物与pMD18-TVector连接、转化五.co/z'DH5a。 挑取阳性克隆，提取重组质粒pMD18-Lcasr2进行PCR和酶切鉴定。提取质粒 pCAMBIA1304和pMD18-Lcasr2的DNA,进行Spe / 、 Wco/双酶切，回收 pCAMBIA1304线性载体部分和pMD18-Lcasr2目的片段，将两者用T4DNA酶连接， 转化五.②/ZDH5a。挑取阳性克隆，提取重组质粒酶切及PCR鉴定，鉴定后的重组 质粒命名为pCAMBIA-Liasr。
5. "A^植物表达载体转化拟南芥
将pCAMBIA-Liasr植物表达载体转化农杆菌EH105，将含pCAMBIA-Liasr
质粒的农杆菌接种到20mL附加Kan 50 pg/mL, Rif25ng/mL, Str25ng/mL YEP液体培 养基上中，28。C振荡培养30h;在浸染前一天将上述菌液加入到400mL含有相应抗 生素的VEP培养基中，28。C振荡培养过夜；5000卬m， 10min收集菌体，用1L电
渗液重悬菌体；
采用真空抽滤法进行拟南芥的转化。将待转化拟南芥倒扣在配置好的电渗液中， 放进真空泵，盖上盖子，打开电源进行抽气，当气压下降到0.08Mpa(此时花序处可 见有气泡浮向液面)开始计时，8min后，将转化后的植株平躺放在一个塑料盘中， 洒上7]C，盖上保鲜膜以保持湿度,放在黑暗处，24h后将植株直立于20 22'C的光照 条件下使其正常生长，收获TO代种子,干燥条件下保存。将TO代种子用75%酒精 加0.02% Tween20处理10分钟，放在无菌滤纸上自然干燥，均匀撒布于含Kan50mg/L 的MS培养基平板，于4。C春化3天后，移入培养室培养，培养15天左右，选择绿 色抗性龟移入土壤中正常管理。种子收获后，再次用Kan50mg/L的MS平板培养基 筛选，直到收获纯种T3代种子。
6. 转基因拟南芥抗旱性、耐盐性鉴定
5将营养土、蛭石和沙子按3: 1: l的比例混匀，用营养水(PH5.8)浸透拌匀，装 满育苗盘，分别播种野生型拟南芥种子和转基因拟南芥种子，在人工气候箱中培养
(22°C，光照时间为8h/d，光照强度为4000bc)，当苗一个月大时，进行胁迫实验。
抗干旱胁迫能力测定连续14天不浇水，进行千旱处理，观察野生型拟南芥和 转化拟南芥的生长情况及萎蔫率，选取代表性植株-7(TC保存备用。然后复水4天， 观察植株恢复生长的情况和比率。抗盐胁迫能力测定每天用400mMNaCl溶液浇灌 拟南芥植株，连续21天，观察野生型拟南芥和转化拟南芥的生长情况及存活率。测 定转基因植株和对照植株的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)、过氧化 物酶(peroxidase, POD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)活性。研究这些基因的表达 和酶活变化与目的基因的关系。
1. 成功构建了荔枝采后0天果皮CDNA文库文库的滴度为
101 x 11 x 1 o3/1=1.1 x 106(pfU/ml)
重组率为(101-12)/101xl00%=88.1%，所得非扩增文库滴度及重组率符合预期要求。 噬菌体环化后，随机挑取单菌落，菌液PCR结果表明，插入片段在300bp-2000bp 之间，平均为900bp左右，插入片段大小符合预期要求，文库质量较高。査阅文献， 目前还未见荔枝果皮cDNA文库有关报道。
2. 芯片分析获得荔枝果皮在不同失水时差异表达基因通过对11676个克隆的初 始扫描荧光值分析，对Ratio值进行t-检验，共有92卯个克隆获得了有效的荧光比 值，但仅5768个克隆在所有的杂交组合中都获得了有效的荧光比值。以在采后 0h-48h样品中至少一组杂交组合中差异表达2倍以上为标准，共筛选得到1682个 克隆在^后不同阶段果皮中差异表达的克隆。对这些克隆进行测序分析，得到一个 与ABA诱导、胁迫诱导表达基因高度同源的序列，命名为"Asr。 "Asr cDNA序 列全长799bp (序列1),包含一个459bp的完整开放阅读框，编码152个氨基酸残 基的多肽(序列2)。 GenBank査找证明荔枝中未见报道。
3. 〃A^基因在采后荔枝果实不同失水时的表达荔枝采后丄iAs凍达分析结果表 明，采后25X:室温裸露忙存条件下，"Asr有两个表达高峰。采后第16h是第一个表 达高峰，之后下降。从第32h开始基因表达量又开始上升，第48h达到第二个表达高 峰，与果皮失水规律一致，说明Z^s/表达受失水诱导。而薄膜包装贮存条件下A"sr 的表达比较稳定，除了在第二天表达量略高外，整体平稳略呈下降趋势，这是因为 薄膜包装后，荔枝果实周围的小环境湿度相对平稳，没有失水的诱导，所以力Wsr基因的表达稳定。该结果进一步表明ZiAsr基因表达受水分胁迫诱导。
4. 成功构建荔枝"^r基因携带绿色荧光蛋白基因植物表达载体pCAMBIA-Liasr:
提取重组质粒pCAMBIA-Liasr进行M:o /、&e /双酶切，能得到约1000bp的片段， PCR扩增能够得到同样大小的目的条带。对pCAMBIA-Liasr上的目的基因进行测 序，证明阅读框正确，载体构建成功。该载体携带有绿色荧光蛋白，利用基因枪法 将该载体打入洋葱表皮细胞，目的基因表达被定位于核上，这与生物信息学分析结 果一致，证明荔枝"'Asr基因与其他植物的Asr基因一样为转录因子，同时也证明 植物表达载体构建成功。
5. 成功转化拟南芥，并证明该基因可以明显提高转基因植株的抗旱性和耐盐性用 载体pCAMBIA-Liasr转化拟南芥，获得7个经PCR检测的阳性植株，进一步的 Southern blot检测其中的4株为转基因植株，且为单拷贝插入。对其中一个转基 因株系355:乂Ws』的表型鉴定发现，其抗干旱和抗盐胁迫能力增强。经干旱处理 14天后，野生拟南芥的萎蔫率为73. 3%,而J55V.Us/D的萎蔫率仅为41. 2% (图 1- A和B)。用400mM NaCl溶液进行盐胁迫处理21天，野生拟南芥植株生长严重 受抑直至死亡，存活率仅为20%，而J55V.'ZiAsrD拟南芥能正常生长，只轻微受抑， 存活率为97°/。(图1: C和D)。
对转h'Aw拟南芥与耐盐、抗旱相关酶活性测定表明，在干旱和盐胁迫条件下， 转基因拟南芥中中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶 (peroxidase, POD)、过氧化氢酶(catalase， CAT)活性提高，上升幅度高于野生型拟 南芥。丙二醛(malonicdialdehyed，MDA)含量增加的幅度小(图2)。说明转基因 拟南芥抗氧化作用增强，清除氧自由基能力提高，而细胞膜脂过氧化作用较小。结 果证明，荔枝ZWsr确实具有增强植物抗旱、耐盐的特性。
图l:转荔枝L'Asr基因的拟南芥植株抗旱(A、 B)、耐盐(C、 D)鉴定 图2:盐，迫对拟南芥S0D、 P0D、 CAT酶活性和MDA含量的影响
[具体实施方式
下面结合实施方式对本发明进行详细说明
1、 材料来源荔枝果实采自
2、 方法
(1)荔枝果皮cDNA文库构建:采后新鲜的荔枝果实立即剥取果皮-7(TC液氮保存， CTAB法提取果皮总RNA，利用Clontech公司的SMART cDNA Library ConstructionKit，根据说明书反转录cDNA，构建cDNA文库。
(2) 芯片制作及差异表达基因筛选从cDNA文库中随机挑取10000个左右的独 立克隆，提取质粒DNA并定量，将质粒DNA利用自动点样机点与芯片上。分别提 取采后0h和48h荔枝果皮总RNA反转录cDNA，用荧光cy3、 cy5分别标记0h和 48h荔枝果皮总RNA反转录cDNA，然后与芯片杂交。选取荧光值差异2.5倍以上 的差异表达克隆，送测序公司测序，进行序列分析。
(3) 荔枝h'/^r基因采后不同时期在果皮中的表达根据采后荔枝果皮含水量的 测定，提取采后水分变化明显的0h、 24h、 48h和72h果皮总RNA，利用RT-PCR方 法研究基因表达与水分的相关性。
(4) 植物表达载体构建及转化拟南芥利用植物表达载体pCAMBIA1304作为基 本载体，采用/ 、 Wco /双酶切pCAMBIA1304载体和经过在引物中加入S， / 、 JVco /酶切位点的荔枝Asr基因PCR产物，回收经过酶切的pCAMBIA1304载体片 段和荔枝Asr基因PCR片段，T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5,提取重组质 粒DNA用S/ e/、 7Vco/双酶切鉴定并测序确认，将构建的植物表达载体命名为 pCAMBIA-Liasr。将植株表达载体转化到农杆菌C35菌种，利用真空法转化拟南芥。
(5) ，基因拟南芥筛选及对ZiAsr基因功能鉴定真空转化获得的TO代拟南芥 种子播种在kan50的培养基中，筛选抗性植株直到T3代获得纯合体。将获得的纯 合体种子播种出苗，进行PCR和Southern鉴定，选取Southern鉴定证明外源基因 插入的转基因拟南芥，进行干旱、耐盐实验。并对转基因植株和对照植株的超氧化 物歧化酶(s叩e雨ide disrautase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)、过氧化 氢酶(catalase,CAT)活性进行检测，研究Z"sr基因对这些与干旱、耐盐相关酶的 调控作用。
8SEQUENCE LISTING
<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物技术重点开放实验室 中国热带农业科学院海口实验站 金，志强 徐，碧玉 王，家保 董，凤英
k菊华
〈120〉 一个增强植物抗旱、耐盐的基因及其编码产物与应用 <■ 2
<170> Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 458
〈212〉 DNA
<213> 蔡枝(Litchi chinensis) 〈220〉
〈221〉 gene
<222〉 (1)..(458)
〈400〉 1
atggaggaag3aaagc3cceiccaccgcggcctcttccacc acaagaaggatg鄉卿ca60
ccggt卿gggcggtgtctactccgagggtggcgtctact ctgaaacggccaccgcatac120
actaeitactt3Ctct3gCg3ggagcagccaaattacccaa atgttgagca3C3cc3caag180
aaagatgaagttgattacaag犯gggiggagaagcaccaca agcatcttgaacaccttgga240
gagctcggtgctgctgctgccggtgcttatgctctgcatg agaagcacaaggcaggga肪300gacccagaga acgctacaag cacaagatac aagaggagat tgctgctgca gccgccgtgg 360
gagccggtgg attcgccttc catgagcacc atgagaagaa ggaggccaga gaagaggaca 420
aggaagct-ca tggcaagaag caccaccacc tgttctaa 458
〈210〉 2
〈211〉 152
〈212〉 PRT
<213〉 蔡枝 (Litchi chinensis)
〈220〉
〈221〉 PRT 〈222〉 (*1)..(152)
<400〉 2
Met Glu Glu Glu Lys His His His Arg Gly Uu Phe His His Lys Lys
1 5 10 15
Asp Glu Glu Thr Pro Val Glu Gly Gly Val Tyr Ser Glu Gly Gly Val
20 25 30
Tyr Ser Glu Thr Ala Thr Ala Tyr Thr Asn Thr Tyr Ser Ser Glu Glu
35 40 45
Gin Pro Asn Tyr Pro Asn Val Glu Gin His His Lys Lys Asp Glu Val
50 55 60
Asp Tyr Lys Lys Glu Glu Lys His His Lys His Leu Glu His Leu Gly 65 70 75 80
Glu Leu Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Tyr Ala Leu His Glu Lys His
85 90 95
Lys Ala Gly Lys Asp Pro Glu Asn Ala Thr Ser Thr Arg Tyr Lys Arg
100 105 110
Arg Leu Leu Leu Gin Pro Pro Trp Glu Pro Val Asp Ser Pro Ser Met115 120 125
Ser Thr Met Arg Arg Arg Arg Pro Glu Lys Arg Thr Arg Lys Leu Met
130 135 140
Ala Arg Ser Thr Thr Thr Cys Ser 145 150
权利要求
1.一个增强植物抗旱、耐盐的基因及其编码产物与应用，其特征在于具有序列表中<400>1项下的序列。
2. 序列表中< 400 >1项下的序列限定的蛋白质，具有序列表中<400 >2 项下的氨基酸残基序列或将序列的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基 的取代、缺失或添加且具有与序列表中< 400 > 2的氨基酸残基序列相同活性的 由序列衍生的蛋白质。
3.种荔枝ABA诱导、胁迫诱导表达基因携带绿色荧光蛋白基因的融合植 物表达载体，其特征在于用权利要求1所述的不含有终止密码子的荔枝ABA诱导、 胁迫诱导表达基因cDNA序列插入植物表达载体pCAMBIA1304的/ 、 Wco / 酶切位点之间。构建成在35S启动子下游含有荔枝ABA诱导、胁迫诱导表达基因 和绿色荧光蛋白基因的植物表达载体。
4.转基因拟南芥，其特征在于用权利要求3中的植物表达载体转化拟南芥， 转基因拟南芥具有较强的抗旱、耐盐性。
全文摘要
本发明涉及一个增强植物抗旱、耐盐的基因及其编码产物与应用，公开了一个与荔枝抗性有关的基因LaAsr1是下列核苷酸序列之一1)序列表中<400>1项下的DNA序列；2)与序列表中<400>1项下限定的蛋白质，具有序列表中<400>2项下的氨基酸残基序列或将虚列的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列表中<400>2项下的氨基酸残基序列相同活性的由序列衍生的蛋白质。该基因可被水分胁迫、盐胁迫诱导表达，能够提高植物的抗旱、耐盐性，对于培育优良的作物品种及通过调控该基因表达提高植物抗议性，具有重要的理论及实际意义。
文档编号C12N15/29GK101643736SQ20091016493
公开日2010年2月10日 申请日期2009年7月24日 优先权日2009年7月24日
发明者刘菊华, 徐碧玉, 王家保, 董凤英, 金志强 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所;农业部热带作物生物技术重点开放实验室;中国热带农业科学院海口实验站