专利名称：一种植物抗旱、耐盐相关蛋白TaAP2及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及 基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱、耐盐相关蛋白 TaAP2及其编码基因和应用。
背景技术：
干旱、盐碱等逆境胁迫是限制植物生长发育和作物产量的主要非生物胁迫因素。 据统计，世界干旱、半干旱地区占全球陆地面积的三分之一，我国干旱、半干旱地区占全国陆地面积的二分之一；还有3.6X107hm2的盐碱地有待开垦利用。小麦作为我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，每年因干旱、盐碱等逆境我国对小麦造成的减产达700-800亿公斤，严重影响着小麦的产量和品质，制约着我国小麦粮食生产的快速发展。因此，改良农作物的抗逆性，选育耐旱、农作物新品，已经成为作物品种改良的重要课题。近年来，随着植物抗逆分子生物学研究的深入，初步揭示了植物对逆境胁迫信号应答、信号传导及基因表达调控等分子机理，为利用基因工程技术改良作物的抗逆性提供了科学依据。目前，通过基因工程技术已将许多抗旱、耐盐、耐低温相关的基因导入到植物中，提高植物的抗逆性已有相关研究报道。近年来，抗逆基因工程的研究重点逐步转向与逆境胁迫相关的调控基因。转录因子大多与生物和非生物胁迫下抗逆基因的表达调控相关，已成为逆境胁迫信号调控网络研究的重点之一。AP2/ERF类转录因子广泛存在于植物，在拟南芥中已发现145个成员，一般分为AP2、RAV、DREB、ERF和AL079349 5个亚族。其中，ERF亚族包括65个基因，大都参与生物和非生物胁迫信号的传导，调控下游功能基因的表达。例如，Cao等分离得到3个水稻 ERF类转录因子OsBIERFl、0sBIERF3和0sBIERF4，其表达受病原菌、盐、低温、干旱等胁迫诱导。Tang等将麻疯树的JcERF基因在拟南芥中过量表达，提高了拟南芥的抗盐性和抗冻性。最近的研究表明，马铃薯StEREBPl基因的过量表达可诱导下游抗性基因表达，并提高转基因马铃薯对高盐和低温胁迫的耐受力。植物在遭受逆境胁迫时会发生一系列生理生化变化。长期盐胁迫将导致叶片中盐分积累，增加植物叶绿素酶的活性。综上所述，AP2/ERF类转录因子在调节植物的逆境反应，提高植物的抗逆性中起着至关重要的作用。过量表达AP2/ERF转录因子基因提高了植物的抗逆能力，转基因植株发育不产生任何负面作用，这对抗逆育种和农业生产会产生巨大推动作用和经济效益。因此， 利用抗逆相关的AP2/ERF类转录因子基因改良和提高作物的抗逆性具有非常重要理论和实践意义。利用抗旱小麦种质资源，挖掘、筛选出优良的抗旱、耐盐相关基因改良小麦的抗逆性，为培育小麦等粮食作物抗旱、耐盐新品种提供重要的抗逆基因资源，对盐渍化土地的治理与改良等方面均具有重要实际意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物抗旱、耐盐相关蛋白TaAP2。
本发明的再一目的是提供编码上述植物抗旱、耐盐相关蛋白TaAP2的编码基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的提供上述植物抗旱、耐盐相关蛋白TaAP2及其基因的应用。本发明所提供的抗旱、耐盐相关蛋白TaAP2，来源于小麦京冬17，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。SEQ ID NO. 1
MAPLSQHHMR IRDALAKRPK TRMLAGFGVK PSAAFSKPAQ LQAQALLPAAQPPRRRVRVL60YEDPDATDSD TDDEEEAAVA APASSKRCFE LFLGKAPPAK VFAKPVTPTAAASAVAACTT120SSAEGHRGVR LRKffGKffAAE IRNPF SGKRE WLGTFDTADL ASAAYQAASRSFIEEKRRRR180GQSVAAASPA RSAASTTPTS SSTTPTASSS SSTSAAPFAH PSPSSVLEATKPADESLSPE240PTPVPVMVST TAETAQLPDD PEFYQDLLRG LQLPDIDPMD FRAGLDALDVSEASAYLDGE300QDLLL⑶FAD EELELDMDLD I⑶DFLEMPG CDFGRGMDDF LQTVDFCV 348根据本发明的TaAP2基因编码上述蛋白，可具有如SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列， TaAP2开放阅读框(ORF)长度为1047bp。SEQ ID NO. 2 atggccccgt tgagccagca ccacatgcgc atcagggacg cgctggccaa aaggcccaag60accaggatgc tcgccgggtt cggcgtcaag ccctccgccg ccttctccaa gccggcgcag 120ctgcaggcgc aggcgctgct gcccgccgcg cagccgccga ggcggcgcgt gcgcgtcctg 180tacgaggacc ccgacgccac cgactccgac accgacgacg aggaggaggc ggcggtcgcc 240gcacctgctt cgtccaagcg ctgcttcgag ctgttccttg gcaaggcccc gccggccaag 300gtgtttgcca agccggtcac tccgaccgcc gctgcttctg ctgtcgctgc ctgcaccacc 360agcagcgccg agggccaccg cggtgtgcgc ctccgcaagt ggggcaagtg ggcggccgag 420atccgcaacc cgttctccgg caagagggag tggcttggca ccttcgacac cgccgacttg 480gcctccgccg cctaccaggc cgcctcccgg agctttatcg aggagaagcg tcgccgccgt 540ggccagtctg tggccgcggc ctcgcccgct cggtctgctg cgtcaacaac accgacgtcg 600tcttctacta caccgacggc atcttcgtcg tcctccacct ctgctgctcc gttcgcgcac 660ccgtcgccgt cctctgtcct tgaagccacg aagccagcag atgagtccct gtcgcctgag 720ccgactccag ttccggtcat ggtgtccacc acggctgaga ccgcgcagct gcctgacgac 780ccagagttct accaggacct cctgcgcggt cttcagctgc cggacatcga cccgatggac 840ttccgcgccg ggcttgatgc cctggacgtc tccgaggcgt cggcttactt ggacggcgaa 900caggacctgc tgctcggtga cttcgccgat gaggagctgg agctggacat ggacctcgac 960atcggcgacg acttcctgga gatgcccggc tgcgacttcg gccgaggcat ggatgatttc 1020ctgcaaaccg tcgatttctg cgtgtga1047另外，干旱和高盐胁迫处理表达实验表明TaAP2基因受干旱诱导强烈表达，对高盐处理敏感。同时，构建该基因的过量表达载体并通过农杆菌介导的叶盘转化法将TaAP2 转入烟草，PEG胁迫处理实验表明转TaAP2基因烟草具有抗旱性，证明了 TaAP2基因在烟草中成功表达，且提高了烟草的抗旱能力，可以作为烟草抗旱育种的优质候选基因。本发明的另一个目的是提供一种培育抗旱、耐盐植物的方法。本发明所提供的培育抗旱耐盐植物的方法，是将上述任一种含有TaAP2基因的重组表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物。所述植物耐逆性具体可为对非生物胁迫的耐逆性，如对干旱或盐胁迫的耐逆性。本发明以抗旱、耐盐性较强小麦京冬17 (Triticum aestivum L.)为实验材料，得到了抗旱、耐盐性TaAP2基因，并将其导入烟草，显著提高了植物的抗旱、耐盐性。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因对改良、增强植物抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。
图1 TaAP2基因在逆境诱导下的表达模式分析，A、将小麦幼苗从土中取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，分别在0、1、2、5、10、24小时取样提取RNA，进行干旱胁迫表达特性分析；B、将小麦幼苗置于200mM NaCl溶液中，分别在0、1、2、5、10、24小时取样提取 RNA，进行高盐胁迫表达特性分析；C、将小麦幼苗置于4°C中，分别在0、1、2、5、10、24小时取样提取RNA，进行冷胁迫表达特性分析。图2 35S_TaAP2转基因烟草耐旱、耐盐性鉴定，A、35S_TaAP2转基因烟草和W38(对照)在含有200mMNaCl培养基上的生长情况；B、35S_TaAP2转基因烟草和W38 (对照)在含有2% PEG培养基上的处理0天生长情况；C、35S-TaAP2转基因烟草和W38 (对照)在含有 2% PEG培养基上的处理60天生长情况。
具体实施例方式以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》 (第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。实施例1、TaAP2基因的克隆及序列基序分析1、将25°C光照培养2周左右的小麦京冬17植株进行干旱、高盐(200mM NaCl)胁迫处理，分别在他^！！二！！力！^川！！二处后取样，迅速置于液氮冷冻，-80°C保存备用。根据 RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)完成植物叶片组织的总RNA提取，之后以提取的总RNA为模板，以AP序列为引物，用反转录酶(M-MLV)进行反转录，得到用于后续实验的cDNA模板。设计一对引物Taap2-F 5， -TAAGAGGAGGAAGAAGAAGAGGCAG-3，Taap2-R 5’ -GCCCATCACACCACAGCATT-3’本发明得到一个基因TaAP2，TaAP2开放阅读框(ORF)长度1047bp，编码348个氨基 酸，在NCBI上比对分析，最高一致性最高仅在66%，证明为新基因实施例2、逆境胁迫处理下小麦TaAP2基因的表达特征将小麦种子种在盆中，生长3周后取幼苗进行如下胁迫处理1)干旱处理将新疆偃麦草幼苗从土中取出吸干根 上的水分，置于干燥的滤纸上；2)盐处理将新疆偃麦草幼苗置于200mM NaCl溶液中；分别在上述各种处理后O、1、2、5、10、24小时取样，用液氮速冻，-80°C保存备用。分别将干旱处理、盐处理后0、1、2、5、10、24小时的样品提取总RNA，以TaAP2DNA为探针(序列表中的序列1)，进行荧光定量分析。半定量分析结果见图2。A为干旱处理的样本；B为NaCl处理的样本。结果表明在干旱胁迫1小时TaAP2基因表达达到高峰；在高盐(200mM NaCl)胁迫1小时TaAP2基因表达达到高峰，在冷胁迫2小时TaAP2基因表达达到高峰，说明该基因受干旱、高盐和冷胁迫诱导表达。实施例3、转TaAP2基因植株耐旱、耐盐性鉴定1、重组表达载体的构建以小麦的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有SmaI和XbaI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后SmaI和XbaI双酶切PCR产物，回收，将酶切产物正向插入载体 PBI121的CaMV 35S启动子之后的SmaI和XbaI酶切位点之间，得到重组载体353_TaAP2。引物序列如下ErNAC7[SmaI]5'-GCGCCCGGGatggccccgttgagccagca-3，ErNAC7[XbaI]5， -TGCTCTAGA agtgtgcgtctttagct-3，2、转基因烟草的获得和鉴定将上述构建的重组表达载体35S_TaAP2分别用冻融法转化根癌农杆菌EHA105，再用叶盘法分别将整合有35S-TaAP2的根癌农杆菌EHA105转化烟草W38，用含100mg/L卡那霉素的MS培养基进行2轮筛选，每轮筛选10-15天，得到阳性转基因植株。将筛选得到的阳性转基因植株用PCR做进一步鉴定筛选，PCR所用的一对引物为P3和P4。P3 (上游引物)5，-TCGCCGTCCTCTGTCCTTGA-3，，P4 (下游引物)5，-AGGTCCTGTTCGCCGTCCAA-3，。对35S_TaAP2转基因烟草进行PCR鉴定，阳性转基因植株经PCR扩增可获得240b 左右条带，结果获得转35S-TaAP2烟草40株。同时将pBI121空载体导入烟草W38，方法同上，作为对照，获得10个株系的转空载体烟草(筛选获得的转基因烟草用T1代表示)。将T1代转35S_TaAP2基因烟草种子及T1代转空载体对照植株的3周龄苗的根系分别移入含有200mM NaCl的培养基中进行盐胁迫处理60天，观察表型并拍照。结果表明胁迫处理60天后，35S-TaAP2转基因植株在盐胁迫条件下能够正常生长，根系发达、叶片颜色深绿；所有空载体转基因植株叶片、根系生长缓慢。转基因烟草耐盐性鉴定结果证明TaAP2 基因可以提高植物耐盐性。将T1代转35S_TaAP2基因烟草种子及T1代转空载体对照植株的3周龄苗的根系分别移入含有2%PEG的培养基中进行干旱胁迫处理60天，观察表型并拍照。结果表明胁迫处理60天后，35S-TaAP2转基因植株在干旱胁迫条件下能够正常生长，根系发达、叶片颜色深绿；所有空载体转基因植株叶片生长缓慢。转基因烟草耐旱性鉴定结果证明TaAP2基因可以提高植物的耐旱性。
权利要求
1.植物抗旱、耐盐相关蛋白TaAP2，其特征在于，其具有如SEQID NO. 1所示的氨基酸序列。
2.植物抗旱、耐盐相关基因TaAP2，其特征在于，编码权利要求1所述的蛋白。
3.如权利要求2所述的植物抗旱、耐盐相关基因TaAP2，其特征在于，其具有如SEQID NO. 2所示的碱基序列。
4.包含权利要求2或3所述植物抗旱、耐盐相关基因TaAP2的重组载体
5.权利要求1所述植物抗旱、耐盐相关蛋白TaAP2的应用。
6.权利要求2所述植物抗旱、耐盐相关基因TaAP2的应用。
7.一种培育抗旱、耐盐植物的方法，所述方法包括将含有权利要求2所述TaAP2基因的重组表达载体导入植物细胞中、得到抗旱植物的步骤。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱、耐盐相关蛋白TaAP2及其编码基因和应用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因对改良、增强烟草抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。
文档编号C12N15/82GK102206260SQ20111007672
公开日2011年10月5日 申请日期2011年3月29日 优先权日2011年3月29日
发明者唐益苗, 张朝, 张风廷, 柳珊, 赵昌平, 陈京瑞, 马锦绣, 高世庆 申请人:北京市农林科学院