专利名称：一种与植物耐盐性相关的miRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及与一种植物耐盐性相关的miRNA，其为一种来源于盐芥的、能够调节植物耐逆性尤其是耐盐性的新的miRNA，通过该miRNA的转基因技术可提高作物的耐盐性。本发明还涉及此miRNA的前体、其前体的编码基因及其用途。属于生物技术领域。
背景技术：
土壤盐溃化已成为影响农作物生长发育、产量和品质的一个重要因素，是农作物减产的主要原因之一。目前，世界上约有20%的可耕地和至少40%的灌溉田具有不同程度的盐溃化，随着人口的剧增及工业化的高速发展，可耕地面积急剧下降，不合理灌溉、工业污染的加剧和化肥使用不当，造成了大量良田的次生盐溃化，预计到2050年全球将有50%的耕地发生不同程度的盐溃化(Zhu，2001)。自然界中，植物对盐的适应有明显的差异，适应范围非常广泛，既有盐敏感的甜土植物，又有耐盐的盐生植物(Zhu，2001)。由于大多数农作物为盐敏感的甜土植物，盐依然是影响农作物产量的主要限制因子。目前，对植物耐盐机理的研究已有相当的进展，例如朱健康实验室关于拟南芥S0S1、S0S2、S0S3途径的发现及其耐盐机理的阐明(Zhu，2002)，Blumwald实验室过量表达AtNHXl对于提高植物耐盐型所产生的影响(Blumwald’et al，1999)等。但目前国际上对植物耐盐机理的研究，主要集中于甜土植物，因而对于植物耐盐性机理的了解还存在一定的局限性。miRNA为广泛存在于真核生物中大约21_24nt的非编码RNAs，植物miRNAs大多为靶向转录因子等调控蛋白，从而处于植物基因表达调控的中心位置。而逆境胁迫(盐、硫或磷匮乏和氧化胁迫等)不仅会诱导植物蛋白质编码基因的表达，也诱导一些非蛋白质编码基因miRNA的表达。植物miRNAs是目前国际研究的热点，但仅有少数实验室关注耐盐相关miRNAs，且主要是以模式植物拟南芥和水稻等为试材，例如在拟南芥、水稻和杨树等物种中克隆到与盐、磷缺乏、硫缺乏、氧化和力学胁迫等相关的miRNAs ;结果表明miRNAs作为革巴蛋白的负调节因子，其调节功能不仅在于植物发育、也在对盐等逆境胁迫的应答等过程中担任重要的调控作用(Sunkar, et al, 2004, 2005, 2007; Jones-rhoades, et al, 2004;Mica, etal,2006)ο盐芥(Thellungiella salsuginea)是与拟南芥近缘的植物耐盐分子遗传学研究的新模式系统(Bressan，et al, 2001 )，芥的基因组测序已由美国农业部在2011年底完成，其基因组序列网站参见:http://www.phytozome.net/thellungiella.php。盐芥和拟南芥同为十字花科植物，在cDNA水平上两者存在90%-95%的相似性。但相对于甜土植物拟南芥，盐芥为一种典型的盐生植物，能天然适应于盐胁迫的环境，即使短时间暴露于500mM NaCl也可完成其生长史(Inan，et al，2004 ；Taji, et al，2004)。随着盐芥基因组测序的完成，盐芥功能基因组学尤其是耐盐相关基因的功能已成为其研究工作的重点。
鉴于土壤盐溃化已成为限制农业生产的主要因素之一，通过研究植物耐盐胁迫的生理生化和分子生物学机制，挖掘耐盐基因资源，并运用基因工程手段培育耐盐作物，对于提高农作物的产量具有重要的现实意义。因而，以盐芥这一耐盐分子遗传学研究的新模式系统为试材，进行其miRNAs及其与耐盐性关系的研究，具有一定的前瞻性和创新性。另外，在可检索的现有技术中，对盐芥miRNAs的研究还未见报道。
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发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种新的与植物耐盐相关的、来源于盐芥的miRNA——tsa-miRn646、以及其前体序列及其前体序列的编码基因，利用该miRNA进行作物的遗传转化可培育耐盐作物，进而可提高农作物产量。本发明是通过以下技术方案实现的:
一种与植物耐盐性相关的miRNAs，命名为tsa-miRn646，其具有序列表中SEQ IDNO:1所示的序列。上述与植物耐盐性相关的miRNAs的前体序列，其具有序列表中SEQ ID NO: 2所示的序列。编码上述与植物耐盐性相关的miRNAs前体序列的DNA序列，其具有序列表中SEQ ID NO:3所示的序列(SEQ ID NO:3所示的序列为编码tsa_miRn646前体的DNA，tsa-miRn646前体在DNA的负链上)。上述与植物耐盐性相关的miRNAs在培育耐盐转基因作物中的应用。作为上述应用的一种优选技术方案，在作物如小麦、水稻、玉米、棉花中过表达SEQID NO:1所示的miRNA或者SEQ ID No:2所示的miRNA前体，或抑制SEQ ID NO:1所示的miRNA或者SEQ ID No:2所示的miRNA前体的表达，培育出具有高耐盐性的转基因作物。本发明的实验证明，Solexa测序具有高灵敏度和准确性的优点，从Solexa测序结果可看出tsa-miRn646受盐胁迫的调节,进一步使用实时定量PCR技术对这一结果进行了验证，说明tsa-miRn646在盐芥的耐盐机制中起重要作用。鉴于此，可利用该基因进行耐盐转基因作物的培育，进而对于提高作物的产量具有潜在的应用价值。本发明的优点在于:本发明采用先进的Solexa高通量测序技术及随后的生物信息学分析和实时定量PCR技术,首次从盐芥中鉴定了 tsa-miR646, tsa-miR646的Solexa计数在对照和200mM NaCl处理的小RNAs库中分别为646和3201，其表达上调了 5倍。预测tsa-miRn646的靶基因为MYB、bZIP和bHLH转录因子，而bZIP、MYB以及MYC/bHLH转录因子在植物的非生物胁迫应答中均 发挥重要的调控作用，且植物的代谢调控网络主要通过多种转录因子如MYB和bHLH间的相互作用来实现对靶基因的组合调控。表明tsa-miRn646广泛参与盐芥多种生命活动的调节，对盐胁迫等逆境的适应等方面也具有关键的调控作用。因而，本发明提供的tsa-miRn646具有重要的生物学意义和潜在的应用价值。
图1:tsa-miRn646前体序列的二级结构图，阴影部分为成熟miRNA所在位置。其前体序列折叠成一种稳定的茎环结构，能量值为-23.4。属于miRNA前体典型的二级结构，符合miRNA前体的结构特征。图2:Solexa测序显示tsa_miRn646在对照和盐处理下的表达丰度。图3:Stem-loop实时定量PCR结果显示tsa_miRn646在对照和盐处理下的表达情况。图4:tsa-miRn646对靶基因MYB、bZIP和bHLH的mRNA降解示意图。
具体实施例方式
以下实施例详细说明本发明，但不限于此。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1:盐芥种子采集和种植在山东省东营市黄河三角洲盐碱地收集野生型盐芥(Thellungiellasalsuginea,山东生态型)种子，晒干,经过表面消毒:70%酒精,处理lmin, l%NaC10溶液，润旋10-15min,灭菌双蒸水冲洗后播种于MS培养基的培养皿中，光照培养箱的温度设定:白天25°C，16h，晚间22°C，8h。待长出2片真叶后转移到Hogland液体培养基上，培养5周左右后，Hogland营养液中加入NaCl使其终浓度为200mM，培养24小时，对照仍为不含NaCl的Hogland营养液。实施例2:盐芥miRNA文库的构建和Solexa测序将盐芥对照组(CL)和NaCl处理组(TL)的样品，送往深圳华大基因研究所构建miRNAs文库，进行Solexa测序。测序后去除3’接头、污染序列、小于18nt序列和polyA序列后，在盐芥CL miRNA文库中总共获得高质量小RNA序列(sRNA) 12010658条，在TLmiRNA文库中总共获得高质量小RNA序列(sRNA) 12330771条。生物信息学预测结果显示tsa-miRn646 成熟体序列为 UGAAGGAUCGAGGUCGAGGCA。tsa_miRn646 前体序列为 AATAACAAGGTGAAGGATCGAGGTCGAGGCAGTATTGATATAGATTCAGCTCGTCCTTCACCGGTGCAAC,在基因组中位置为:scaffold_6:6637138:6637207:-。根据tsa_miRn646的前体和成熟体序列，用软件RNAstructure画出tsa_miRn646前体的二级结构,如图1所示，阴影部分为成熟miRNA所在位置，其前体序列折叠成一种稳定的茎环结构，能量值为-23.4。属于miRNA前体典型的二级结构，·符合miRNA前体的结构特征。Solexa测序结果显不tsa_miRn646在正常条件下的丰度为646, 200mM NaCl处理后的丰度为2301。表明tsa-miRn646的表达在受到盐胁迫后明显上调(图2)。预示着tsa-miRn646在盐芥适应高盐胁迫机制中担任重要作用，从而在农作物(例如玉米、小麦、水稻、油菜、大豆等)中过量或者抑制tsa-miRn646的表达,将影响作物对盐胁迫的适应能力。实施例3:实时定量PCR验证tsa_miRn646在对照和200mM NaCl处理下的表达水平(I) tsa-miRn646反转录及Stem-1oop定量PCR的引物设计:根据tsa-miRn646成熟miRNA的序列和内标基因-盐芥U6的序列，设计
stem-loop PCR 引物如下:I)tsa_miRn646 Stem-loop RT primer:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGCCT，2)tsa-miRn646 Forward primer:CGGCTGAAGGATCGAGGTCG,3)tsa-miR n646 Reverse primer:GTGCAGGGTCCGAGGT,4)U6-Forward primer:GATAAAATTGGAACGATACAG,5)U6-Reverse primer:ATTTGGACCATTTCTCGATTT0如序列表中SEQ ID N0:4 8所示。(2)盐芥miRNA的提取盐芥样品的处理和收集同实施例1。盐芥miRNA的提取使用天根(Tiangen) miRNA提取试剂盒,具体方法为:I)将IOOmg植物组织在液氮中磨碎，加Iml裂解液MZ，用匀浆仪进行匀浆处理；2)将匀浆样品在室温放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离；3) 40C 12，OOOrpm离心5分钟，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中；4)加入200 μ I氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟；5) 40C 12，OOOrpm离心15分钟,样品会分成三层:黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液MZ试剂的50%。把水相转移到新管中，进行下一步操作；6)量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积0.43倍的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入miRspin column中，室温12，OOOrpm离心30秒,离心后弃掉miRspincolumn,保留流出液；7)量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积0.75倍的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入miRelute column中，室温12，OOOrpm离心30秒,离心后弃掉流出液，保留 miRelute column ；8)向miRelute column中加入500 μ I去蛋白液MRD，室温静置2分钟，室温12，OOOrpm离心30秒,弃废液；9)向miRelute column中加入700 μ I漂洗液RW，室温静置2分钟，室温12，OOOrpm离心30秒，弃废液；10)向miRelute column中加入500 μ I漂洗液RW，室温静置2分钟，室温12，OOOrpm离心30秒,弃废液；11)将 miRelute column 放入 2ml 收集管中，室温 12，OOOrpm( 13，400 X g)离心 I
分钟，去除残余液体；
12)将 miRelute column 转入一个新的 1.5ml 离心管中，加 15 - 30 μ lRNase-freeddH20,室温放置2分钟，室温12，OOOrpm离心2分钟。(3) miRNA 的反转录1)在灭菌的RNase free的200 μ 1离心管中分别加入:以上提取的盐芥miRNA5 μ 1, stem-loop RT primer (U6 基因则用 U6reverse primer 作为逆转录引物)1 μ 1，ddH207 μ 1 ;PCR仪上65°C保温5min，然后冰上2min，简单离心。2)在上面的反应体系内再分别加入:5XFirst_Strand Buffer4 μ 1, RNAaseinhibitor (40U/ μ 1)1 μ 1，dNTP mix (IOmM) 1 μ 1, Reverse Transcripase (200U/ μ 1) 1 μ 1，混匀。3)PCR 仪上进行如下反应:16°C 30min, (30°C 30s，42°C 30s, 50 °C 10s)60 个循环，85°C 5min，16°C结束。4)以上得到的盐芥miRNAs反转录体系，稀释10倍。(4) Stem-1oop实时定量PCR和结果分析1)反应管中分别加入:ddH2012 μ 1, tsamiRn646 的 Forward primer (10 μ Μ) I μ 1、Reverse primer (10 μ Μ) I μ I (U6 内参基因则用 U6_forward primer 和 U6_reverseprimer), 5X SYBR Green I master mix 4 μ I,取步骤3 中 miRNAs 反转录模板2 μ I,使反应的总体积为20 μ 1。每一个反应设3个重复。2)定量 PCR 仪(ABI StepOne Real-Time PCR System)上进行如下反应:94°CIOmin, (94°C 15s, 60°C 10s) 40 循环，72°C 25s，结束反应。3)2_ΛΛετ方法进行定量PCR结果分析。ACT表示同一处理条件下，miRNA和内标基因(U6) CT值的差异；Λ Λ CT表示200mM NaCl处理的盐芥tsa_miRn646与对照即没有NaCl处理情况下tsa-miRn646的CT差值，2-ΔΔετ则表示盐芥200mM NaCl处理较之于对照条件下tsa-miRn646表达量的相对变化。结果表明，tsa_miRn646在盐处理后表达量上调了 5倍(如图3所示),与Solexa测序结果趋势一致。实施例4:tsa-miRn646祀基因的验证和功能分析利用miRNA和靶基因的互补性，可以通过生物信息学的方法在盐芥全基因组水平预测 tsa_miRn646 的祀基因。按照Schwab等的方法(Schwab R et al., Specific effectsofmicroRNAs on plant transscriptome.Dev.Cell, 2005)使用以下规则:sRNA与祀基因间的错配不得超过4个(G-U配对认为0.5个错配)；在miRNA/靶基因复合体中不得有超过2处发生相邻位点的错配；在miRNA/靶基因复合体中，从miRNA的5’端起第2_12个位点不得有相邻位点都发生错配；miRNA/靶基因复合体的第10-11个位点不得发生错配^miRNA/靶基因复合体中，从miRNA的5’端起第1-12个位点不得有超过2.5个错配;miRNA/靶基因复合体的最低自由能(MFE)应不小于该miRNA与其最佳互补体结合时MFE的75%。用Mireap软件在盐芥全基因组水平上进行靶基因的预测。预测结果显不tsa_miRn646有至少3个祀基因(预测结果见表I),它们均为转录因子，分别为MYB、bZIP和bHLH (核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:9、ll、13所示，氨基酸序列如序列表中SEQ ID勵:10、12、14所示)，且〖8&-1^1 11646对靶基因的切割位点均在靶基因的编码区(见图4:tsa-miRn646对靶基因MYB、bZIP和bHLH的mRNA降解示意图)。研究表明，MYB转录因子普遍存在于植物体内，是植物体内最大的一类转录因子，广泛参与植物的生长发育和代谢调控，在生物和非生物胁迫中也发挥重要的作用，拟南芥中MYB类转录因子通过与下游靶基因的启动子TAACTG核心序列结合后诱导抗胁迫基因的表达。bZIP转录因子也广泛存在于植物体内，并在植物生长发育和感受外界干旱、高盐、激素和病害信号反应等方面做出响应，拟南芥在逆境诱导下4种bZIP型转录因子——ABF1、ABF2B1、ABF3 和 ABF4 / AREB2 被激活后结合到 ABRE (ABA responsive element)上，而ABRE元件常含有bZIP蛋白的结合序列，即通过ABRE与bZIP蛋白之间的相互作用，使下游许多耐盐和耐早等抗性相关的基因得以表达。总之，转录因子bZIP、MYB以及MYC/bHLH在植物的非生物应答中均发挥重要的调控作用，且植物的代谢调控网络主要通过多种转录因子如MYB和bHLH间的相互作用来实现对靶基因的组合调控。tsa-miRn646同时靶向上述3类转录因子，进而实现对其表达的调控，这对于揭示盐芥的耐盐机理是可鉴的研究思路，同时也预示着tsa-miR646在盐芥的耐盐机制中可能担任重要的作用，因而具有广泛的应用前景和经济效益的预期。表ltsa_miRn646革巴基因预测
权利要求
1.一种与植物耐盐性相关的miRNA，其特征在于:其具有序列表中SEQ ID NO:1所示的RNA序列。
2.权利要求1所述的与植物耐盐性相关的miRNA的前体序列，其特征在于:其具有序列表中SEQ ID N0:2所示的RNA序列。
3.编码权利要求2所述的与植物耐盐性相关的miRNA的前体序列的DNA序列，其特征在于:其具有序列表中SEQ ID NO: 3所不的DNA序列。
4.权利要求1所述的与植物耐盐性相关的miRNA/权利要求2所述的与植物耐盐性相关的miRNA的前体序列在促进转录因子MYB基因的mRNA降解中的应用或/和在抑制转录因子MYB基因表达中的应用；所述转录因子MYB基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示；所述转录因子MYB基因的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示。
5.权利要求1所述的与植物耐盐性相关的miRNA/权利要求2所述的与植物耐盐性相关的miRNA的前体序列在促进转录因子bZIP基因的mRNA降解中的应用或/和在抑制转录因子bZIP基因表达中的应用；所述转录因子bZIP基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO: 11所示；所述转录因子bZIP基因的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 12所示。
6.权利要求1所述的与植物耐盐性相关的miRNA/权利要求2所述的与植物耐盐性相关的miRNA的前体序列在促进转录因子bHLH基因的mRNA降解中的应用或/和在抑制转录因子bHLH基因表达中的应用；所述转录因子bHLH基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO: 13所示；所述转录因子bHLH基因的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 14所示。
7.权利要求1所述的与植物耐盐性相关的miRNA/权利要求2所述的与植物耐盐性相关的miRNA的前体序列/权利要求3所述的编码与植物耐盐性相关的miRNA的前体序列的DNA序列在耐盐转基因植物培育中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:在作物中过表达SEQID ΝΟ:1所示的miRNA或者SEQ ID No:2所示的miRNA前体，或在作物中抑制SEQ ID NO:1所示的miRNA或者SEQ ID No:2所示的miRNA前 体的表达，从而培育出具有高耐盐性的转基因植物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述作物为小麦、水稻、玉米或棉花。
全文摘要
本发明公开了一种来源于盐芥的与植物耐盐性相关的miRNA，命名为tsa-miRn646，其具有序列表中SEQ ID NO:1所示的RNA序列，其前体序列具有序列表中SEQ ID NO:2所示的RNA序列。本发明的tsa-miRn646可促进转录因子MYB、bZIP和bHLH基因的mRNA降解，抑制转录因子MYB、bZIP和bHLH基因的表达。在作物如小麦、水稻、玉米、棉花中过表达SEQ ID NO:1所示的miRNA或者SEQ ID No2所示的miRNA前体，或抑制SEQ ID NO:1所示的miRNA或者SEQ ID No2所示的miRNA前体的表达，可培育出具有高耐盐性的转基因作物。本发明的tsa-miRn646在耐盐作物的培育中具有重要的意义和潜在的应用价值。
文档编号C12N15/113GK103114091SQ20131005784
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月22日 优先权日2013年2月22日
发明者张荃, 赵传志, 王兴军, 孙伟, 赵宝添, 刘艳, 张权, 赵彦修 申请人:山东师范大学