专利名称：一种大肠杆菌生物膜检测方法-96孔半定量法的制作方法
技术领域：
本发明涉及大肠杆菌生物膜检测方法-96孔半定量法。
背景技术：
细菌生物膜(Bacterial biofilm, BF)是相对于单个分散的浮游状态的细菌(planktonic cells)生存形式而言的一种独特的细菌生存形式。Costerton等将其定义为:附着于有生命或无生命物体的表面，被细菌分泌的胞外黏质包裹的，具有高度组织化的细胞群体结构。BF是细菌在表面生活时采取的一种生长方式，它是细菌的一种本能，某一菌株能否形成BF，是与其所处的环境密切相关的，如环境中的营养成分、温度、渗透压、pH、铁离子浓度和氧化还原电位等因素，其中，营养成分对BF的形成具有重要作用。生物膜是附着在固体表面的微生物群体，这些细胞镶嵌在多聚物的外表面，展现出许多表型的改变，当细菌受到各种压力，如极端的营养缺乏或过剩，低PH值，高渗透压，氧化，抗菌剂和抗生素等，大量的细菌为了对抗不利的环境，通过自身合成的水合多聚物粘附在固体表面，以同着的方式生长从而形成生物膜，这是细菌所具有的一种非常重要的环境适应机制。生物膜的形成涉及到几个明显的阶段，包括:起始的附着、细胞与细胞之间的吸附与增殖、生物膜的成熟、及最后细菌的脱离过程等四个阶段。能形成生物膜相关感染的细菌，主要包括革兰氏阳性的肠球菌、葡萄球菌、链球菌和革兰氏阴性的大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、变形杆菌、沙门氏菌和铜绿假单胞菌等。生物膜与人类的 生产生活关系非常密切，一方面它可以黏附杂质，清洁污水，可作为污水处理的优良载体；另一方面，致病细菌不仅可直接在人体组织及器官的表面形成生物膜，引起诸如牙周病、慢性支气管炎、败血病、肺部感染和心内膜炎等难治疾病，而且可在植入人体内的医疗装置(如隐型眼镜、人工关节和心脏人工瓣膜等)的表面形成生物膜，从而导致一系列的感染并发症。据估计，大约65%的人类细菌性感染是由细菌生物膜引起的。由于生物膜有较强的耐药性，难以控制，往往引起严重的感染生物膜的研究一直是微生物学、医学、环境科学等领域中的热点问题。大肠杆菌能否形成生物膜与细菌粘附结构(P菌毛、I型菌毛、F9菌毛)、细菌毒性物质如溶血素、细胞坏死因子，细胞毒力因子、及铁载体有关系。毒力因子在细胞粘附、杀伤宿主细胞及细菌所生存的环境因素中等方面密切相关。大肠杆菌能在口腔、尿道、生殖道、肠道等形成生物膜，引起反复感染。目前对细菌生物膜形成能力的测定通常采用半定量的方法，其中包括试管法、微孔法、Robbin氏法和利用特异性抗体的western blot检测等方法。微孔法也为实验室广泛采用的方法，因其可较高通量的仪器检测染色值而适用于大量细菌生物膜形成的比较和筛选。目前的半定量法具有可比性差，重复性低，不易观察、不易操作等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大肠杆菌生物膜检测方法-96孔半定量法，所述方法以大肠杆菌为实验材料，通过将其复苏、活化，常规培养至对数生长期、测定0D600、释稀OD600nm值至0.01、上96孔板、37°C培养、洗板、固定、染色、溶解、测定等步骤，得到大肠杆菌生物膜阳性。该方法具有可比性强，重复性高，易操作等优点。可用于大批量大肠杆菌生物膜的筛选工作。为实现上述目的，本发明所采用以下方案:96孔半定量法。包括以下步骤:(I)复苏菌株:从-70°C冰箱中取出甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取100 μ L菌液接种于5mL LB液体培养基中，于37°C过夜震荡培养。(2)固化菌株:将菌液接种于麦康凯固体培养基中。置于37°C恒温培养箱内培养24h。(3)菌株培养至对数生长期:从麦康凯培养基中挑取红色单菌落，接种到新鲜的LB液体培养基，37°C恒温振荡培养16h。再按1: 100倍稀释:取培养的菌液50 μ L于新鲜的5mL LB试管液体培养基上，于37°C缓慢震荡4.5h，保证细菌处于对数生长期。(4)稀释菌数:测OD6tltlnm，用灭菌的M9培养基将所测OD6tltol值稀释至0.01。(5)上96孔板:取200 μ L稀释至0.01菌液加入96孔U型平底板中，用Μ9液体培养基作为空白对照。于37 °C恒温箱中分别培养8h，24h，32h，48h和72h。(6)洗板:将培养好的96孔U型平底板从恒温箱中取出，弃菌液。用I % PBS缓冲液洗三次，弃洗液，拍干。(7)固定:将甲醇放入96孔U型平底板中固定15min,晾干。(8)染色:用1%结晶紫溶液加入板中，染色5min，自来水缓慢冲洗多次,晾干,观察板底部有无生物膜形成。(9)溶解和测定0D600:用33%的冰醋酸加于96孔:板中，待生物膜完全溶解后，用全波长酶标仪中测定OD6tltol,测定OD6tltol值减去空白对照孔的OD6tltol值大于等于0.12则可为生物膜阳性。本发明所述所述结晶紫购置Baso产品，使用浓度为1% ；LB培养基、5xM9培养基为BD Falcon产品，使用浓度为Ix M9 ;所用96孔板为(3599)购自Corning Costar产品；所用甲醇为分析醇。全波长酶标仪为PowerWave XS美国生产。本发明的优点是:本发明基于大肠杆菌生物膜形成能力及形成过程作比较，形成的96孔半定量法具有可比性强，重复性高，易观察、易操作等优点。可明显获得大肠杆菌生物膜生长曲线。
:图1为本发明实施例提供的大肠杆菌生物膜检测方法-96孔半定量法的流程图；图2:本发明实施例提供的23株大肠杆菌生物膜生长曲线图3:本发明实施例提供的7号菌在不同(时间、温度、培养基)条件下生物膜形成的结果图4:本发明实施例提供的13-2号菌在不同(时间、温度、培养基)条件下生物膜形成的结果图5:本发明实施例提供的号菌在两种不同96孔板上生物膜形成的结果 图6:本发明实施例提供的13-2号菌在两种不同96孔板上生物膜形成的结果
图7本发明实施例提供的生物膜在进口 96孔板生长情况。图8本发明实施例提供的生物膜在国产96孔板生长情况。分别选取两株大肠杆菌(7号和13-2号)进行、不同96孔板、不同培养温度、不同培养基的条件下对大肠杆菌生物膜形成能力的比较实验。
具体实施方式
:下面通过实施案例对本发明进行具体描述:实施案例1:取(7号和13-2号大肠杆菌)甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取100 μ L于5mL LB中，在37°C的摇箱中摇16h,在麦康凯琼脂基上活化。挑取麦康凯培养基上的单菌落，接种于5mL LB中，在37°C振摇16h。取培养好的细菌50 μ L于5mL LB中，在37°C震摇 4.5h，测 0D_，实验分组:(一)用M9培养基将所测OD值稀释至0.01。(二)用LB培养基将所测OD值稀释至0.01(三)用TSB培养基将所测OD值稀释至0.01取96孔板进行上板，每孔加200 μ L稀释的菌液，重复6孔，分别用所稀释培养基(Μ9、LB、TSB)做空 白对照。37°C培养不同时间8h、24h、48h、72h。将培养好的96孔U型平底板从恒温箱中取出，弃菌液。用1\ 85洗3次，甲醇固定1511^11，拍干后，加入1(^/1结晶紫染色5min，自来水冲洗后拍干，加入Φ =33%冰醋酸溶解，半小时后测D0_，测定值减去空白对照值大于0.12为生物膜阳性。实施案例2:取(7号和13-2号大肠杆菌)甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取100 μ L于5mL LB中，在37°C的摇箱中摇16h,在麦康凯琼脂基上活化。挑取麦康凯培养基上的单菌落，接种于5mL LB中，在37°C振摇16h。取培养好的细菌50 μ L于5mL LB中，在37°C震摇 4.5h，测 OD600,实验分组:(一)用M9培养基将所测OD值稀释至0.01。(二)用LB培养基将所测OD值稀释至0.01(三)用TSB培养基将所测OD值稀释至0.01取96孔板，每孔加200 μ L稀释的菌液，重复6孔，分别用所稀释培养基(Μ9、LB、TSB)做空白对照。30°C培养不同时间8h、24h、48h、72h。将培养好的96孔U型平底板从恒温箱中取出，弃菌液。用IXPBS洗3次，甲醇固定15min，拍干后，加入10g/L结晶紫染色5min,自来水冲洗后拍干，加入Φ = 33%冰醋酸溶解，半小时后测D0_，测定值减去空白对照值大于0.12为生物膜阳性。图3:为7号菌在不同(时间、温度、培养基)条件下生物膜形成的结果图4:为13-2号菌在不同(时间、温度、培养基)条件下生物膜形成的结果由图3和图4可知:7号菌和13-2号菌形成生物膜的能力强的培养条件:(1)37°C优于30°C (2)M9培养基中优于LB和TSB培养基。两株实验菌株均在8h出现初黏附、24_48h之间出现黏附与增长、48h生物膜呈现成熟期，72h出现脱落。由此得出:实验菌株生物膜的培养条件:在37°C、M9培养基、培养24_48h实施案例3:取(7号和13-2号大肠杆菌)甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取100 μ L于5mL LB中，在37°C的摇箱中摇16h,在麦康凯琼脂基上活化。挑取麦康凯培养基上的单菌落，接种于5mL LB中，在37°C振摇16h。取培养好的细菌50 μ L于5mL LB中，在37°C震摇4.5h，测0D_，用M9培养基将所测OD值稀释至0.01。 实验分组:(一)Corning Costar生产U型96孔板(3599) ( 二 )上海生产U型96孔板(WHB)每孔加200 μ L稀释的菌液 ，重复6孔，分别用所稀释培养基(Μ9、LB、TSB)做空白对照。37°C培养不同时间8h、24h、48h、72h。将培养好的96孔U型平底板从恒温箱中取出，弃菌液。用1\ 83洗3次，甲醇固定1511^11，拍干后，加入1(^/1结晶紫染色51^11，自来水冲洗后拍干，加入Φ = 33%冰醋酸溶解，半小时后测D O6tltl，测定值减去空白对照值大于
0.12为生物膜阳性。图5:7号菌在两种不同96孔板上生物膜形成的结果；图6:13_2号菌在两种不同96孔板上生物膜形成的结果。由图5、6可以得出:7号菌和13-2号菌形成生物膜的能力强的培养板:(I)Corning Costar生产U型96孔板(3599)优于上海生产U型96孔板(WHB)。图7为生物膜在进口 96孔板生长情况。图8为生物膜在国产96孔板生长情况。生物膜在96孔板生长情况(I)通过眼观发现:进口 96孔U型平底板所形成的生物膜比国产进口 96孔U型平底板形成的生物膜厚而均匀；(2)通过OD6tltol值的测定:进口96孔U型平底板OD6。值大于国产96孔U型平底板。由此可知:实验所用的大肠杆菌生物膜在进口 96孔U型平底板生长良好。综合图1、2、3、4.5.6的实验结果可得出:实验菌株生物膜的培养的最佳条件:在Corning Costar生产U型96孔板、37°C、M9培养基、培养24_48h实验结果明显。实施案例4取临床分离的大肠杆菌121甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取100 μ L于5mL LB中，在37°C的摇箱中摇16h，在麦康凯琼脂基上活化。挑取麦康凯培养基上的单菌落，接种于5mL LB中，在37°C振摇16h。取培养好的细菌50 μ L于5mL LB中，在37°C震摇4.5h，测OD600,用M9培养基将所测OD值稀释至0.01。取Corning Costar生产U型96孔板，每孔加200 μ L稀释的菌液，重复6孔，分别用所稀释培养基(Μ9)做空白对照。37°C培养不同时间8h、24h、48h、72h。将培养好的96孔U型平底板从恒温箱中取出，弃菌液。用I XPBS洗3次，甲醇固定15min,拍干后,加入10g/L结晶紫染色5min,自来水冲洗后拍干，加入Φ = 33%冰醋酸溶解，半小时后测D O 6( ，测定值减去空白对照值大于0.12为生物膜阳性。经用该方法筛选的得到23株大肠杆菌生物膜阳性菌株，阳性率为19.01 %，生长曲线见图2.
从图2可以看出:23株大肠杆菌中，大多数大肠杆菌生物膜OD6tltol值呈先上升后下降的趋势。在8h生物膜出现黏附、24-48h生物膜形成成熟、72h出现脱落。本发明的一种提供一种大肠杆菌生物膜检测方法-96孔半定量法，已经通过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说 是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。
权利要求
1.一种针对大肠杆菌生物膜检测方法-96孔半定量法，其特征在于，包括以下步骤: (1)从_70°C冰箱中取出甘油保存菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取100μ L菌液接种于5mL LB液体培养基中，于37°C过夜震荡培养； (2)将菌液接种于麦康凯固体培养基中，置于37°C恒温培养箱内培养24h； (3)从麦康凯培养基中挑取红色单菌落，接种到新鲜的LB液体培养基，37°C恒温振荡培养16h ； (4)按I: 100倍稀释:取培养的菌液50 μ L于新鲜的5mL LB试管液体培养基上，于37°C缓慢震荡4.5h，保证细菌处于对数生长期； (5)测OD6tltlnm(6)用灭菌的M9培养基将所测OD6tltlnm值稀释至0.01 ; (6)取200μ L稀释至0.01菌液加入96孔U型平底板中，用Μ9液体培养基作为空白对照，于37°C恒温箱中分别培养24-48h ； (7)将培养好的96孔U型平底板从恒温箱中取出，弃菌液； (8)用I% PBS缓 冲液洗96孔U型平底板，重复三次，弃洗液，拍干； (9)将甲醇放入96孔U型平底板中固定15min，倒出并晾干； (10))将I%结晶紫溶液加入96孔U型平底板中，染色5min，自来水缓慢冲洗多次，晾干，观察板底部有无生物膜形成； (11)用33%的冰醋酸加于96孔U型平底板中，待细菌生物膜完全溶解后，用全波长酶标仪中测定OD6tltlnm，测定OD6tltlnm值减去空白对照孔的OD6tltol值大于等于0.12则可判定其为生物膜阳性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结晶紫使用浓度为1%;LB培养基、5xM9培养基使用浓度为Ix M9 ;所用96孔板为3599 ;所用甲醇为分析醇。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将甘油保存的菌株接种于LB培养基，37°C过夜震荡培养后再接种于麦康凯固体培养基中，其目的是固定、活化细菌和获得单菌落，保证实验菌体是单菌落。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用灭菌的M9培养基将所测OD6tltlnm值稀释至0.01 ;所用M9培养基作为大肠杆菌生物膜的培养基。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述96孔板37°C恒温箱中分别培养8h，24h，32h，48h和72h，观察生物膜的形成状态，主要是观察大肠杆菌在随着培养时间的不同，营养物质的不断消耗后，生物膜形成能力的强弱；在371:更接近大肠杆菌形成生物膜机体的环境温度。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述所用的96孔板的U型进行了特殊处理，更有利结合具有离子基团或疏水位点的生物大分子或者其它介质，有利于细菌粘附，有利生物膜的黏附。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述所用甲醇作为生物膜的固定液。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用全波长酶标仪中测定生物膜的OD为600nm，其测定OD6tltlnm值减去空白对照孔的OD6tltol值大于等于0.12则可判定其为阳性。
全文摘要
本发明公开了一种针对大肠杆菌生物膜检测方法-96孔半定量法，所述方法以大肠杆菌为实验材料，通过将其复苏、活化，常规培养至对数生长期、测定OD600、释稀OD600nm值至0.01、上96孔板、37℃培养、洗板、固定、染色、溶解、测定等步骤，得到大肠杆菌生物膜阳性。该方法具有可比性强，重复性高，易操作等优点。可用于大批量大肠杆菌生物膜的筛选工作。
文档编号C12Q1/06GK103215339SQ20131005744
公开日2013年7月24日 申请日期2013年2月6日 优先权日2013年2月6日
发明者喻华英, 闫石磊 申请人:塔里木大学