专利名称：：一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法
技术领域：
：:本发明涉及一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法，主要用于已获得的植物根际促生细菌的驯化，通过驯化获得具有植物防病促生能力的多功能有机磷农药降解细菌。
背景技术：
：:农药在农业生产中发挥了巨大的作用，据联合国粮农组织统计，如果不使用农药，全世界每年因病虫草害造成的损失约占农作物总产量的36%，年损失高达1250亿美元(CooperandDobson,2007；EddlestonandBateman,2007)。农药的使用保证了农业的稳产丰收和人类的食物供应。有机磷农药(Organophosphoruspesticide,OPs)是当今农药的主要类别，具有经济、高效、方便等特点，是国内外广泛生产和使用的农药产品。但农药的大量使用对生态环境造成了很大的破坏性。农药利用率仅为10%20%，其余80%90%最终将进入土壤环境，致使土壤中的农药残留严重，残留的农药随着食物链上升，最终危害人类健康(Carvalho，2006;Costaetal.，2008)。在世界上许多国家和地区，尤其是发展中国家，由于有机磷农药的持续大量使用已经对区域生态系统造成了严重的污染，在肉、奶制品、谷物、蔬菜和水果等产品中都不同程度检测到能够抑制乙酰胆碱酯酶活性，导致神经传导功能紊乱，诱发免疫系统疾病，致使人中毒死亡的有机磷农药的残留。据统计，每年全世界发生300万例有机磷农药中毒事件，造成20万人死亡。为此，自20世纪80年代末以来，世界上许多研究机构都致力于探索有机磷农药污染环境的生物修复技术，并于1991年3月在美国圣地亚哥召开了第一届“原位与就地生物修复”国际会议，这一会议的召开，标志着以生物修复为核心的环境生物技术进入了一个全新的发展时期。环境修复技术中，生物修复技术被公认为是效果好、见效快、简便易行、安全、廉价和环境友好、无二次污染的方法，已成为环境科学的研究热点，具有广阔的应用前景。常说的土壤生物修复技术主要就是指微生物修复。利用微生物修复土壤农药污染的主要原理是微生物利用有机农药作为碳源、氮源与磷源，将复杂有毒的农药化合物分解成简单无毒的化合物，或者彻底分解为C02、H2O,NH3和Cl—，从而降低农药在土壤中的残留量及毒性(MansourandGad,2010;康纪婦，2010)。获得降解有机磷农药的微生物的途径有很多，最常用的是从受到有机磷农药严重污染的土壤中分离筛选出能降解有机磷农药的菌种。定向培育法是近年来常用的一种方法，即在特定的土壤中人为的多次施用农药，驯化出能降解这种农药的微生物，再通过富集培养，从中分离筛选能高效降解这种农药的菌株(赵宇蕾，2009;康纪婷，2010)。这种单一功能菌的纯化筛选，只根据所需的功能要求从自然界中分离、纯化，得到目的单一的菌株。这种筛选方法有其不足之处，一是在土壤中人为施用农药，使得其他菌株不能生存，导致目标菌株失去了与自然条件下长期处于协同关系的其它菌共存的机会，虽然目标菌株的目标功能有所强化，但功能单一；二是单一菌的纯化使其对生长条件的适应范围越来越狭窄，对发酵条件要求高，发酵成本昂贵；三是单一功能菌孤立生长，容易受到其它菌的污染和抑制，重新施入土壤后，难以生长繁殖和发挥功能。已分离的有机磷农药污染土壤生物修复的微生物中，以细菌和真菌为主(FoxandMendz,2006;郭子武，2008;Al_QurainyandAbdel-Megeed,2009；Forlanietal.,2011),细菌主要包括:假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、节细菌属(Arthrobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、黄单胞杆菌属(Xanthamonus)、固瘤细菌属(Azotomonus)、硫杆菌属(Thiobacillus)等,其中假单胞菌属的菌株最活跃,对多种有机磷农药具有降解作用。真菌主要包括:曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Pinicielium)、木霉属(Trichoderma)、酵母菌(Saccharomyces)等。细菌由于其生理生化的多种适应能力以及容易诱发突变菌株，在降解有机磷农药的微生物中占有重要地位，因此对细菌的研究比较全面和深入。植物根围存在着大量微生物，自由生活在土壤或附生于植物根的一类可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害微生物的有益菌类统称为植物根际促生菌(PlantGrowth-PromotingRhizobacteria,简称PGPR)。PGPR的作用机制为通过定殖于植物根系，优先占领根际，诱导植物产生IAA等生长激素，加速土壤磷、铁等养素循环，促进植物生长发育；提高植物对病原菌和环境胁迫的抗性和忍耐力；通过抑制拮抗根际的病原菌来保护植物，往往产生抗生素、铁载体、HCN、水杨酸，诱导ISR等抗性因子，帮助植物抵抗多种病原菌的侵害(Compantetal.,2010;康贻军等,2010)。由于PGPR具有改良土壤、改善作物品质、减少化肥和农药施用量、降低植物病害、提高作物产量等作用，因此，其自身及与菌根真菌的协同作用在农林牧业、食品安全、环境保护等方面具有重大应用潜势和价值。作为一类重要的植物根际促生菌，嗜铁细菌在促进植物生长和防治植物病害方面都发挥了很大的作用。研究证实嗜铁菌产生的嗜铁素可与植物根际病原微生物争夺有限的铁营养，从而抑制病原微生物生长繁殖，起到生物防治作用；同时植物可以利用微生物产生的嗜铁素螯合的铁，从而改善植物的铁营养，防治土壤植物缺铁失绿症的发生，促进植物生长(MiethkeandMarahiel，2007;余贤美，2009)。国内外学者对嗜铁菌的筛选，嗜铁菌的防病促生效果及其机理，以及嗜铁素合成相关基因等方面进行了广泛的研究。在土壤污染生物修复过程中，土壤、植物与微生物间相互作用，微生物可通过促进植物生长、为植物提供营养物质或产生抗性代谢产物控制植物病害等方式，加快土壤污染植物修复的效率，增强修复效果。但是，迄今为止，植物根际促生菌(杨蓉等，2012;郭长虹等，2012)和用于有机磷农药污染土壤生物修复的微生物(彭霞薇等，2011;姜健等2012)是分开筛选研究的，即使发现某菌株具有营养、抑病及降解有机磷农药的功能(吴皓琼等，2012)，但并没有涉及同时具有这几种功能的菌株的具体筛选方法。主要参考文献:郭子武.笋用竹林地有机农药污染土壤微生物修复机理研究.中国林业科学研究院博士学位论文，2008.姜健，杨宝灵，范方，王冰，温小红，刘淼.2012.利用紫花苜蓿-有机磷农药降解菌联合修复有机磷农药污染土壤的方法.发明专利申请号:CN102755991A。康纪婷.有机磷农药草甘膦降解菌的筛选、分离及其鉴定.四川农业大学硕士学位论文，2010.康贻军，程洁，梅丽娟，等.植物根际促生菌作用机制研究进展.应用生态学报，2010，21(I):232-238.彭霞薇，姜丹，荆梦，安晓宇，杨建州，白志辉.2011.—株降解有机磷农药的芽孢杆菌及其菌剂的生产方法.发明专利号:CN101705201B.吴皓琼，牛彦波，曹亚彬，郭立姝，殷博.2012.—种具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌.发明专利号:CN101787354B.杨蓉，侯敏，詹发强，张慧涛，侯新强，龙宣杞，崔卫东，林瑞峰，2012.—种蜡状芽孢杆菌及其作为植物根际促生菌的应用.发明专利号:CN102321554B.余贤美.海南岛橡胶根际嗜铁细菌B.SiibtiliSCAS15筛选及嗜铁素基因dhbC克隆、表达与功能分析.山东农业大学博士学位论文，2009.赵宇蕾.联苯菊酯降解菌的筛选鉴定、降解特性及应用研究.西北农林科技大学硕士学位论文，2009.Al-QurainyF，Abdel-MegeedA.PhytoremediationanddetoxificationoftwoorganophosphoruspesticidesresiduesinRiyadharea.WorldApplSciJ，2009，6:987-998.CarvalhoFP.Agriculture,pesticides,foodsecurityandfoodsafety.EnvironSciPolicy，2006，9:685-692.CompantS，ClementC，SessitschA.Plantgrowth-promotingbacteriaintherhizo—andendosphereofplants:theirrole,colonization,mechanismsinvolvedandprospectsforutilization.SoilBiolBiochem，2010，42:669-678.CooperJ，DobsonH.Thebenefitsofpesticidestomankindandtheenvironment.CropProt,2007,26:1337-1448.CostaLG,ColeTB，JansenKL,FurlongCE.Paraoxonase(ponl)andorganophosphatetoxicity(MacknessB,ed.).TheNetherlands:SpringerPress，2008，209-220.EddlestonM，BatemanDN.Pesticides.Medicine，2007，35(12):646-648.ForlaniG，PrearoV,WieczorekD,KafarskiP，LipokJ.PhosphonatedegradationbySpirulinastrains:Cyanobacterialbiofiltersfortheremovalofanticorrosivepolyphosphonatesfromwasterwater.EnzMicrobTechnol，2011，48:299-305.FoxEM,MendzGL.Phosphonatedegradationinmicroorganisms.EnzymeMicrobTechnol，2006，40:145-150.MansourSA,GadMF.Riskassessmentofpesticidesandheavymetalscontaminantsinvegetables:anovelbioassaymethodusingDaphniamagnaStraus.FoodChemToxocol，2010，48:377-389.MiethkeM，MarahielMA.Siderohore-basedironacquisitionandpathogencontrol.MicrobiolMolBiolRev，2007，71:413-451.
发明内容:本发明就是针对上述问题，提供一种筛选具有植物根际促生菌特征的有机磷农药降解细菌的方法，使之具有防治植物病害、促进植物生长以及降解有机磷农药的多重功能。本发明所提供的筛选具有防治植物病害、促进植物生长和降解有机磷农药多功能菌株的方法，具体步骤如下:I)菌株活化:挑取冷冻保藏的菌液，接种到LB液体培养基中，于3037°C、150200r/min下振荡培养2448小时，然后在固体培养基平板上划线，3037°C条件下培养过夜，挑取单菌落再次划线培养，活化好的菌株置于4°C冰箱保存备用，同时每隔2个月重新划线培养，以保证菌株的正常存活繁殖能力。LB培养基配方为:胰蛋白胨(Tryptone)IOg/L酵母提取物(Yeastextract)5g/L氯化钠(NaCl)IOg/LpH值7.0固体培养基:每IOOOmL培养基中添加1720g琼脂粉。2)菌株驯化:在常用液体细菌培养基，如LB液体培养基，牛肉膏蛋白胨培养基中添加有机磷农药，农药浓度从50mg/L，100mg/L,200mg/L,逐渐递增，根据菌株对不同农药的耐受能力，设定不同的初始农药浓度以及递增幅度。将菌株接种于含有有机磷农药的液体培养基中，于3037°C，150200r/min条件下进行振荡培养48h，生长正常的菌株，再接种到含有更高浓度有机磷农药的液体培养基中，继续培养，如此逐渐增加有机磷农药的浓度，经驯化获得对有机磷农药具有较高耐受性的菌株。3)有机磷农药的降解检测:根据有机磷农药种类的不同，通过相应的有机磷农药检测方法，检测菌株对有机磷农药的降解作用。4)最佳降解条件的筛选:以LB为基础培养基，制备菌悬液，按一定的接种量接种到含有有机磷农药(从初始浓度到最高耐受浓度按一定的梯度设置浓度)的LB液体培养基中，3037°C,150200r/min条件下振荡培养，分别在培养12h,24h,36h,48h,60h和72h时测定菌株生长情况及对毒死蜱的降解情况，选出最适降解时间和最适降解浓度。在此基础上，研究温度、振荡速率、初始PH值、接种量、培养基种类、以及碳源、氮源和无机盐种类等因素对降解率的影响，筛选菌株对有机磷农药的最佳降解条件。5)模拟田间修复效果测定:通过盆钵试验，研究菌株对有机磷农药污染土壤的修复效果。制备接种菌悬液，接种到经121°C灭菌的土壤中，使得土壤中细菌的数量达到106cfu/g土，以添加有机磷农药而不接种细菌的灭菌土壤为对照，定期测定土壤中有机磷农药的残留含量，计算降解率，分析菌株对土壤中有机磷农药的降解效果，以此研究菌株对有机磷农药污染土壤的生物修复潜能。本发明的有益效果:通常，筛选植物根际促生菌均是通过分离筛选拮抗菌或植物内生菌，然后通过温室盆栽试验研究其对植物的生长促进作用及对病害的防治效果。而真正施用到田间，因土壤微生物、土壤理化性质、土壤中的农药残留等各种生物与非生物因素的影响，所获得的效果远不如盆栽试验。除了防病促生作用有所降低之外，还有可能由于土壤中有机磷农药的残留，而所获得的菌株对有机磷农药没有降解能力，因而菌株在施入土壤之后无法生存繁殖，从而丧失了防病促生的作用。本发明方法得到的多功能菌株，由于同时具有防病促生及降解有机磷农药的功能，能够长期保持防病促生功能和降解有机磷农药能力的稳定性，不会因为培养代数的增加而削弱其各种功能；而且由于其功能的多样性，施入土壤后易于生存繁殖，从而更好的发挥其植物防病促生作用和降解有机磷农药的功能；另外，本发明方法操作简单，减少成本，省时省力。因此，本发明方法在多功能菌株的筛选及有机磷农药污染土壤的微生物修复等领域将会有广阔的应用前景。:图1表示盆钵试验中不同时期甜椒苗的株高。图2表示吸光度对磷含量的标准曲线。图3表不Bs-15菌株对草甘膦的降解曲线。图4表示不同初始浓度对Bs-15菌株降解草甘膦活性的影响。图5表示不同温度对Bs-15菌株降解草甘膦活性的影响。图6表示不同培养转速对Bs-15菌株降解草甘膦活性的影响。图7表示不同初始pH值对Bs-15菌株降解草甘膦活性的影响。图8表示不同接种量对Bs-15菌株降解草甘膦活性的影响。图9表示Bs-15菌株降解草甘膦培养基中碳源的优化。图10表示Bs-15菌株降解草甘膦培养基中氮源的优化。图1I表不Bs-15菌株降解草甘膦培养基中无机盐的优化。图12表示Bs-15对草甘膦的模拟田间修复效果。图13表示CAS17在CAS检测平板上产生的嗜铁圈。A:CAS17；B:对照；C:CAS空白平板。图14表示CAS17的生长曲线及对毒死蜱的降解曲线。图15表示不同初始浓度对CAS17降解毒死蜱活性的影响。图16表示不同环境温度对CAS17降解毒死蜱活性的影响。图17表示不同振荡速度对CAS17降解毒死蜱活性的影响。图18表示不同初始pH值对CAS17降解毒死蜱活性的影响。图19表示不同接种量对CAS17降解毒死蜱活性的影响。图20表示不同碳源对CAS17降解毒死蜱活性的影响。图21表示不同氮源对CAS17降解毒死蜱活性的影响。图22表示不同无机盐对CAS17降解毒死蜱活性的影响。图23表示CAS17对毒死蜱的模拟田间修复效果。图24表示基于16SrDNA序列构建的CAS17系统进化树。具体实施方式:以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法和技术手段，如无特殊说明，均为本领域技术人员所熟知的常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。培养基的制备:1)LB液体培养基(ρΗ7.0)的制备:将IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、IOg氯化钠和双蒸水混匀，并用双蒸水定容到IOOOmL,用氢氧化钠调pH值到7.0，分装后于121°C灭菌20mino2)LB固体培养基(pH7.0)的制备:将IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、IOg氯化钠、1720g琼脂粉和双蒸水混匀，并用双蒸水定容到IOOOmL,用氢氧化钠调pH值到7.0,分装后于121°C灭菌20min。3)改良MM培养基的制备:40mmol/L3-(N-吗啉代)丙磺酸钠(用KOH调ρΗ7.4)，2mmo/LK3PO4(ρΗ7.0)，葡萄糖2%(ff/V)，(NH4)2S042.0g/L,MgSO4.7H200.2g/L，柠檬酸钠.2H201.0g/L,谷氨酸钾1.0g/L,色氨酸8.0mg/L,3.0nmoI/L钥酸铵，400nmol/LH3BO3,30nmol/LCoCl2,lOnmol/LCuSO4,1OnmoI/LZnSO4,80nmol/LMnCl2。将上述物质溶解混匀后定容至IOOOmL,分装后于121°C灭菌20min。4)PDA液体培养基的制备:称取马铃薯200g，洗净去皮切成小块，煮烂过滤取滤液，加入葡萄糖20g，琼脂粉1520g，定容至IOOOmL,自然pH值，分装后于121V灭菌20mino5)Hogland营养液的制备:lmmol/LKH2PO4,Smmol/T,KNO3,Smmol/T,Ca(NO3)2,2mmol/LMgSO4,2.86g/LH3BO3,1.81g/LMnCl2.4H20,0.22g/LZnSO4.7H20,0.08g/LCuSO4.5H20，0.02g/LH2MoO4.H2O,将上述物质溶解混匀定容至lOOOmL，分装后于121°C灭菌20min。6)CAS检测平板的制作:A.CAS蓝色检测液的制作溶液A:将0.07g的CAS(ChromeazurolS)溶于50mL去离子水中，再加入10mT,1mmol/I,的FeCl3溶液(含有10mmol/I,的HCl)；溶液B:将0.06g的HDTMA(Hexadecyltrimethylammoniumbromide)溶于40mL去离子水；溶液C:将A溶液沿着烧杯壁缓缓加入到B溶液中，轻轻晃动，使得溶液A与溶液B混合均勻，即得到溶液C=CAS蓝色检测液。121°C灭菌20min。B.通用CAS检测平板制作先配制好lmmol/L的CaCl2溶液、lmmol/L的MgS04.7H20溶液、10%的酸水解酪蛋白溶液(121°C，15min单独灭菌)；再分别取2mLlmmol/L的CaCl2溶液、2mLlmmol/L的MgS04.7H20溶液、6mL10%的酸水解酪蛋白溶液，加入生物缓冲液Pipes(sigma)，调pH6.87.0。去离子水定容到lOOOmL。加入20g琼脂粉，分装后于121°C，灭菌1520min。固体培养基灭菌后，温度降低到60°C时，以5mLCAS蓝色检测液/每IOOmLCAS培养基的量沿着三角瓶壁加入，混合均匀后倒平板。注意不要产生气泡，以免影响平板检测实验。实施例1:嗜铁细菌枯草芽孢杆菌Bs-15对草甘膦的降解一、嗜铁细菌B.subtilisBs-15的防病促生作用B.subtilisBs-15(原编号为CAS15)筛选自橡胶树根际土壤，具有较强的产嗜铁素能力，对稻瘟病菌，芋疫病菌，西瓜枯萎病菌，辣椒枯萎病菌，西番莲茎基腐病菌、芒果炭疽病菌，瓜果腐霉等植物病原菌有较强的抑制作用余贤美，郑服丛，林超，等。土壤产嗜铁素拮抗细菌CAS15的分离鉴定。植物保护学报，2009，36(2):129_135。采用盆钵试验，研究了嗜铁细菌B.subtilisBs-15对甜椒枯萎病的生防效果及对甜椒生长的促进作用。这部分内容已发表余贤美，周广芳，辛力。枯草芽孢杆菌Bs-15产嗜铁素条件及其对甜椒的防病促生效应，农药学学报，2010，12(2):135-141，在此细述，仅用于说明其防病促生作用。UB.subtilisBs_15接种物的制备将B.subtilisBs-15接种到改良MM培养基中，于28°C下培养24h，用10mmol/L的无菌硫酸镁溶液制备成菌悬液。将菌悬液与盆装沙土混合物(经121°C灭菌20min，隔24h再灭菌I次，共2次)混匀，使沙土中的菌体密度约为7X106cfu/g。用于系统诱导抗性试验的接种物的制备:将菌悬液与滑石粉按体积质量比1:1的比例混匀，使菌体密度为5X107cfu/g。2、辣椒枯萎病菌接种物的制备将辣椒枯萎病菌(FusariumoxysporumSchl.f.sp)接种于PDA液体培养基中，于22°C条件下培养14d，过滤除去菌丝体。于8000r/min下离心20min，取上清液，重悬于lOmmol/L的无菌硫酸镁溶液，获得分生孢子悬浮液，将其与沙土混合物(12:5，V/V)混匀使其密度为3.75X105cfu/g。接种后的土壤装到聚乙烯袋中，20°C放置35d，使病原菌定殖于土壤中。用于系统诱导抗性试验的接种物的制备与上述方法类似，不同的是，将辣椒枯萎病菌与泥炭-沙混合物(I:1，V/V)混匀，使其密度为3X104cfu/g。3>B.subtilisBs_15对甜椒枯萎病的抑制作用采用盆钵土壤生物测定法，研究菌株Bs-15对甜椒枯萎病的抑制作用。将甜椒枯萎病菌侵染土壤、Bs-15侵染土壤、灭菌土和河沙混匀，使每克沙土中含有IO4个辣椒枯萎病菌分生孢子，Bs-15菌体密度为106cfu/g。以不加Bs-15侵染土壤的混合沙土为对照。每盆装750g制备好的混合沙土，播10颗甜椒种子，共9盆，置于20°C、相对湿度为70%、光周期为16h的温室中培养。每周浇水I次及施用I次Hogland营养液。为研究铁离子的影响，在Hogland营养液中加入lOymol/LFe-EDDHA(乙二胺二邻羟苯基大乙酸铁钠)。约28d后，测定其发病率。每个处理重复3次。甜椒枯萎病抑制效果通过以下公式计算:抑制率(％)=(对照发病率-处理发病率)/对照发病率X100%4、B.subtilisBs_15的系统诱导抗性将10颗甜椒种子播种于空白沙子中，5d后，将幼苗移栽到矿物纤维容器，使其根系位于2个容器。将Bs-15接种于底层根系根尖部位，2d后将枯萎病菌接种于根系茎基部。在整个试验过程中将Bs-15与枯萎病菌保持隔离，以消除生防菌株与病原菌的直接相互作用。将盆钵置于20°C、相对湿度为70%、光周期为16h的温室中培养。每周烧I次去离子水。移栽后20d，记录发病率。每个处理重复3次。结果显示，相对于对照，两种处理均显著降低了甜椒苗枯萎病的发病率(表I)。当Bs-15与枯萎病菌同时接种时，发病率为40%，比对照降低了32%，防效为44.4%;而在施用Bs-15后2d再接种枯萎病菌，并用矿物纤维隔离的处理方式，发病率仅为31%，比对照降低了41%，防效达到56.94%。该结果说明Bs-15可能通过产生系统诱导抗性从而增强了对甜椒枯萎病的抑制效果。为研究铁离子的影响，在Hogland营养液中加入ΙΟμπιοΙ/LFe-EDDHA0结果发现，铁离子显著降低了Bs-15对甜椒枯萎病的抑制效果，同时接种与隔离处理的抑制率分别仅为12.50%和23.43%。表I盆钵试验中Bs-15对甜椒枯萎病的抑制效果*权利要求1.一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法，其特征在于:在已有筛选自土壤的植物根际促生细菌菌株的基础上，通过改良的定向培育法，即在培养基中添加农药，对已有菌株进行驯化筛选，获得同时具有植物防病促生能力的多功能有机磷农药降解细菌菌株。2.根据权利要求1所述的一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法，其特征在于:在常用细菌培养基(如LB培养基)中添加有机磷农药，农药浓度为50mg/L，100mg/L,200mg/L，400mg/L,800mg/L,2000mg/L,以及更高的浓度。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:在驯化过程中，将能够在含有较低浓度有机磷农药的培养基中生存繁殖的菌株接种于含有更高浓度有机磷农药的培养基中，逐步提高培养基中有机磷农药的浓度，以期获得菌株对更高浓度有机磷农药的耐受性。4.根据权利要求1和2所述的方法，其特征在于:由于不同菌株对不同有机磷农药的耐受性不同，用于菌株驯化的初始农药浓度、农药浓度增加的幅度和梯度，以及菌株对不同有机磷农药的最高耐受浓度会有所不同。5.根据权利要求1所述的一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法，其特征在于:经过驯化的菌株，除了具有原有的植物根际促生细菌的特征之外，还具有降解有机磷农药的能力。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:通过同一菌株对不同有机磷农药的先后驯化，可使菌株获得降解多种有机磷农药的能力。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:本方法可用于具有单一功能的植物根际促生细菌，如解磷细菌、嗜铁细菌等菌株对有机磷农药的驯化，从而获得多功能有机磷农药降解细菌菌株。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:本方法可用于具有多种机制的植物根际促生细菌，如同时具有产生抗生素、嗜铁素、IAA、溶磷、诱导系统抗性等机制的植物根际促生细菌的驯化，从而获得具有多种防病促生机制的多功能有机磷农药降解细菌菌株。9.根据权利要求1所述的一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法，其特征在于:本方法可用于其他来源的生防菌(如分离自发病区病情较轻的植株的拮抗菌、植物内生生防菌等)对有机磷农药的驯化，从而获得具有生防作用的多功能有机磷农药降解细菌菌株。10.根据权利要求1至9所述的方法，其特征在于:本方法亦可扩展用于筛选具有防病促生效果的多功能有机磷农药降解真菌或放线菌菌株。全文摘要本发明公开了一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法。该方法由如下步骤组成1)植物根际促生细菌的活化或筛选；2)菌株的驯化；3)菌株对有机磷农药的降解活性；4)环境因子对菌株降解有机磷农药能力的影响以及条件的优化；5)通过盆钵试验，研究菌株对土壤中有机磷农药的降解效果，从而分析菌株对有机磷农药污染土壤的生物修复潜能。本方法得到的菌株将能够长期保持防病促生功能和降解有机磷农药能力的稳定性；而且由于其功能的多样性，施入土壤后易于生存繁殖，从而更好的发挥其功能；另外，本发明方法操作简单，减少成本，省时省力。因此，本发明方法在多功能菌株的筛选及有机磷农药污染土壤的微生物修复等领域将会有广阔的应用前景。文档编号C12N1/36GK103146632SQ201310057458公开日2013年6月12日申请日期2013年2月6日优先权日2013年2月6日发明者余贤美,艾呈祥,于婷,董庆龙,安淼,王海荣,刘嘉芬申请人:山东省果树研究所