一种有机磷农药降解酶活力检测方法
【专利摘要】本发明涉及酶活力检测【技术领域】，具体地说是一种有机磷农药降解酶活力检测方法。该检测方法以目前广泛使用的有机磷农药毒死蜱作为酶促反应底物，加入吐温80作为分散剂，检测酶促反应体系中毒死蜱在291nm波长下的吸光度变化值，对照毒死蜱标准曲线，计算酶活力。该检测方法能够快速、灵敏地检测有机磷农药降解酶活力，为有机磷农药降解酶活力的检测及毒死蜱降解率的测定提供了一种有效的方法。
【专利说明】一种有机磷农药降解酶活力检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及酶活力检测【技术领域】，具体地说是一种有机磷农药降解酶活力检测方法。
【背景技术】
[0002]农药残留严重危害生态环境及食品安全，对人类健康构成了巨大威胁。农药降解酶是解决农药残留的有效技术手段，具有高效、安全等特点。农药降解酶中以有机磷农药降解酶研究的较为深入，有机磷农药降解酶降解谱广泛，能够降解对硫磷、甲基对硫磷、毒死蜱、杀螟硫磷、马拉硫磷等多种有机磷农药。有机磷农药降解酶是农药降解酶领域的关键酶，具有巨大的研究与开发价值。
[0003]有机磷农药降解酶活力检测的传统方法为比色法:以甲基对硫磷为底物，甲基对硫磷被降解后生成显色物质对硝基苯酹，对硝基苯酹在410nm下有最大吸收峰,通过检测对硝基苯酚的生成量，对照标准曲线即可计算甲基对硫磷的降解量，以此来定义有机磷农药降解酶活力。此方法的优点是灵敏度高，然而随着国家对甲基对硫磷等高毒农药的禁止使用，甲基对硫磷在市场上已经停止销售，所以采用甲基对硫磷作为有机磷农药降解酶活力的检测底物已经意义不大。随着市场上中低等毒性有机磷农药(如毒死蜱)的广泛使用，寻找一种方便、灵敏的新方法重新定义有机磷农药降解酶活力具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于建立一种方便、灵敏的检测有机磷农药降解酶活力的新方法，为有机磷农药降解酶定义一个新的酶活力`标准。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0006](I)毒死蜱标准溶液的制备:以含有0.05%~0.5% (体积百分比)吐温80的浓度为ΙΟμΜ~50μΜ的Tris-HCl (ρΗ8.0)缓冲液为溶剂，分别制备毒死蜱浓度为10μΜ、20μΜ、30 μ Μ、40 μ Μ、50 μ Μ、60 μ M的毒死蜱标准溶液。
[0007](2)毒死蜱标准曲线的绘制:将不同浓度的毒死蜱标准溶液于291nm波长下测定吸光度，横坐标为毒死蜱浓度，纵坐标为吸光度，绘制标准曲线。
[0008](3)酶促反应体系的制备:整个酶促反应在石英比色杯中进行，将10μ 1~200μ I待测酶液加入酶促反应体系，加入待测酶液后酶促反应体系总体积为2mf 3ml。酶促反应体系中各组分的终浓度为:Tris-HC110 μ Μ~50 μ M ρΗ7.0^9.0、吐温800.05%"0.5% (体积百分比)、毒死蜱10 μ Μ~100 μ Μ，余量为去离子水。其中，Tris-HCl为缓冲剂，为酶促反应提供稳定的PH环境，吐温80为分散剂，将毒死蜱均匀分散并溶解于反应体系，毒死蜱为酶促反应底物。
[0009](4)酶活力检测:酶促反应在25°C~35°C条件下进行，待测酶液加入反应体系并混合均匀后立即于291nm波长下检测酶促反应Imin吸光度的变化，对照毒死蜱标准曲线，计算酶活力。酶活力(U)定义为:在上述反应条件下，Imin降解I μ mol毒死蜱所需要的酶量。[0010]本发明所具有的优点为:
[0011]1.本发明以目前广泛使用的有机磷农药毒死蜱作为酶促反应底物，提供了一种快速、灵敏的检测有机磷农药降解酶活力的新方法。
[0012]2.本发明所提供的一种有机磷农药降解酶活力检测方法可以用来检测有机磷农药降解酶对毒死蜱的降解率。
[0013]3.本法本发明所提供的一种有机磷农药降解酶活力检测方法可以用来筛选对毒死蜱有降解活性的酶。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1毒死蜱标准曲线。
【具体实施方式】
[0015]实施例1:有机磷农药降解酶OPH (GenBank登录号:AY766084)酶活力的检测
[0016](I)毒死蜱标准溶液的制备:以含有0.1% (体积百分比)吐温80的浓度为20 μ M的Tris-HCl (ρΗ8.0)缓冲液为溶剂，分别制备毒死蜱浓度为10 μ Μ、20 μ Μ、30 μ Μ、40 μ Μ、50 μ Μ、60 μ M的毒死蝶标准溶液。
[0017](2)毒死蜱标准曲线的绘制:将不同浓度的毒死蜱标准溶液于291nm波长下测定吸光度，横坐标为毒死蜱浓度，纵坐标为吸光度，绘制标准曲线。
[0018](3)酶促反应体系的制备:整个酶促反应在4ml石英比色杯中进行，将100 μ I有机磷农药降解酶OPH酶液加入酶促反应体系，加入待测酶液后酶促反应体系总体积为3ml，酶促反应体系中各组分的终浓度为Tris-HC120 μ M ρΗ8.0,吐温800.1% (体积百分比)，毒死蝶80 μ Μ,余量为去离子水。
[0019](4)酶活力检测:酶促反应在30°C条件下进行，待测酶液加入酶促反应体系并混合均匀后立即于291nm波长下检测酶促反应Imin前后吸光度的变化，对照标准曲线(图1)，计算酶活力。酶活力(U)定义为:在30°C，pH8.0的条件下，Imin降解I μ mol毒死蜱所需
要的酶量。
[0020](5)酶活力计算公式:
[0021]X= (A1-A2) X 0.003/ (k X 0.1 X I)
[0022]式中:X-酶活力(U/ml)
[0023]A1——反应前吸光度
[0024]A2-反应后吸光度
[0025]0.003——加入待测酶液后酶促反应体系体积(L)
[0026]k——毒死蜱标准曲线斜率
[0027]0.1——酶液体积(ml)
[0028]1-反应时间(min)
[0029](6)检测结果:经3次重复试验，取平均值,有机磷农药降解酶OPH酶液的酶活力为 0.47U/mlο
[0030]实施例2:有机磷农药降解酶MPH (GenBank登录号JQ686087)酶活力的检测。
[0031](I)毒死蜱标准溶液的制备:以含有0.1% (体积百分比)吐温80的浓度为20 μ M的Tris-HCl (ρΗ8.0)缓冲液为溶剂，分别制备毒死蜱浓度为10 μ Μ、20 μ Μ、30 μ Μ、40 μ Μ、50 μ Μ、60 μ M的毒死蝶标准溶液。
[0032](2)毒死蜱标准曲线的绘制:将不同浓度的毒死蜱标准溶液于291nm波长下测定吸光度，横坐标为毒死蜱浓度，纵坐标为吸光度，绘制标准曲线。
[0033](3)酶促反应体系的制备:整个酶促反应在4ml石英比色杯中进行，将200 μ I甲基对硫磷水解酶MPH酶液加入酶促反应体系，加入待测酶液后酶促反应体系总体积为3ml，酶促反应体系中各组分的终浓度为Tris-HC120 μ M ρΗ8.0,吐温800.1% (体积百分比)，毒死蝶50 μ Μ,余量为去离子水。
[0034](4)酶活力检测:酶促反应在30°C条件下进行，待测酶液加入酶促反应体系并混合均匀后立即于291nm波长下检测酶促反应Imin前后吸光度的变化，对照标准曲线(图1)，计算酶活力。酶活力(U)定义为:在30°C，pH8.0的条件下，Imin降解I μ mol毒死蜱所需
要的酶量。
[0035](5)酶活力计算公式:
[0036]X= (A1-A2) X 0.003/ (kX 0.2 X I)
[0037]式中:X——酶活力(U/ml)
[0038]A1——反应前吸光度
[0039]A2—反应后吸光度
[0040]0.003—加入待测酶液后酶促反应体系体积(L)
[0041]k——毒死蜱标准曲线斜率
[0042]0.2-酶液体积(ml)
[0043]1-反应时间(min)
[0044](6)检测结果:经3次重复试验，取平均值,有机磷农药降解酶MPH酶液的酶活力为 0.23U/mlο
[0045]实施例3:有机憐农药降解菌Pseudomonas stutzeri strain ZK-5细胞裂解液酶活力的检测
[0046](I)毒死蜱标准溶液的制备:以含有0.1% (体积百分比)吐温80的浓度为20 μ M的Tris-HCl (ρΗ8.0)缓冲液为溶剂，分别制备毒死蜱浓度为10 μ Μ、20 μ Μ、30 μ Μ、40 μ Μ、50 μ Μ、60 μ M的毒死蝶标准溶液。
[0047](2)毒死蜱标准曲线的绘制:将不同浓度的毒死蜱标准溶液于291nm波长下测定吸光度，横坐标为毒死蜱浓度，纵坐标为吸光度，绘制标准曲线。
[0048](3)酶促反应体系的制备:整个酶促反应在4ml石英比色杯中进行，将100 μ I有机磷农药降解菌Pseudomonas stutzeri strain ZK-5细胞裂解液的离心上清液加入酶促反应体系，加入待测酶液后酶促反应体系总体积为2ml，酶促反应体系中各组分的终浓度为Tris-HC120yM pH8.0，吐温800.1% (体积百分比)，毒死蜱30 μ M，余量为去离子水。
[0049](4)酶活力检测:酶促反应在30°C条件下进行，待测酶液加入酶促反应体系并混合均匀后立即于291nm波长下检测酶促反应Imin前后吸光度的变化，对照标准曲线(图1 )，计算酶活力。酶活力(U)定义为:在30°C，ρΗ8.0的条件下，Imin降解I μ mol毒死蜱所需要的酶量。
[0050](5)酶活力计算公式:[0051]X= (A1-A2) X 0.002/ (k X 0.1 X I)
[0052]式中:X——酶活力(U/ml)
[0053]A1——反应前吸光度
[0054]A2——反应后吸光度
[0055]0.002——加入待测酶液后酶促反应体系体积(L)
[0056]k——毒死蜱标准曲线斜率
[0057]0.1-酶液体积(ml)
[0058]1-反应时间(min)
[0059](6)检测结果:经3次重复试验，取平均值，有机磷农药降解菌细胞裂解液的酶活力为 0.12U/ml。
【权利要求】
1.一种有机磷农药降解酶活力检测方法，包括如下步骤: 酶促反应在石英比色杯中进行，将待测酶液加入酶促反应体系，于291nm波长下测定酶促反应前后吸光度的变化，对照毒死蜱标准曲线，计算有机磷农药降解酶活力。
2.按权利要求1所述的有机磷农药降解酶活力检测方法，其特征在于:向酶促反应体系中加入的待测酶液体积为10 μ l-200μ 1，加入待测酶液后酶促反应体系总体积为2ml~3ml。
3.按权利要求1所述的有机磷农药降解酶活力检测方法，其特征在于:酶促反应体系中含有Tris-HCl缓冲液、吐温80及毒死蜱，加入待测酶液后各组分终浓度为:Tris-HCllO μ M~50 μ ΜρΗ7.0~9.0、吐温 800.05%~0.5%(体积百分比)、毒死蜱 10 μ M~100 μ Μ,余量为去尚子水。
4.按权利要求1、2或3所述的有机磷农药降解酶活力检测方法，其特征在于:酶促反应在25°C~35°C条件下进行，反应时间为lmirT3min。
5.按权利要求1所述的有机磷农药降解酶活力检测方法，其特征在于: 标准曲线绘制过程: (1)毒死蜱标准溶液的制备:以含有0.05%~0.5% (体积百分比)吐温80的浓度为ΙΟμΜ~50μΜ的Tris-HCl (ρΗ8.0)缓冲液为溶剂，分别制备毒死蜱浓度为10μΜ、20μΜ、30 μ Μ、40 μ Μ、50 μ Μ、60 μ M的毒死蜱标准溶液; (2)毒死蜱标准曲线的绘制:将上述不同浓度的毒死蜱标准溶液于291nm波长下测定吸光度，横坐标为毒死蜱溶液浓度，纵坐标为吸光度，绘制毒死蜱标准曲线(图1)。
6.按权利要求1所述的有机磷农药降解酶活力检测方法，其特征在于: 有机磷农药降解酶酶活力(U)定义为:在30° C，pH8.0的条件下，Imin降解I μ mol毒死蜱所需要的酶量。 酶活力计算公式:
X= (A1-A2) XV1/(kXV2Xt) 式中:X——酶活力(U/ml) A1-反应前吸光度 A2—反应后吸光度 V1——加入待测酶液后酶促反应体系体积(L) k——毒死蜱标准曲线斜率 V2——酶液体积(ml) t-反应时间(min)。
【文档编号】G01N21/33GK103499546SQ201310043315
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年2月4日 优先权日:2013年2月4日
【发明者】张惠文, 谢建飞, 徐明恺, 张成刚, 石元亮, 卢宗云 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所