专利名称：基于微流控技术的两步构建三维神经干细胞模型的方法
技术领域：
本发明属于微加工技术与组织工程领域，涉及一种应用微流控细胞培养系统体外构建神经干细胞三维细胞模型的方法。
背景技术：
神经干细胞(neural stem cells, NSCs)体外培养方式主要分为悬浮培养法和单层培养法。悬浮培养的NSCs在体外以“神经球”(neurospheres)形式生长,大量的NSCs以及其所分化的子细胞共同存在于神经球内部。随着神经球的不断增大，营养物质向神经球内部的传递会出现困难，造成处于内部核心的细胞大量凋零、坏死，甚至出现中空的现象。单层培养法在NSCs的形态特征、生长特点、以及其分化成的神经元与神经胶质细胞特性方面的相关研究中均发挥了重要的作用。但是越来越多的实验证明在二维条件下培养的细胞无法真正体现其在体内的生物学特性与功能。单层贴壁生长的细胞，因缺少立体支架，只能向二维发展，因此，存在于细胞-细胞、细胞-细胞外基质之间相互关系都被同化。这样的生长模式与细胞体内的生长状况相去甚远。细胞三维培养方法就是想要利用三维生物支架来培养细胞，使细胞呈空间立体方式生长，建立细胞与生物支架的三维空间复合体。这种培养方式更接近于体内细部的生长模式，容易形成类似体内组织的有生物活性的结构。目前，体外构建NSCs来源的三维类神经组织的研究，在国内外还处于实验探索阶段，没有标准化的实验方法。微流控细胞培养系统是近年来新兴的一种基于微流体技术的细胞培养平台。正是由于微流体技术对于微量流体的精确控制和操纵能力，并且依据该技术构建的平台具有多种单元技术灵活组合、整体可控和规模集成的特点，因此，可更精准地模拟体内的物理与化学信号，从而提供一个与人体微环境相似的，稳定可控的细胞与组织的培养环境。本发明将微加工技术与组织工程技术有机的结合起来，建立起一套微流控细胞培养系统，采用两步培养 法在微流控芯片上构建了 NSCs三维模型。与已有的三维NSCs芯片相比，两步法建立的NSCs三维模型，操作简便，重复性好，成功率高；芯片便于倒置显微镜下观察检测；便于对细胞代谢产物进行取样分析。有望应用于新型神经类药物的毒性甄别与筛选。
发明内容
本发明提出了.一种基于微流控技术的两步构建三维神经干细胞模型的方法，是以终浓度0.5mg/ml的鼠尾I型胶原水凝胶作为三维支架，将其与20 μ m左右的“神经球”混合均匀后，接种到聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片上由若干微柱构成的特定细胞培养池中，待细胞-胶原复合物凝固之后，采用两步培养法，即培养初期向细胞培养室中注入促使神经干细胞扩增的培养基，待神经干细胞在胶原水凝胶中形成直径为50-100 μ m团簇后，改用条件培养基，使细胞由团簇中向三维空间迁移，相邻的细胞团簇内的细胞相遇，相互连接，形成一个与神经组织相类似的三维复合结构，并利用可自动操控的微流控细胞培养系统对此三维复合物进行了连续培养，并进行了初步的研究和评价。本发明的技术方案如下:(I)以鼠尾I型胶原水凝胶作为三维支架，将其与不小于20 μ m的“神经球”混合均匀后，接种到PDMS微流控芯片上由若干微柱构成的细胞培养池中，待细胞-胶原复合物凝固后，采用以下的两步培养法:第一步，培养初期以I μ 1/min的流速向细胞培养池中注入促使NSCs扩增培养基，待NSCs在胶原水凝胶中形成直径为50-100 μ m团簇；第二步，将扩增培养基更换为条件培养基，流速不变，使细胞由团簇中向三维空间迁移，相邻的细胞团簇内的细胞相遇，相互连接，形成一个与神经组织相类似的三维复合模型结构，并利用可自动操控的微流控细胞培养系统对三维复合物进行了连续培养。所述的鼠尾I型胶原的最终浓度为0.5mg/mlo所述的扩增培养基通过正交试验确定营养成分，能够促进NSCs体外扩增，并保持其生物学特性的培养基，是DMEM、F12和RPM1-1640以1:1:1比例混合，添加生长因子EGF20ng/ml、bFGF10ng/ml、血清白蛋白2mg/ml、l%荷尔蒙添加剂N2和1/1000脂类，培养基中主要的营养成分为葡萄糖4.2mg/ml、谷氨酰胺0.44mg/ml。所述的条件培养基是适合NSCs及其子细胞群体生长的培养基，是在基础培养基Neurobasal 中添加 2%B_27、10ng/ml BD NF> 10ng/ml bFGF。本发明的方法建立的NSCs三维生长的微流控培养系统，该微流控培养系统包括装有培养液进出管的无菌培养皿、微量注射泵和收集管。无菌培养皿用于放置微流控芯片，无菌培养皿的上盖与微流控芯片的进液室和废液池相对应的位置有两个孔，用于安插芯片的培养液进出管；与进液室相连的进液管在无菌培养皿的上盖下方、靠近上盖的位置设置有一个微型无菌滤器；芯片完成细胞-胶原混合物接种后，在芯片四周的培养皿中注入无菌水；再将培养皿内侧的培养液进出管分别通过微型三通与芯片上的两个进液室和两个废液池相连接后，将含有芯片的培养皿置于二氧化碳培养箱中。用于定时定量补充培养基的微量注射泵是通过无菌的连通管将微量注射泵与芯片的进液管相连，调控流速，对芯片上的NSCs三维细胞模型进行连续培养；用于培养物样品采集的收集管由芯片废液池引出的导管末端与一个1.5ml的离心管相连组成，便于收集由细胞培养室中流出的废液。本发明的效果和益处是，建立了适合神经干细胞体外三维培养的微流控系统，该系统可视、透气，可精确调控，其自动化的操作不但节约大量人工劳动，同时为细胞提供了一个与体内相似的稳定的代谢环境；采用两步培养法，使用本研究筛选确定的神经干细胞体外扩增培养基和条件培养基在微流控芯片上构建了神经干细胞三维培养模型；该模型在倒置显微镜下观察有良好的三维细胞形态，免疫荧光化学的检测结果显示了神经干细胞及其分化的子细胞的特征表型；整个培养体系为微升体积，大大缩减了各种昂贵的细胞生长因子、免疫荧光抗体、细胞的荷尔蒙添加剂的使用量，降低了细胞培养成本；该方法重复性好，可同时构建多组试验样品，有望成为新型药物筛选或环境毒素监测的神经组织替代物。
图1是微流控芯片整体设计示意图。图中:I左细胞进样孔，2右细胞进样孔；3培养基注入口 ；4废液池口 ；5细胞培养室。图2是细胞培养室的局部结构示意图。图3是芯片掩膜设计图。图4是应用于NSCs三维培养的微流控芯片外观照片。图5是利用改性的模具浇注的PDMS微柱显微镜照片。图6是采用优化后的培养基扩增得到的细胞免疫荧光检测显示呈nestin阳性图片。图7 (A)是优化培养基扩增得到的NSCs经诱导分化后的GFAP免疫荧光染色阳性图片。图7 (B)是优化培养基扩增得到的NSCs经诱导分化后的β -tubilin III免疫荧光染色阳性图片。图7 (C)是优化培养基扩增得到的NSCs经诱导分化后的RIP免疫荧光染色阳性图片。图8 (A)是NSCs接种到芯片48h在扩增培养基中的生长状态图。图8 (B)是更换为条件培养基后48h NSCs的生长状态图。图8 (C)是更换培养基后96h mNSCs的生长状态图。图8 (D)是静态三 维培养的NSCs更换培养基96h后生长状态图(对照组)。图8 (E)是静态二维贴壁培养96h的NSCs的生长状态图(对照组)。图9 (A)是芯片中生长的三维NSCs免疫荧光染色后MAP-2/DAPI的阳性表达图。图9 (B)是芯片中生长的三维NSCs免疫荧光染色后GFAP/DAPI的阳性表达图。图9(C)是芯片中生长的三维NSCs免疫荧光染色后Nestin/DAPI的阳性表达图。图10是三维培养的微流控系统示意图。图11是不同培养条件下的乳酸含量的变化示意图。图12是不同培养条件下的谷氨酰胺含量的变化示意图。
具体实施例方式实施例1适用于神经干细胞三维培养的微流控芯片的设计与制作1、微流控芯片的设计为了能给NSCs-胶原复合物的生长提供一个良好的微环境，本研究设计了一种适合NSCs-胶原复合物体外生长的微流体芯片，芯片整体设计如图1所示:图中I为左细胞进样孔，直径为2mm ；2为右细胞进样孔，直径为3mm ；3为废液出口，直径为3mm ；4为细胞培养室。细胞培养室的长度为200mm，宽度为1mm，深度为150 μ m。其内部结构如图2所示:培养室侧壁是由数个长100 μ m，宽50 μ m的微柱构成的栅栏状结构，每个微柱间隔20 μ m。细胞进样孔与培养室之间为宽400 μ m的进样通道。细胞培养室两侧为宽500 μ m侧通道，用来输送培养基或其他调控细胞生长的化学成分。此芯片的工作原理是将NSCs-胶原的混合液通过细胞进样口进入芯片培养室中，微柱阵列起到拦截作用，以确保细胞与胶原存留在培养室中。待NSCs-胶原凝胶凝固后，利用微量注射泵将培养基注入芯片的侧通道，培养基通过微柱阵列的空隙渗透到三维复合物中，为细胞的生长提供养分；同时，细胞新陈代谢产生的副产物也扩散到培养基中，随着培养基的流动，最终被带到废液口排出。2、芯片模具的设计与制作本实验芯片的加工与制作将采用具有透光性、透气性及良好的生物相容性的聚合物材料聚二甲基娃氧烧(polydimethylsiloxane, PDMS),通过模具烧注的方法使PDMS成形。首先进行模具的设计制作。模具采用4寸硅片通过光刻工艺和干法刻蚀来完成。光刻所需的掩膜设计如图3所示，由深圳清溢光电股份有限公司完成铬板掩膜的制作，模具制作流程如下:(1)硅片清洗:浓硫酸煮沸，待冷却后用去离子水冲洗；然后用I号硅片标准清洗液(体积比:去离子水:双氧水:氨水=5:2:1)煮沸，冷却后再用去离子水冲洗；用2号硅片标准清洗液(体积比:去离子水:双氧水:盐酸=8:2:1)煮沸，冷却后用去离子水清洗，烘干备用。(2)硅片氧化:氧化炉中湿法氧化3小时，温度1180°C，烘箱保存备用。(3)甩胶:选用BP212正胶，采用中科院微电子中心研究部生产的KW5-型台式匀胶机进行甩胶，参数为低速500rpm，4秒，高速2600rpm，30秒。(4)前烘:采用烘板加热至85°C，保持30min。(5)曝光:采用德国SUSS光刻机，紫外光强4.7mW/cm2，将掩膜与硅片上胶层紧贴，曝光50s。(6)显影:采用0.125M的NaOH溶液作为显影液，显影28s。(7)后烘:烘板加热至85°C，保持40min。(8)干刻Si02层:干刻工艺采用法国产AMS-100刻蚀设备来完成，刻蚀气体为C4F8,刻蚀6分，上电极2800W，下电极300W。(9)干刻S1:刻蚀气体为SF6与C4F8交替进气，25分钟，上电极2800W，下电极40W。刻蚀深度在150 μ m。(10)去胶、去氧化层:去胶采用丙酮溶液浸泡，然后依次用无水乙醇，去离子水清洗干净。采用HF = H2O=1:10 (V:V)溶液去氧化层，模具制作完成。3、PDMS芯片的制作模具制作完成后就可以进行PDMS芯片的制作。以10:1 (v:v)的比例将PDMS母液与固化剂混合搅拌均匀，浇注于模具上，抽真空使得PDMS完全脱气，直到PDMS中没有气泡为止。将浇注好的模具放入烘箱中升温至80°C，烘两个小时，这时PDMS已经完全固化，然后将固化好的PDMS从模具上剥离下来，完成芯片的制作。4、PDMS芯片的封装PDMS芯片完成后，需要对芯片进行封装。采用K1050X型等离子去胶机，在15W功率下对待键合的PDMS表面和玻璃基片的表面进行氧等离子体处理50s，随即将处理好的表面紧贴确保互相接触的表面之间没有气泡存在，放入烘箱中100°C烘2分钟，冷却即可。这样，完整的芯片制作完成。5、芯片外观本发明制作的芯片以生物相容性好、可透气及透明可视的PDMS为原材料，经过模具浇注的方式成型，最后通过氧等离子处理后，与载玻片键合封接，芯片外观如图4所示。其中细胞培养池的尺寸为20mmXlmmX0.15mm (长宽高)，小柱子的尺寸为100ymX50ymX150ym (长宽高)，小柱子间的空隙为20 μ m，其特征显微镜下可见图5。实施例2NSCs体外无血清扩增培养基的筛选本实施例旨在实现无血清培养条件下，NSCs在体外的大量扩增，进而为构建NSCs三维模型提供充足的细胞数。实验选用DMEM/F12/RPMI1640 (1:1:1, V:V:V)的混合培养液作为基础培养基，在常用的添加剂中选取4种关键组分:葡萄糖(Glucose)，谷氨酰胺(Glutamine)，脂类(Lipids)，牛血清白蛋白(BSA)，建立4因素三水平正交实验，来确定这4种组分在扩增培养基中的最佳添加剂量及其对NSCs的扩增效果。正交实验分为9组，在24孔培养板上进行，每组选取3孔进行平行实验。实验细胞来自于小鼠E14前脑的第3代NSCs，以5X 104cellS/ml的密度接种到含有基础培养基的孔板中。为防止蒸发，将培养板置于经过灭菌的湿盒中，然后将培养板连同湿盒一同放置于37°C,5% CO2培养箱中孵育。每天跟踪细胞的生长情况，同时轻轻摇晃孔板防止神经球贴壁。培养期间不作换液处理，细胞经连续培养5 6天后，用台盘兰计数活细胞数。以上实验重复三次。表I四因素三水平正交试验表
权利要求
1.一种基于微流控技术的两步构建三维神经干细胞模型的方法，其特征包括以下步骤， (I)以鼠尾I型胶原水凝胶作为三维支架，将其与不小于20 μ m的“神经球”混合均匀后，接种到PDMS微流控芯片上由若干微柱构成的细胞培养池中，待细胞-胶原复合物凝固后，采用以下的两步培养法: 第一步，培养初期以1μ Ι/min的流速向细胞培养池中注入促使NSCs扩增培养基，待NSCs在胶原水凝胶中形成直径为50-100 μ m团簇； 第二步，将扩增培养基更换为条件培养基，流速不变，使细胞由团簇中向三维空间迁移，相邻的细胞团簇内的细胞相遇，相互连接，形成一个与神经组织相类似的三维复合模型结构，并利用可自动操控的微流控细胞培养系统对三维复合物进行了连续培养。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征是所述的鼠尾I型胶原的最终浓度为0.5mg/ml ο
3.根据权利要求1或2中所述的方法，其特征在于，所述的扩增培养基是通过正交试验确定营养成分的，能够促进NSCs体外扩增，并保持其生物学特性的培养基，是DMEM、F12和RPM1-1640以1:1:1比例混合，添加生长因子EGF20ng/ml、bFGF10ng/ml、血清白蛋白2mg/ml、l%荷尔蒙添加剂N2和1/1000脂类，培养基中主要的营养成分为葡萄糖4.2mg/ml、谷氨酰胺 0.44mg/ml。
4.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述的条件培养基是适合NSCs及其子细胞群体生长的培养基，是在基础培养基Neurobasal中添加2%B_27、10ng/ml BDNFUOng/ml bFGF。
5.按照权利要求1 4的方法建立的NSCs三维生长的微流控培养系统，其特征在于，该微流控培养系统包括装有培养液进出管的无菌培养皿、微量注射泵和收集管: (1)无菌培养皿用于放置微流控芯片，无菌培养皿的上盖与微流控芯片的进液室和废液池相对应的位置有两个孔，用于安插芯片的培养液进出管；与进液室相连的进液管在无菌培养皿的上盖下方、靠近上盖的位置设置有一个微型无菌滤器；芯片完成细胞-胶原混合物接种后，在芯片四周的培养皿中注入无菌水；再将培养皿内侧的培养液进出管分别通过微型三通与芯片上的两个进液室和两个废液池相连接后，将含有芯片的培养皿置于二氧化碳培养箱中； (2)用于定时定量补充培养基的微量注射泵:通过无菌的连通管将微量注射泵与芯片的进液管相连，调控流速，对芯片上的NSCs三维细胞模型进行连续培养； (3)用于培养物样品采集的收集管:由芯片废液池引出的导管末端与一个1.5ml的离心管相连，便于收集由细胞培养室中流出的废液。
全文摘要
本发明涉及一种基于微流控技术的两步构建三维神经干细胞模型的方法，其特征是以鼠尾I型胶原作为三维支架，以微柱阵列式微流控芯片为培养平台，采用两步培养法，即培养初期向细胞培养室中注入促使神经干细胞扩增的培养基，后期改用适合神经干细胞及其子细胞生长的条件培养基，通过模拟体内神经发生不同阶段的微环境，形成一个与神经组织相类似的三维复合结构。本发明建立的方法重复性好，可同时构建多组试验样品；所采用的微流控培养体系为微升体积，并可精确调控，大大缩减了细胞培养过程各种昂贵的细胞生长因子、免疫荧光抗体、细胞的荷尔蒙添加剂的使用量，降低了细胞培养成本。因此有望成为新型药物筛选或环境毒素监测的神经组织替代物。
文档编号C12M3/00GK103146650SQ201310057768
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月23日 优先权日2013年2月23日
发明者刘军山, 葛丹, 刘天庆, 马学虎, 刘冲 申请人:大连理工大学