专利名称：：三角褐指藻二酰基甘油转移酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物基因技术，特别涉及一种与三酰基甘油酯合成相关的三角褐指藻二酰基甘油转移酶(Ptdagat)及其编码基因与应用，属于基因工程
技术领域：
。尤其是涉及高油脂含量的能源微藻的遗传工程藻种构建。
背景技术：
：能源是国家经济和社会发展的命脉。随着化石能源资源的枯竭，原油价格一路攀升，以及化石能源的燃烧导致大气中(X)2量的净增加以致环境与气候的恶化，世界各国不得不考虑加快石油替代原料的研究与开发步伐，其中生物柴油被视为一种可再生的取代能源越来越受到重视。如今我国对石油的需求量已居世界第一，因此，石油一旦出现危机必将会严重影响我国经济的发展与社会的稳定。所以，中国工程院院长徐匡迪及众多的中国能源专家都认为“立足于本国原料大规模生产替代液体燃料——生物柴油(biodiesel)，对增强中国石油安全具有重要的战略意义”。我国工业化生物柴油目前主要还是以大豆和油菜籽等油料作物、油棕和麻风树等油料木果实以及动物油脂、废餐饮油等为原料制备，生物柴油的原料虽然多样，但各种原料来源是非常有限的，就算把它们加起来也难以满足人类对燃油的需求。在生物柴油开发和利用的同时，世界各国都面临着生物质原料供应不足这样一个“瓶颈”问题，因此寻找新一代的生物柴油原料已经迫在眉睫。微藻(microalgae)能用海水培养，能耐受沙漠、干旱地、半干旱地等极端环境，不占用耕地，因此不会对粮食作物的生产构成威胁；微藻能吸收并利用工农业生产中排放出的大量0)2和氮化物，或从废水中取得氮、磷等，有利于改善环境。微藻(microalgae)因易于培养、具有单位面积产量大等优点，被视为新一代的、甚至是唯一能实现完全替代石化柴油的生物柴油原料。早在二十世纪70年代，美国对利用微藻生产生物柴油就产生了浓厚的兴趣，并在八十年代初由国家可再生能源实验室(theNationalRenewableEnergyLaboratory,NREL)牵头并联合了多个单位进行可用于生产生物柴油微藻资源调查与筛选等基础研究。尽管微藻的种类繁多，但它们就像农作物一样，不同种类积累不同的代谢产物。因此，要从这些微藻中筛选出藻油含量高并适合当地环境培养的藻种，是非常繁杂的工作。三角褐指藻是目前已能大规模人工培养的海洋微藻，其油脂含量达20-30%，被认为是有生物能源应用前景的海洋微藻，但其油脂含量并不是很理想，离微藻能源产业化应用还有很远的距离。三角褐指藻储存油脂的合成是KennedyPathway.在细胞的内质网上，二酰基甘油转移酶(DAGAT，DiaCylglyCerolAcyltransferase)以脂酰基CoA为原料，催化二酰基甘油(DAG)合成细胞内贮存油脂，三酰基甘油(TAG)。因此DAGAT是目前研究油料植物用于生物燃料方面最受重视的一个酶。目前，在这些生物体mouse(Musmusculus)、Arabidopsisthaliana、tobacco(Nicotianatabacum)中鉴定到了几个编码DAGAT的cDNA，但用于实际生产，获得转基因植株应用的报道很鲜见，尤其利用DAGAT培育高油脂含量的藻类基因工程育种中还没有相关报道。此外不同来源的DAGAT的酶活性和特异性也会有差异，因此本发明具有重要实际应用前景。
发明内容本发明的目的是提供一个能显著提高转基因藻的油脂含量的三角褐指藻二酰基甘油转移酶(Ptdagat)；及该二酰基甘油转移酶的编码基因与应用。本发明提供的二酰基甘油转移酶，名称为Ptdagat，来源于硅藻门褐指藻属的三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)，其氨基酸残基序列如SEQIDNo:2所示；或与氨基酸残基序列SEQIDNo2具有95%的同源性且与其具有相同活性的并由SEQIDNo2衍生的蛋白质；或将SEQIDNo:2经过一个或多个氨基酸取代、缺失或添加具有与SEQIDNo2相同功能的而由SEQIDNo2衍生的蛋白质。序列表中SEQIDNo2的氨基酸残基序列是由5个氨基酸残基组成的蛋白质。编码本发明的三角褐指藻二酰基甘油转移酶的基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQIDNo1；2)编码与序列表中SEQIDNo2蛋白质序列的核苷酸序列；3)与序列表SEQIDNo1限定的核苷酸序列具有90%以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。序列表中SEQIDNo1的DNA序列是由1587个碱基组成，其读码框为自5，端的第一个碱基到第1587位碱基。本发明的另一目的是提供一种提高藻类或植物油脂含量的方法。本发明所提供的方法，是将本发明的三角褐指藻二酰基甘油转移酶编码基因，应用分子生物学手段，将其连接到能启动该基因转录的藻类或植物启动子下游，构建相应的表达载体，然后应用基因枪或根瘤农杆菌介导或其他化学转化法等，将表达载体导入藻类细胞或植物细胞内时，使本发明所述基因能在转基因个体中成功表达，获得油脂成份和含量改良的转基因藻类细胞或转基因植物组织和植株。因此本发明对能源微藻育种或油料植物改良具有重要理论意义和应用价值。本发明培养所得的转基因藻，抽提其总油脂，与野生型三角褐指藻的油脂含量进行比较，同时，用实时定量RT-PCR检测转基因藻和非转基因藻的Ptdagat编码基因的表达情况。结果显示，含Ptdagat编码基因过量表达结构的转基因藻的基因表达水平显著高于野生型三角褐指藻。进一步抽提油脂含量分析，显示，含Ptdagat编码基因过量表达结构的转基因藻的油脂含量达到了35%，明显高于野生型三角褐指藻的25%。因此本发明用于提高藻类等油脂生产植物的油脂含量，促进生物能源的发展具有实际应用前景。图1为Ptdagat编码基因在三角褐指藻几种不同生长条件下的表达情况。图2为Ptdagat编码基因表达的反义抑制及RNA干扰引起了基因工程藻油脂含量的显著变化。图3为Ptdagat编码基因在三角褐指藻中的过量表达引起了基因工程藻的油脂含量显著增加。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例一三角褐指藻Ptdagat基因的分子克隆三角褐指藻二酰基甘油转移酶(Ptdagat)基因全长cDNA的获得，主要包括以下几个步骤采用来自拟南芥的二酰基甘油转移酶(AY0M480)在已经完成全基因组测序(theUSDepartmentofEnergyJointGenomeInstitute(http://www.jgi.doe.gov/))的三角褐指藻基因组数据库中做Blast分析，找到了一个编码二酰基甘油转移酶的部分序列，根据该序列分别设计一对引物Pl(上游弓丨物)，5，-CACGCTACGATAACATGGATGAA-3，；P2(下游引物)，5，-CAATCTTTGTAGAACACACGATCTC-3，；提取对数生长期的三角褐指藻的总RNA(RNAextractkit,Watson,Shanghai,China)，以此RNA为模板，用AMV逆转录酶(TaKaRa,Dalian,China)合成cDNA；在引物Pl和P2指引下，以所合成的cDNA为模板，PCR反应液在95°C下保持5分钟，紧接着经历35个循环，其步骤是95°C30秒，55°C退火30秒，在72°C延伸2分钟。待35个循环完成后，PCR反应液在72°C保温10分钟。所得PCR产品用的琼脂糖凝胶纯化回收，克隆到测序载体PMD-18T载体中，经测序分析正确后，采用RACE技术获得三角褐指藻二酰基甘油转移酶基因全长cDNA序列；其核苷酸序列由1587个碱基组成，见SEQIDNo:1，其编码的蛋白质序列含5个氨基酸残基，见SEQIDNo:2。实施例二Ptdagat编码基因在三角褐指藻几种不同生长条件下的表达情况图1中，A表示用正常的含硅元素的f/2培养基培养三角褐指藻，B表示不添加硅元素营养盐的f/2培养基培养三角褐指藻。由图1A、B可见，前者的Ptdagat基因表达水平没有后者高，通过提取两组的油脂含量分析，结果后者的油脂含量也相应高些。这说明本发明所述基因的表达水平与三角褐指藻的油脂含量成正相关。图1中的C、D、E、F表示在三角褐指藻培养基中分别添加不同浓度的脱落酸ABA(0mg/L、lmg/L、5mg/L、15mg/L)，结果显示培养基中不同浓度的ABA引起了三角褐指藻的Ptdagat基因表达水平的差异，在5mg/L的ABA时，Ptdagat的表达水平最高，结果其油脂含量也是最高。图1中的G、H、I、F表示在三角褐指藻培养基中分别添加不同浓度的铁离子；G，表示在培养基中没有添加铁，I表示是正常f/2培养基的铁离子含量，而H只有I的一半的铁离子含量，F是二倍I的铁离子含量。结果显示较高的铁离子含量可以促进Ptdagat基因的表达，同样其油脂含量也是最高。以上实验结果说明，能促进Ptdagat基因表达的培养条件都提高了油脂含量。实施例三Ptdagat编码基因表达的反义抑制及RNA干扰引起了基因工程藻油脂含量的显著变化Ptdagat基因在三角褐指藻中的反义RNA(antisense)抑制情况以Ptdagat编码基因的第34to984碱基共951个核苷酸序列为材料，把这段序列反向克隆到三角褐指藻的表达载体如pPha-ΤΙ的多克隆位点上，这样就构建了与Ptdagat编码基因反向互补的反义RNA表达载体。用基因枪(BiolisticPDS-1000/HeParticleDeliverySystem)转化三角褐指藻，用&0(^11抗生素筛选阳性克隆，然后再用PCR进一步检测阳性克隆，并经测序分析结构的正确性后，转基因藻用于培养、并分析其油脂含量。实验结果显示反义RNA抑制了Ptdagat编码基因的表达，转基因藻的油脂含量有明显降低，其油脂含量由野生型的三角褐指藻的25%油脂含量下降到了反义RNA工程藻22%油脂含量的，如图2A，B，C所示。Ptdagat基因在三角褐指藻中的RNA干扰(RNAi)抑制情况以Ptdagat编码基因的第525到984碱基共460个核苷酸序列为材料，把这段序列分别按正向和反向克隆到一个内含子的两侧，把包含正向，内含子和反向的序列结构克隆到三角褐指藻的表达载体如pPha-Tl的多克隆位点上，这样就构建了可以干扰Ptdagat编码基因表达的RNAi表达载体。用基因枪(BiolisticPDS-1000/HeParticleDeliverySystem)转化三角褐指藻，用kocin抗生素筛选阳性克隆，然后再用PCR进一步检测阳性克隆，并经测序分析结构的正确性后，转基因藻用于培养、并分析其油脂含量。实验结果显示RNA干扰结构抑制了Ptdagat编码基因的表达，含RNA干扰结构的转基因藻的油脂含量有显著降低，由野生型的25%的油脂含量降到含RNA干扰结构的转基因藻的15-20%。如图2C，D，E，F所示，且干扰RNA抑制程度比反义RNA的抑制程度要深。该实例说明本发明所述酶或基因控制了三角褐指藻的油脂合成及含量高低。实施例四Ptdagat编码基因在三角褐指藻中的过量表达引起基因工程藻油脂含量显著增加以本发明所述基因为材料，把这个基因序列用限制性内切酶克隆到三角褐指藻的表达载体如PPha-Tl的多克隆位点上，这样就构建了本发明所述基因的表达载体。用基因枪(BiolisticPDS-1000/HeParticleDeliverySystem)转化三角褐指藻，用kocin抗生素筛选阳性克隆，然后再用PCR进一步检测阳性克隆，并经测序分析结构的正确性后，转基因藻用于培养、并分析其油脂含量。培养所得的转基因藻，抽提其总油脂，与野生型三角褐指藻的油脂含量进行比较，同时，用实时定量RT-PCR检测转基因藻和非转基因藻的Ptdagat编码基因的表达情况。结果显示，含Ptdagat编码基因过量表达结构的转基因藻的基因表达水平显著高于野生型三角褐指藻，进一步抽提油脂含量分析，显示，含Ptdagat编码基因过量表达结构的转基因藻的油脂含量达到了35%，明显高于野生型三角褐指藻的25%，如图3所示。因此本发明用于提高藻类等油脂生产植物的油脂含量，促进生物能源的发展具有实际应用前景。参考文献ULardizabalKD,MaiJT,WagnerNW,WyrickA,VoelkerT,HawkinsDJ(2001)DGAT2isanewdiacylglycerolacyltransferasegenefamily!purification,cloning,andexpressionininsectcells,JBiolChem,2001,276,38862-38869.2、TimothyP.Durrett,ChristophBenningandJohnOhlrogge.Planttriacylglycerolsasfeedstocksfortheproductionofbiofuels,ThePlantJournal,2008,54，593-607.3、JakoC,KumarA,WeiY,ZouJ,BartonDL,GiblinEM,CovelloPS,Taylor6DC.2001.Seed-specificover-expressionofanArabidopsiscDNAencodingadiacylglycerolacyltransferaseenhancesseedoilcontentandseedweight.PlantPhysiology，126，861-874.4、KrishnakumarJ，VenkatachalapathyKVS,ElancheliyanS.2008.Technicalaspectsofbiodieselproductionfromvegetableoils.ThermalScience，12，159-169.5^WuG，TruksaM，DatlaN，VrintenP，BauerJ,ZankT，CirpusP，HeinzE，QiuX.Stepwiseengineeringtoproducehighyieldsofverylong-chainpolyunsaturatedfattyacidsinplants.NatureBiotechnology，2005，23，1013-1017·6、Tonon，T.，Harvey,D.，Larson，T.R.andGraham，I.A.LongchainpolyunsaturatedfattyacidproductionandpartitioningtotriacylglyceroIsinfourmicroalgae，Phytochemistry,2002，61，15-24.7、AbbadiA，HeinzaE，etal.Biosynthesisofvery-long-chainpolyunsaturatedfattyacidsintransgenicoilseeds!constraintsontheiraccumulation.ThePlantCell，2004，16，2734-2748.8、LardizabalK，EffertzR，LeveringC，MaiJ,PedrosoMC，JuryT，AasenE，GruysK,BennettK.ExpressionofUmbelopsisramannianaDGAT2Ainseedincreasesoilinsoybean.PlantPhysiology，2008，148，89—96.9、LineSandager,MariaH.Gustavsson,UlfStahljAndersDahlqvist,EvaWiberg.StorageLipidSynthesisIsNon-essentialinYeast,JBiolChem，2002，277,6478-6482.10、UlfStahl,AndersS.Carlsson,MaritLenman,AndersDahlqvist,BangquanHuang，WalentynaBanas,AntoniBanas,StenStymne.CloningandFunctionaICharacteriζationofaDiacylglycerolAcyltransferasefromArabidopsis，PlantPhysiology,2004，135，1324-1335.11、D.H.Hobbs,M.J.Hills.ExpressionandcharacterizationofdiacylglycerolacyltransferasefromArabidopsisthaiianaininsectcellcultures，BiochemicalSocietyTransactions，2000，28，687—689·12、ShiJuan,PanKehou,WangXiaoqing，ChenFang，ZhouMi，ZhuBaohua，QingRenwei*.HierarchicalrecognitiononthetaxonomyofNitzschiaclosteriumf.minutissima,ChineseScienceBulletin，2008，53(2)，245—250.权利要求1.一种三角褐指藻的二酰基甘油转移酶，其氨基酸残基如序列表中SEQIDNo:2所7J\ο2.编码权利要求1所述二酰基甘油转移酶的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因的碱基序列如序列表中SEQIDNo1所示。4.含有权利要求2所述基因的表达载体。5.含有权利要求2所述基因的转基因细胞系。6.一种提高藻类或植物油脂含量的方法，是将权利要求2所述编码的二酰基甘油转移酶基因导入藻类或植物组织或细胞。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述植物包括藻类植物、或单子叶植物、或双子叶植物。全文摘要本发明公开了一个三角褐指藻二酰基甘油转移酶及其编码基因与应用，属于基因工程
技术领域：
。该三角褐指藻二酰基甘油转移酶的氨基酸残基序列如SEQIDNo2所示。编码三角褐指藻二酰基甘油转移酶的基因，是下列核苷酸序列之一1、序列表中的SEQIDNo1；2、编码与序列表中SEQIDNo2蛋白质序列的核苷酸序列；3、与序列表SEQIDNo1限定的核苷酸序列具有90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。实验证明，本发明的转基因可显著提高藻类油脂含量，从而为藻类的油脂含量改善提供了一个优质基因，具有广阔的应用前景和重要的应用价值。文档编号C12R1/91GK102199580SQ20111007565公开日2011年9月28日申请日期2011年3月28日优先权日2011年3月28日发明者傅华龙,兰利琼,凃丽,卿人韦,曲芳兵,李湘,汪乐霓申请人:四川大学