专利名称：细胞周期s期报告基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和基因工程领域，具体地讲，涉及一个报告基因。
背景技术：
报告基因是一种编码某种易于检测的蛋白质或酶的基因，把报告基因的编码序列与其他目的基因融合，在调控序列控制下进行表达，通过报告基因的表达产物可标定目的基因的表达状况。报告基因技术因具有高灵敏度、检测方便等特点，被广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选等多种细胞事件。随着技术和检测方法的进步，荧光素酶以其能够将细胞内基因的活性可视化和对细胞的无毒性而越来越成为主流，并且荧光素酶报告基因技术已被广泛应用于体外监测细胞生长和增殖。细胞的正常生长、分裂，必须依次经过准备阶段的间期和有丝分裂期，细胞周期的正常运行，受到特异的细胞周期素和细胞周期依赖性蛋白激酶的精确调控，同时，还伴随着多种特异性分子的合成和降解。基于此，将荧光素酶报告基因与某一细胞周期特异性分子基因融合，便可通过观察荧光素酶报告基因反映特异性分子的表达情况，进而间接地了解细胞周期的变化及增殖情况。S 期激酶相关蛋白 2 (S-phase kinase associated protein 2，SKP2)是人类 F-box蛋白家族中的一员。研究发现，SKP2主要参与Gl期与S期的调控，是细胞进入S期的必须蛋白。SKP2在Gl-S期之间出现，于S-G2期升高，到M期时则因上皮-钙粘连素 (⑶Hl)介导的泛素化而迅速下降。因此，SKP2的表达变化可准确地反映出细胞周期由Gl 期向S期转变的过程，将荧光素酶与SKP2融合，便可构建出反映细胞周期S期的报告基因。根据以前的研究，细胞周期的分析主要基于两种生物学技术，一种是5溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromodeoxyuriding，BrdU)掺入法，其主原理是5-BrdU可在S期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子。另一种是应用流式细胞术进行细胞周期分析，其原理是利用各期的DNA含量的不同。但两种方法都只能在细胞水平观测细胞周期的变化，而无法实现体内细胞周期监测。近年来，通过体内细胞标记进而实现体内细胞周期监测的方法不断涌现，如溴脱氧尿苷和放射性核素等标记细胞和分子，但这些技术却存在细胞毒性作用， 而且随着细胞不断分裂，标记信号逐渐消失。细胞周期报告基因则因其对细胞无毒性，可进行体内细胞周期监测而很好地克服了以往细胞周期分析技术的不足。
发明内容
本发明的目的是设计一种新的报告基因，用于检测细胞周期的变化。本发明的另一个目的是提供上述报告基因为抗肿瘤药物疗效的评价提供一种新的检测方法。本发明的另一个目的是提供上述报告基因在分子生物学方面的研究应用。本发明的另一个目的是提供上述报告基因在转基因动物中的应用。本发明是采用PCR的方法从基因组中扩增出SKP2基因并对它进行分析，然后克隆到PCDNA3. 1 ( + )-luc2质粒上，并转化到大肠杆菌中，提取质粒，并对它进行酶切和测序分析，再将鉴定正确的质粒转染到细胞中进行各项功能分析。SKP2和细胞周期依赖的基因调控之间密切相关，在正常细胞增殖调控中起重要作用。现已有许多细胞周期相关分子被证实经由SKP2依赖泛素蛋白酶体降解，包括如E2F， cyclinDl, cyclinE, cyclinA, cyclinB, CDC25B, p21wafl, p27kipl, p53。其中最重要的是 p27，p27kipl是重要的细胞周期负性调控因子，细胞由静止状态进入增殖状态需p2^dpl 的降解，cyclinE-⑶K2复合物的激酶活性使p2^dpl的187位苏氨酸110磷酸化，SKP2 特异性作用于磷酸化的P2^dpl，使其通过泛素蛋白酶体途径降解，从而解除p2^dpl对 cyclin-CDK的抑制作用，使细胞顺利通过细胞周期G S转变的检测点，细胞周期得以正常进行。同时SKP2的表达水平受CDHl的泛素化调节，在M期迅速被CDHl介导的泛素化降解。本发明所提供的DNA序列，如图1所示，代表的是报告基因SKP2-luc2的序列。其序列从907至3864共四58个bp，具有报告细胞是否处于S期的能力。232到819是启动子(CMV)J956到四58是终止密码子。本发明的有益效果本发明以报告基因的表达来观测细胞周期的变化的策略有如下几个优点1、可体内监测细胞周期的变化，克服了流式等技术只能在细胞水平的观察细胞周期的缺点，为动物实验提供了一个强有力的工具。2、可早期监测疾病的增殖情况，能达到对药物疗效进行早期评价，缩减药物的研发时间和减少研发费用。克服了传统影像学只能从解剖水平对疾病描述的局限，及核素标记存在的细胞毒性的局限。
图 1 为 PCDNA3. 1 ( + ) -SKP2-1UC2 构建图； 图 2 为 pCDNA3. 1 ( + ) -SKP2-luc2 酶切结果； 图3为细胞周期同步化后结果A、流式结果，B、荧光素酶的活性结果； 图4为chdl-siRNA干扰后实验结果A、westernbl0t结果，B、荧光素酶活性结果； 图5为蛋白酶体抑制剂MG132、ALLN作用后实验结果=Aiesternblot结果，B、荧光素酶活性结果。
具体实施例方式1质粒的构建
1.1引物设计
根据引物设计及质粒设计要求分别加入NheI及Hind III酶切位点。Sense:
5’ -GCGCGCTAGCGCCACCATGCACAGGAAGCACCTCCA-3’ Anti-Sense
5 ’ -GCGCAAGCTTGACAACTGGGCTTTTGCAGTGT-3’ 1.2扩增目的基因片段
1.2. 1在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌PCR-EP管中 IOXBuffer buffer 5 μ 1 dNTPmix(2 Mm) 4 μ 1
4引物 1 (10 Rn) 2 μ 1
引物 2 (10 Rn) 2 μ 1
DNA 模板(pCDNA3 myc-SKP2)1 μ 1
加 ddH20 至50 μ 1
1.2. 2调整好反应程序。置于PCR仪上，PCR反应参数为94°C 25秒，58°C 30秒， 720C 60 S,循环30次。最后72°C，保温7 min。1. 2. 3取PCR产物用于电泳检测 1.3连接
步骤①将质粒PCDNA3. 1 (+)-luc2 (先用Hind III和NheI内切酶处理)与插入DNA片段混合制备成体积为10 μ 1的DNA溶液，载体DNA和插入DNA的比例为0. 03 pmol 0. 3 pmol ；②向上述DNA溶液中加入等体积10 μ 1的连接酶，充分混勻；③16°C反应30分钟。2重组质粒的转化和鉴定
2.1 转化
步骤①从-80°C冰箱中取一支感受态细胞悬液融解(从大连宝生物公司购买)；②、加入上述DNA产物2 μ 1，轻轻摇勻，冰上放置30 min ；③42°C水浴中热击90秒；④冰上冷击却5 min ；⑤取上述菌涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37°C培养16 h;⑥挑选10单个的白色菌落分别放在5 ml含Amp的 LB培养基中过夜培养。2.2质粒提取
材料质粒小提试剂盒(天根公司，目录号DP103-03)，上述过夜培养的菌液步骤①柱平衡步骤向吸附柱CP3中加入500 μ 1的平衡液BL，12，000 rpm离心1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；②取1-5 ml过夜培养的菌液， 加入离心管中，使用常规台式离心机，12，000 rpm离心1分钟，吸除上清；③向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μ 溶液Ρ1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；④向离心管中加入250 μ 溶液Ρ2，温和地上下翻转6 — 8次使菌体充分裂解；⑤向离心管中加入；350 μ 1溶液Ρ3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混勻，12,000 rpm Cl3,400Xg )离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀；⑥将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，12，000 rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；⑦向吸附柱CP3中加入500 μ 1去蛋白液PD，12,000 rpm离心30 - 60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回；⑧向吸附柱CP3中加入600 μ 漂洗液PW， 12，OOOrpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；⑨向吸附柱 CP3中加入600 μ 1漂洗液PW，12，000 rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液；⑩将吸附柱CP3放入收集管中，12，000 rpm离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除；
Θ将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100 μ 洗脱缓
冲液ΕΒ，室温放置2分钟，12，000 rpm离心1分钟将质粒溶液收集到离心管中。2. 3 酶切
材料上述提取质粒，内切酶Hind III (宝生物公司)，内切酶NheI (宝生物公司) 步骤分四组第一组20 μ 1体系中3 μ 1 DNA, 2 μ 1 10XBuffer, 15 μ 1无菌水，第二组 20 μ 1 体系中 3 μ 1 DNA, 2 μ 1 10XBuffer,l μ 1 Hind III内切酶，14 μ 1 无菌水， 第三组 20 μ 1 体系中 3 μ 1 DNA，2 μ 1 10XBuffer,l μ 内切酶 Nhel，14 μ 1 无菌水， 第四组 20 μ 1 体系中 3 μ 1 DNA，2 μ 1 10XBuffer,l μ 1 Hind III内切酶，1 μ 1 内切酶 Nhel,13 μ 1无菌水。轻轻混勻后在37° C环境下酶切2 h。结果见图2。2. 4将上述酶切正确的质粒菌种送公司测序。3 建立稳定转染 pCDNA3. 1 ( + )SKP2_luc2 和 pCDNA3. 1 ( + )_luc2 的细胞株及鉴定 3.1转染
材料HeLa 细胞，U20S 细胞，pCDNA3. l( + )SKP2_luc2 质粒，Lipofectamine 2000,6418, pCDNA3. 1 ( + )-luc2 质粒。步聚①取六孔板的培养皿，分别加入一定量的3X105HeLa细胞和U20S细胞 37° C培养，至70%左右汇合；②根据Lipofectamine2000的说明书加8. 0 μ g pCDNA3. 1 ( + )SKP2-luc2 质粒 DNA 和 pCDNA3. 1 ( + )_luc2 质粒 DNA 及 20 μ 1 的 Lipofectamine2000 进行转染；③转染48 h后加将细胞转到100 mm的培养皿中进行培养；④加G418(1000 μ g/ ml)进行筛选，每二天换一次液，筛选时间为2周后扩大培养。这种转染好的细胞分别命名为 HeLa pCDNA3. 1 ( + ) SKP2_luc2 细胞，HeLa pCDNA3. 1 ( + ) luc2 细胞，U20SpCDNA3. 1 ( + ) SKP2-luc2 细胞，U20S pCDNA3. 1 ( + ) luc2 细胞。3. 2 鉴定
步聚取六孔板的培养分别加入适量上述的HeLa pCDNA3. 1 ( + ) SKP2_luc2细胞、HeLa PCDNA3. 1 ( + )luc2细胞、HeLa细胞，培养到子数生长期，用RLB裂解液裂解(Promega公司) 细胞提取蛋白。利用BCA (试剂盒购买自碧云天公司)法检测蛋白浓度，蛋白分两部分，一份用来检测荧光素酶活性，一份用来做westernblot检测蛋白。4检测报告基因的功能 4.1细胞周期同步化
材料=HeLa pCDNA3. 1 ( + )SKP2_luc2 细胞，胸苷(Thymidine)，羟基脲(hydroxylurea) 步骤①取60mm的培养皿6 (分别命名为1-6号)个第个里加适量的HeLa ρ⑶NA3. 1 ( + )SKP2-luc2细胞，将细胞培养至指数生长期的早期(密度大概50%左右);②往(1-5号， 6号用来做对照)加入含2. 5 mmol / L Thymidine (sigma公司)的培养基用于肿瘤细胞的同步化培养，作用M h ；③弃掉含Thymidine培养基，用PBS液洗2次，再换上新鲜培养基继续温浴10 h;④加入1 mmol / L hydroxylurea (sigma公司)进行第2次阻断，作用 14 h;⑤再弃含hydroxylurea培养基，PBS液洗2_3次后换上普通培养基，进行第一次取样。细胞一分为二，一部分细胞用于流式，一部分用于蛋白样品的提取；⑥以后每3 h取一次样。4. 1. 1 流式分析
步骤①将上述用于做流式的细胞用PBS洗二遍；②用70%的冰浴酒精过夜固定；③离心离去乙醇，PBS清洗一次；④每管细胞样品中加入0. 5 ml碘化丙啶染色液(碧云天公司)， 缓慢并充分重悬细胞沉淀，37°C避光温浴30分。V、上机。结果见图3. A04. 1.2荧光素酶活性的检测
步聚①、BCA法测蛋白浓度；②、利用发光仪(lumat LB 9507，BERTHO⑶公司)检测荧光素酶活性。结果见图3. B。
4.2 CDHl-siRNA 干扰实验
材料HeLa pCDNA3. 1 ( + ) SKP2_luc2 细胞禾Π HeLa pCDNA3. 1 ( + ) luc2 细胞， Lipofectamine2000, CDHl-siRNA 及 NC-siRNA (序列如下)。步骤①用DEPC水处理相关实验用品；②取60 mm的培养皿6个，每孔分别加入适量的 HeLa pCDNA3. 1 ( + ) SKP2_luc2 细胞和 HeLa pCDNA3. 1 ( + )luc2 细胞；③根据 Lipofectamine2000anvitrogen 公司)的说明书加 200 pmol siRNA 及 10 μ 1 的 LipofectamindOOO进行转染。④48 h用RLB裂解液裂解细胞。⑤BCA测蛋白浓度，蛋白样品分两部分，一部分用做荧光素酶活性检测，一部分用做westernblot实验。结果见图4， SKP2通过⑶Hl介导的泛素化降解，RNA干扰cdhl后，SKP2和SKP2-LUC2的表达均升高。Scramble siRNA:
Sense5' -UUCUCCGAAC⑶⑶CAC⑶TT-3‘
Anti-Sense 5' -AC⑶GACACGUUCGGAGAATT-3‘ CDHl siRNA:
Sense5' -UGAGAA⑶CUCCCA⑶CAGTT-3‘
Anti-Sense 5' -CUGACUGGGAGACUUCUCATT-3‘ 4.3 蛋白酶体抵制实验
材料MG132 (碧云天公司)，ALLN (sigma 公司)，HeLa pCDNA3. 1 ( + ) SKP2_luc2 细胞和 HeLa pCDNA3. 1 ( + ) luc2 细胞。步骤①取60 mm培养皿六个，第个分别加适量的HeLa pCDNA3. 1 ( + ) SKP2_luc2 细胞及HeLa pCDNA3. 1 ( + )luc2。②等细胞大约80%汇合时分别等体积的DMS0、MG132 (25 ymol/L),ALLN (50 μ mol/L)。③5 h后用RLB裂解液提取蛋白，检测蛋白浓度，蛋白样品一分为二一份用于荧光素酶活性的检测，一份用于westernblot分析。结果见图5，SKP2经蛋白酶体途径降解，抑制蛋白酶体活性后，SKP2和SKP2-LUC2的表达均升高。
权利要求
1.一种细胞周期S期报告基因，其核苷酸序列如SEQ NO. 1所示。
2.含有权利要求1所述核苷酸序列的重组质粒。
3.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于所述重组质粒为 pCDNA3. l(+)-skp2-luc2。
4.权利要求1所述报告基因在制备用于观察细胞周期变化药物或制备抗肿瘤诊断药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了细胞周期S期报告基因及其应用。本发明提供了采用报告基因来检测细胞周期变化的方法。用pCDNA3.1(+)-luc2的质粒和S期激酶相关蛋白2(skp2)的cDNA构建新的质粒，将构建的新质粒用来转染细胞，对所获得的稳定转染的细胞进行检测，结果显示skp2-luc2报告基因在S期特异性的高表达。本发明可用于体内监测细胞周期的变化，克服了流式等技术只能在细胞水平观察细胞周期的缺点，为动物实验提供了一个强有力的工具。并且，利用本发明可对药物疗效进行早期评价，缩减药物的研发时间和减少研发费用，克服了传统影像学只能从解剖水平对疾病描述的局限，及核素标记存在的细胞毒性的局限。
文档编号C12N15/63GK102181439SQ201110075260
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者张国君, 赵瑞君, 陈志鸿 申请人:汕头大学医学院