专利名称：人成视网膜细胞瘤基因产物磷酸化的细胞周期依赖性调节的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制细胞增殖方面，此外，本发明还涉及癌症和增殖细胞疾病的预防和治疗。
增殖活跃的细胞失去生长因子就停滞在细胞周期的Go期。相反，当供给合适的生长因子时，静止细胞被诱导增殖。静止细胞暴露于生长刺激物中，引起很多特异基团的表达及其产物的量和质上的变化。例如，将静止细胞暴露于血小板诱导生长因子(PDGF)(Wahl，et.al.，Mol.Cell.Biol.92934(1989);Meisenhelder，et.al.，Cell，571109(1989))或表皮生长因子(Wahl et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861568(1989);Margolis，et.al.，Cell 571101(1989))，引起它们的受体酪氨酸激酶活性的激活，然后可直接使磷脂酶磷酸化，这又可依次引起其他生化反应，如细胞内钙离子的升高，磷酸肌醇的水解，蛋白磷酸化的减缓，以及新mRNA合成的诱导[见Deuel，Annu，Rev.Cell Biol.3443(1989)]。因为这些在转录上被激活的基因中有些是原始致癌基因，所以控制细胞增殖的研究主要着重于在增殖反应早期其表达被激活的相似基因的分离和赋予特征(Cochran，et，al.，Science 2261080(1984);Thompson，et，al.，Nature 319374(1986);Lau & Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)841182(1987);Ryter，Proc.Natl，Acad.Sci(U.S.A.)851487(1988))。一些特别在静止期表达的基因也被分离了出来(Schneider，et，al.，Cell 14787(1988);Bedard，et.al.，Simmons & Erikson，Mol.Cell.Biol.91371(1989))。当细胞暴露于生长刺激物中时，这些基因的表达受到抑制。因此，特异基因的向下调节通过去除细胞增殖的障碍物，对于促有丝分裂反应也可能是重要的。
人成视网膜细胞瘤基因(RB1)是一类基因的原型，其等位基因的同时失活被认为是新生物生长所必需的。RB1的分离在分子水平上证实了成视网膜细胞瘤和临床有关的肿瘤如骨肉瘤有基因缺失(Friend et.al.，Nature 323643(1986);Fung et.al.，Science 2361657(1987);Lee et.al.，Science 2351394(1987))。此外，用RB1 cDNA探针和抗其基因产物(Rb)的抗体进行的分折也揭示了很多成人肿瘤如小细胞肺癌(Harbour et.al.，Science 241353(1988);Yokota et.al.，Oncogene 3471(1988))和乳房肿瘤(T'Ang，et.al.，Science 242263(1988)有RB1的缺失。RB1在控制新生物生长上的重要功能受这样的事实支持，即Rb与腺病毒EIA(Whyte et.al.，Nature 334124(1988))、猿猴病毒40(SV40)大T抗原(Decaprio et.al.，Cell 54275(1988)的变异蛋白和人乳头状瘤病毒的E7蛋白(Dyson，et.al.，Science 243934(1989)形成物理性缔合。
图1A表示RB和RB1-AB20的免疫沉淀反应，用SDS-PAGE法。
图1B表示用流动细胞计数法分析RB的稳定状态。
图1C表示在脉冲追踪实验中Rb降解的SDS-PAGE分析。
图2表示在不同生长条件下细胞中Rb的磷酸化作用。
图3表示被各种化学制剂诱导分化的HL-60A细胞的Rb磷酸化作用。
RB1的失活伴随着肿瘤发生。本发明的一个目的在于利用Rb的功能限制细胞增殖。
本发明的另一个目的是提供在含Rb蛋白的细胞上抑制细胞增殖的一种方法，包括对增殖细胞给予一种能抑制所述Rb磷酸化作用的化合物。
本发明的另一个目的是提供一种在含Rb蛋白的细胞上抑制细胞增殖的方法，其中所述化合物选自包含视黄酸、二甲基亚砜、丁酸和TGF-B的一组化合物。
本发明的另一个目的是提供一种在含Rb蛋白的细胞上阻止细胞增殖的方法，包括对增殖细胞给予一种能抑制所述Rb磷酸化的化合物。
本发明的进一步目的是提供一种阻止细胞增殖的方法，包括对含有Rb蛋白的细胞给予选自视黄酸、二甲基亚砜、丁酸和TGF-B的一种化合物。
生长因子引起的对细胞生长有积极效应的基因表达的激活，在控制细胞增殖上看来是重要的，而对细胞生长有抑制的基因表达的向下调节在生长调节上也可能是重要的。RB1失活与肿瘤生长有关这一事实提示该基因参予细胞增殖的控制。我们证实Go和G1期细胞内新合成的Rb磷酸化不足，只有在G1/S交界和S期细胞内新合成的Rb才在多部位发生磷酸化。我们的观察和如下阐述相一致Rb的低磷酸化型是活性型，在开始合成DNA前，一个或一个以上关键性部位的磷酸化使Rb的这种低磷酸化型失活。SV40大T抗原可只结合于Rb的低磷酸化型，并可能使其失活(Ludlow et.al.，Cell 5657(1989))。故而，Rb磷酸化失活可能是细胞越过G1/S交界的必需过程。因此可在Rb失活的水平上实行对细胞增殖的控制。在磷酸化的Rb种类的盈余上观察到的变化是否由于激酶活性、磷酸酶活性或二者活性的变化所致，尚不清楚。
实施例1对各种条件下细胞内Rb表达的调节进行了考察。
合成了代表Rb最亲水的区域的肽类，并用来免疫家兔和Balb/c小鼠，产生多克隆和单克隆抗体。为制备抗Rb抗体，根据从RB1 cDNA序列推断的蛋白质序列合成的肽类被用来免疫年轻的新西兰家兔。对于Rb-1-AB16，所用的肽(P4)是CEEIYLKNKDL-DARLFLDHDK(322-341氨基酸)。对于Rb-1-AB20，所用的肽(P5)是CEGSNPPKPLKKLRFDIEGSDEAD(864-886氨基酸)。对于RB-1-AB Al，所用的肽(P2)是CRMQKQKMNDSMDTSNKEEK(910-928氨基酸)。图1(A)表示用Rb1-AB20免疫沉淀Rb。一个增殖活跃的VM-CUB-3随机群体(4×106个细胞)，在Dulbecco改良的Eagles培养基(DMEM，含5%经透析的胚胎小牛血清(FCS)，不含甲硫氨酸(栏1和2)或磷酸盐(栏3)中培养1小时，然后用含300μCi的[35S]-甲硫氨酸(1000Ci/mmol)(栏1和2)或300μCi[32P]-正磷酸盐(285Ci/mg)(栏3)的1ml DMEM+5%经透析的胚胎小牛血清(FCS)于37℃标记2小时。然后用经磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗细胞两次，用0.5ml EBC(40mM tris-HCl(pH8.0))，120m M Nacl，0.5%NP-40，抑肽酶、pepstatin和leupeptin各2μg/ml，苯甲磺酰氟100μg/ml，于0℃提取蛋白质1小时。细胞溶解物于4℃，15，000rpm离心10分钟而变澄清。上清液用5-10μl Rb1-AB20抗血清(栏1和3)或用100μg肽P5预培养的Rb1-AB20于4℃培养2小时。免疫复合物收集在A蛋白-琼脂糖(Calbiochem)上，用EBC洗五次。在样品缓冲液(62.5mM tris-HCl(pH6.8)，5%B-巯基乙醇，2.3%SDS，10%甘油，和0.001%溴酚兰)中，于90℃加热1分钟，将免疫沉淀的蛋白质洗提出来，并用SDS-PAGE进行分离。将凝胶固定，使X-光片曝光。
图1B表示用流动细胞计数法分析Rb的稳态水平。指数增长的HL-60细胞(2×106)于4℃悬浮于0.1ml PBS，加入0.9ml冷至-80℃的甲醇使其固定。固定的细胞再悬浮于4℃，120μl PBS-EGS(50%PBS，50%正常的山羊血清，0.002%Triton X-100和10μl Rb 1-AB20)。悬浮液在定期混匀下于37℃培养1.5小时。悬浮液在冰上冷却2分钟。然后加入150μl PBS。在定期混匀下将细胞于4℃培养30分钟，再悬浮于195μl PBS-NGS和5μl FITC-GAR(荧光素异硫氰酸盐结合的山羊抗兔Ig G抗体)。悬浮液于37℃培养1小时，在冰上冷却2分钟，然后加150μl PBS-NGS。这一洗涤步骤再重复一次，然后用RNA酶A(5μg/ml)于37℃处理30分钟。细胞最后用propidium碘化物(5μg/μl)染色，用流动细胞计数分析。流动细胞计数是用一种氩离子激光流动细胞计数器(Profile Model，Coulter Eletronics)进行计数的。在488nm处激发。绿色的发射光用遮着525nm波段滤光片的光电倍增管收集，红色的荧光用遮着610nm长滤光片的光电倍增管收集。结果产物(2×104)在样品流速为10μl/分钟时收集。单变量直方图表示作为细胞的Rb或DNA含量(横坐标)的函数的相应细胞数(纵坐标)的分布。Rb含量与DNA含量表示为点密度图。细胞周期的时相在图中也表示出来。图1C表示用脉冲追踪试验测定Rb的降解。如上所述，用300μCi[35S]-甲硫氨酸(1000ci/m mol)脉冲标记SW613 90分钟，在PRMI1640和10%FCS追踪22小时。在追踪中每隔2小时，将Rb蛋白同样的样品用上述SDS-PAGE法进行提取、免疫沉淀和分离。
实施例2在不同生长条件下细胞中Rb磷酸化的调节用图2表示。一个生长活跃的VM-CUB-3随机群体在无血请存在时在PRMI 1640培养基中培养4天。在这4天中，用300μci[35S]-甲硫氨酸(1000ci/mmol)标记细胞，在0小时(图2A，栏1)、24小时(图2A，栏2)、48(图2A，栏3)、72(图2A，栏4)和96小时(图2A，栏7)后提取Rb蛋白，进行免疫沉淀反应，并如上所述分析样品。
实施例3禁血清2天变得静止的SW613细胞，经再注入含10%胚胎小牛血清的培养基后又被刺激生长。在细胞中加入血清后间隔一定的时间，用Macher et.al.，Exp.Cell Res.11795(1978)所述的[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷摄取法测定DNA合成。将每一时间点上的双份细胞培养物如实施例1A所述用[35S]-甲硫氨酸进行标记。为了更精确地分析多重磷酸化开始的时限，将被血清饥饿法同步化的细胞用aphidicolin(5ng/ml)处理24小时使其静止在G1/S交界处(图2c，栏13)。处理24小时后，在存在aphidicolin的情况下，如实施例1A所述，用300μci[35S]-甲硫氨酸(1000ci/mmol)对这些细胞标记2小时并进行分析。结果见于图2c(栏1，Go期;栏2，同栏1，只是抗血清Rb1-AB20在4℃用100μg肽P5预培养2小时;栏3和4，G早期;栏5，晚G1早S期;栏6-10，S期，栏11和12，G2+M期;栏13，G1/S交界;栏14，同栏13，只是Rb1-AB-20在4℃用100μg肽P预培养2小时)。
实施例4图3表示用各种化学物诱导末端分化的HL-60A细胞上的Rb磷酸化。(A)在RPMI1640，10%FCS中指数增殖的HL-60A细胞的一个随机群体，用5×10RA-6(o)或1.25%DMSO(Yen et.al.，Exp.Cell Res.168，247(1987))处理不同长度的时间。在0小时和间隔24小时计算细胞数。结果见于图3A。未处理的对照样品用X表示，RA处理的样品用o表示，DSMO样品用+表示。
实施例5从实施例3得到的HL-60A细胞的双份培养物，如实施例1A所述，用300μci[35S]-甲硫氨酸(1000ci/mmol进行标记和分析。细胞用5×10-6M RA(栏1-6)，1.25%DMSO(栏7-9)或4×10-3M BA(栏10)处理。细胞的代谢标记在0时(栏1)、12小时(栏2)、24小时(栏3)、48小时(栏4)、72小时(栏5)、96小时(栏6)、12小时(栏7)、24小时(栏8)、96小时(栏9)和96小时(栏10)箭头指向约98KD的Rb的一个种，在用上述化学物处理96小时的细胞上可重复再现。
(C)从增殖活跃的细胞中用离心淘洗法分离得到Go和Gl期HL-60细胞。离心淘洗在装有含40ml离心室的转子的Beckman J21-c离心机中进行。108个细胞装入离心室。转子速度保持在2000rpm，流速以12个增量从初速度11.5ml/分钟增加到终速度29ml/分钟。在14.3ml/分钟时收集Go和G1细胞，在显微镜下监测细胞的大小。在有(×)或没有(o)5×10-6M PA时，将收集到的样品的双份培养物在RPMI 1640+10%FCS中培养48小时。用Lud-low et.al.，Cell 5657(1989)所述[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷摄取法测定DNA的合成。
实施例6在实施例5的每个时间点上取出一份小样品，用Collins et.al.，Int.J.Cancer 25213(1980)所述NBT摄取法分析细胞的分化。结果见于图3D。NBT阳性细胞表示为所计算的细胞总数的百分比，(x)为RA处理细胞;(o)为对照细胞。上述实验所得G0和G1HL-60A细胞中取双份样品用于分析Rb表达。获得的细胞在0时间用RA处理，在大约0、4、8和18小时时进行Rb分析。结果见于图3E。细胞在收集后2 1/2小时(栏1)，6 1/2小时(栏2)、10 1/2小时(栏3)和20 1/2小时(栏4)获得。因为不可能分离早期和晚期G1细胞，所以在标记阶段一些细胞越过了G1/s交界点。
从[35S]甲硫氨酸标记的人膀胱瘤细胞VM-CUB-3系中用免疫沉淀反应检出了表观分子量为105-115KD的多种Rb，接着进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)(图1A，栏1)。当抗体被相应的Rb肽类预吸收时，没有这样的蛋白质可被沉淀(图1A，栏2)。用[32P]-正磷酸作代谢标记，证明具有较高表观分子量的Rb多肽类被高度磷酸化(图1A，栏3)。在免疫沉淀反应前用马铃薯酸磷酸酶处理磷蛋白，导致这些Rb种类消失。用这些抗体对细胞作免疫组织化学染色，揭示了Rb的核定位，如文献所描述的(Lee，et.al.，Nature 329，642(1987);Varley et.al.，Oncogene 4，721(1989))，以及从在SV40大T抗原上发现的使人联想起核移位信号的氨基酸系列VRSPKKK(氨基酸残基609-615)的存在上所推断的那样。
(氨基酸残基的缩写是A，Ala，丙氨酸;C，Cys，半胱氨酸;D，Asp，天冬氨酸;E，Glu，谷氨酸;F，Phe，苯丙氨酸;G，Gly，甘氨酸;H，His，组氨酸;I，Ile，异亮氨酸;K，Lys，赖氨酸;L，Leu，亮氨酸;M，Met，甲硫氨酸;N，Asn，天冬酰胺;P，Pro，脯氨酸;Q，Gln，谷氨酰胺;R，Arg，精氨酸;S，Ser，丝氨酸;T，Thr，苏氨酸;V，Val，缬氨酸;W，Trp，色氨酸;Y，Tyr，酪氨酸)。
实施例7Rb的合成和降解是以细胞周期依赖性的方式受到调节的。对作为细胞周期函数的稳态Rb量进行了测定。由于家兔多克隆抗体Rb 1-AB20，Rb 1-AB16和Rb 1-AB-A1可检出Rb的各种磷酸化型，因而可测出细胞内Rb的总量。将指数增殖的原始型HL-60细胞固定，并用Rb 1-AB20和连接荧光素的家兔抗免疫球蛋白G(IgG)的第二抗体进行染色。然后用核糖核酸酶A(RNAase A)处理细胞，并用propidium碘化物染色来定量DNA。当细胞在488nm处受照射时，荧光素发射光是缘色的，propidium碘化物发射光是红色的，因此可同时测量发射光的强度，从而用流动细胞计数法测定Rb和DNA含量(图1B)。当细胞通过细胞周期G1、S和G2+M期逐渐成熟时，每个细胞Rb的含量增加。G2+M期的细胞比进入G1期的细胞含有大约多两倍的Rb。因此，增殖细胞的Rb含量总是保持在G0和G1期的阈值水平或阈值水平之上。如果Rb的合成速率超过其降解速率，这是可以预料到的。当用Rb1-AB A1进行实验时也重复了这些结果。
为了弄清Rb周转动力学，用免疫沉淀反应研究了Rb的合成和降解。人乳瘤细胞SW613用[35S]-甲硫氨酸脉冲标记90分钟，检测标记的Rb的降解速率(图1C)。各种形式Rb强度的光密度扫描显示Rb的半衰期至少是10小时。一个相似的Rb半衰期分布图也被其他人观察到了(Whyte，et.al.，Nature 334，124(1988);Xu，et.al.，Oncogene 4，807(1989)。
在SW613和VM-CUB-3上作为细胞周期函数的Rb的合成用图2表示。在撤去血清后2-3天，指数生长的细胞停止增殖，在后5天内细胞数目保持不变，也无DNA合成。加入血清，或用EGF十胰岛素和仅加铁传递蛋白，使这些细胞被释放进入增殖期时，它们同步地穿越细胞周期。间隔一定的时间用[35S]-甲硫氨酸对这些细胞进行脉冲标记并免疫沉淀Rb用于分析。在这些条件下，发现在静止状态(图2A，栏1-5，图2B，栏1)和在增殖期(图2B，栏3-13)都有Rb合成。Rb是稳定的并持续合成的这一事实，和当细胞体积增大时观察到的蛋白质的稳态积累相一致。
细胞不能向下调节它的Rb含量，提示它必定有调节这一蛋白活性的其它途径。在静止状态，细胞只有一种表观分子量为105KD的低磷酸化Rb(图2A，栏3-5，图2B，栏1)。在重新加入血清时，穿越细胞周期的同步化的细胞在G1早期仍然显示只有这一种低磷酸化的Rb(图2B，栏3和4)。而在G1/S交界和S期的细胞(图2B栏5-10)获得了产生多重磷酸化的新合成Rb的能力。用aphidicolin使细胞静止在G1/S交界处长达24小时，这样的细胞完全有能力产生新合成的Rb并使其维持在多重磷酸化状态(图2B，栏13)。在G2+M期，Rb的低磷酸化型又变得更占优势(图2B，栏11和12)。用3-(1-苯胺亚乙基)-5-苯基吡咯烷-2，4-二酮(WAKOChemicals U.S.A.inc.)使细胞静止在M期，这些细胞仍显示不止一种形式的Rb。恰好在DNA合成开始之前，Rb变得被高度磷酸化，这一事实提示，在Rb磷酸化状态和细胞增殖的控制之间可能有关联作用。
将血清饥饿强制引起的异常生长状况对Rb磷酸化情况的影响和被诱导经历末端分化的细胞中的磷酸化情况进行比较。HL-60细胞经各种化学物处理，可沿着几种不同的谱系被诱导发生末端分化。用视黄酸(RA)或二甲基亚砜(DMSO)处理引起髓细胞分化，而1，25-二羟基维生素D3和12-邻-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)引起单核细胞分化。诱导过程特征性地出现在相当于两个细胞周斯的一段时间中(Yen，et.al.，Leukemia Res.10，619(1986))。在第一个细胞周期，暴露于诱导剂的细胞显现出一种定型前(precommitment)状态，这个时期的细胞是生长停止还是分化尚未定型，它们可继续无限地增殖。
我们分离出一个变异的HL-60细胞株(HL-60A)，它显现出这种定型前状态。HL-60A暴露在诱导剂中一个细胞周期就足以触发细胞生长停止或分化开始。用RA处理增殖活跃的HL-60A细胞的一个随机群体，确定了细胞增殖的控制和Rb磷酸化状态之间的关系。用RA处理的最初24小时中细胞数加倍(图3A)。以后出现了增殖的抑制，因为未观察到细胞数的进一步增加。早在处理后12小时时，就观察到Rb磷酸化的向下调节(图3B，栏2和7)。用RA或DMSO处理24小时后，事实上全部新合成的Rb是低磷酸化的(栏3和8)。
但是，仅仅这些资料并不容易区分Rb磷酸化情况的变化是生长停滞的原因还是结果。可能是RA处理能直接向下调节所有细胞上Rb磷酸化的程度，从而导致生长停止。或者是，Rb磷酸化的向下调节可能只发生在细胞周期的限定点上，例如发生在G0和G1期。在后一种情况下，Rb磷酸化的向下调节因而可反映细胞生长停止在G0和G1期的事实，在RA处理后观察到的低磷酸化Rb的积聚可能表示细胞逐渐到达限定点。为了论述这个问题，我们进行了以下实验。我们首先用离心淘洗法分离到HL-60A细胞的一个同步化G0/G1群体。分离后，将细胞分成两部分，其中一部分用RA处理。间隔一定的时间，取出细胞样品，用免疫沉淀反应分析Rb磷酸化情况，用[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷摄取法作增殖的测定。同步的HL-60A细胞能在RA存在下，在生长停滞开始前生长，进行一次细胞分裂(图3C)。在这个周期，当细胞进入S期时，新合成的Rb以一种不同于未处理细胞所有的方式进行磷酸化(图3E，栏1-4)。在处理后30分钟时，RA处理的细胞变得生长停滞，并失去产生多磷酸化Rb的能力(图3E，栏5)。用氮蓝四唑(NBT)染色法测得相当比例的细胞发生分化(图3D)。我们推断，RA处理直接调节蛋白质磷酸化，更确切地说，新合成的Rb磷酸化作用的向下调节与RA引起的生长停滞有关。这些观察结果也见于用诸如TPA、DMSO或丁酸钠(BA)等化合物处理HL-60A细胞;它们全部导致相似时程的Rb磷酸化作用的向下调节(图3B，栏7-10)，尽管这些化合物各自影响不同的细胞靶。不论用RA，还是BA或DMSO处理96小时后，细胞显示出一种98KD的低磷酸化Rb蛋白。由于Northern斑点分析法揭示了一种标准大小的mRNA，因此这一截短的Rb的起源可归因于在固有的ATG上翻译的起始。因为这种Rb是在用各种化学诱导剂处理的细胞上观察到的，它的出现可能与生长停滞状态有关，而不是和细胞分化有关。
成视网膜细胞瘤蛋白的磷酸化对控制它的活性是极为重要的。能使成视网膜细胞瘤(Rb)蛋白磷酸化的Rb激酶的部分纯化制剂包含复合cyclinB的CDC2激酶。CDC2/cyclinB复合物在体外使Rb蛋白磷酸化。能被此酶在体外利用的大多数磷酸化位点在体内也可被利用。
含主型S/TPXY(其中Y可以是K，R或H)的Rb蛋白中的磷酸化位点由CDC2激酶识别。在Rb蛋白中有11个这样的潜在磷酸化位点(图4，划线部分)。它们中的部分对调控活性一定是重要的，即如果这些重要位点被磷酸化，那么Rb蛋白将变得没活性。
至少有两种方法来区别Rb蛋白的磷酸化型(失活型)和低磷酸化(underphosphorylated)型(活性型)。一种方法是用免疫沉淀，组织培养中的细胞用35S-甲硫氨酸或32P标记。然后通过与抗Rb蛋白的抗体孵育而萃取和沉淀Rb蛋白。比高度磷酸化型具较低分子量(大约105KD)的低磷酸化型Rb蛋白可以通过胶电泳来区别。另一种能识别低磷酸化型Rb蛋白的方法是对组织切片或培养细胞进行免疫组织化学染色。抗含磷酸化位点的未磷酸化肽的抗体可能只识别含未磷酸化位点的Rb蛋白。这样的一种抗体OS3对肽GSPRT-PRRGQNRSAR是专一性的，该肽是Rb肽中含CDC2激酶潜在磷酸化位点的区域，从氨基酸248到262(图4)。抗此肽的抗体只检出Rb蛋白的低磷酸化型，如图5栏1所示，这儿与OS3免疫沉淀的Rb蛋白的分子量约为105KD。相反，针对Rb蛋白另一不含磷酸化位点部分的抗体OS1既能检测Rb蛋白的低磷酸化型，又能检测它的高度磷酸化型，如图5栏1所示。一些磷酸化位点，例如我们刚才引用的，不是随机磷酸化的，这意味着这个位点没有被磷酸化总是与Rb蛋白的低磷酸化型(Rb蛋白的活性型)相关。通过免疫沉淀或者对未培养组织切片的免疫组织化学染色，抗这个和/或其它相似位点的抗体可区别Rb蛋白的磷酸化型和低磷酸化型，产生的抗这些磷酸化位点或其邻近区域的抗体对这些研究，尤其是免疫组织化学染色是有用的。这些位点在图4中被划出。含这些位点的15个氨基酸残基或更多的寡肽被用来产生位点特异性抗体。
许多用于生长停滞和分化的治疗剂，例如干扰素(α、β、γ)，肿瘤坏死因子和肿瘤生长因子δ能诱导许多不同细胞型的分化和生长停滞，如白血病细胞和实体瘤。这些药物的一个共同作用是向下调节Rb蛋白的磷酸化作用。
当Rb基因被引入不同类型肿瘤细胞后，细胞的生长在一或几个细胞周期内常在单细胞水平被抑制。这一资料表明抗增殖效应是Rb蛋白的内在作用。转染一般导致过量Rb蛋白活性型的产生，它不能被细胞去磷酸化，这种活性蛋白的存在将足以阻止细胞生长。许多治疗药物导致Rb蛋白磷酸化作用的向下调节，并由此激活Rb蛋白。
给定药物治疗制度的有效性可以通过监测Rb蛋白的磷酸化状况来评估。在提供快速方法测定特定药物在含Rb基因的细胞中是否有效抑制异常细胞的增殖上，这个评估尤为重要。在药物处理中和处理后取出肿瘤细胞样品，并测定Rb蛋白的磷酸化作用程度。可用许多方法检测某特定药物单独给药或和其它药物合并给药时是否抑制Rb蛋白磷酸化作用。活组织检查或从病人中取出肿瘤细胞，并在体外接受给定药或几种药物组合物的处理。在处理后不同时间通过免疫沉淀和/或免疫组织化学染色测量Rb蛋白的磷酸化作用，以评估Rb磷酸化作用是否已被抑制。如果在体外未能抑制磷酸化作用，治疗则不大可能导致细胞生长停滞。另一方面，如果药物在体外有效地抑制Rb蛋白的磷酸化，那么此治疗有很大的可能性在病人身上成功。
或者，在病人治疗过程中，可以活组织检查肿瘤样品，并在不培养的情况下对它们进行免疫组织化学染色，用抗特异性磷酸化位点的抗体，以评估药物治疗的有效性，及是否已诱导Rb蛋白磷酸化作用的向下调节。
任何药物治疗有效性的测试的最终目的是检测受试药物抑制Rb蛋白在重要位点的磷酸化作用的能力。
权利要求
1.在含Rb的细胞上一种抑制细胞增殖的方法，其特征为给予增殖细胞一种能抑制所述Rb磷酸化的化合物。
2.如权利要求1的方法，其特征在于所述化合物选自由视黄酸、二甲基亚砜、丁酸和TGF-B构成的一个组。
3.在含有Rb蛋白的细胞上阻止细胞增殖的一种方法，其特征在于给予增殖细胞一种能抑制所述Rb磷酸化的化合物。
4.如权利要求3的方法，其特征在于所述化合物选自由视黄酸、二甲基亚砜、丁酸和TGF-B构成的一个组。
5.鉴别抑制细胞增殖的药物的一种方法，其特征在于将所述药物和含Rb蛋白的增殖细胞一起培养一段时间，使所述Rb蛋白磷酸化，并测量所述Rb蛋白磷酸化不足的程度。
6.如权利要求5的方法，其特征在于这段时间为大约12小时。
7.测定增殖细胞是否应药物而生长受抑的一种方法，其特征在于将所述药物和含Rb蛋白的增殖细胞一起培养一段时间，使所述Rb蛋白磷酸化，并测量所述Rb蛋白磷酸化不足的程度。
8.测定细胞增殖性疾病治疗有效性的一种方法，其特征在于从一个个体取出含Rb蛋白的细胞样品，将所述细胞培养一段时间使所述Rb蛋白磷酸化，测定所述Rb蛋白磷酸化不足的程度，并评定细胞增殖性疾病治疗的有效性。
9.权利要求8的方法，另外还包括比较治疗前取出的细胞样品中Rb蛋白磷酸化水平和治疗后取出的细胞样品中Rb蛋白磷酸化水平的步骤。
10.权利要求8的方法，其中包括用对所述Rb蛋白磷酸化部位特异的抗体沉淀Rb蛋白来测定所述Rb蛋白的所谓磷酸化不足。
全文摘要
人成视网膜细胞瘤基因(RB1)编译成105千道尔顿的蛋白质(Rb)，后者可被磷酸化。Rb代谢的分析表明，该蛋白质是稳定的，并且在细胞周期的各期均有合成。在G
文档编号A61K31/20GK1052607SQ90109950
公开日1991年7月3日 申请日期1990年12月7日 优先权日1989年12月7日
发明者恽凯峰 申请人:研究发展基金会