专利名称：抑制细胞周期进程的化合物在制备抑制或去除肿瘤细胞中双微体药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类抑制细胞周期进程的化合物在制备抑制或去除肿瘤细胞中双微体药物中的应用。通过去除肿瘤细胞中双微体数目、减少双微体携带癌基因扩增而有效降低含有双微体的恶性肿瘤细胞的恶性程度。本发明属于肿瘤生物治疗技术领域。
背景技术：
双微体(doubleminutes 或 double minute chromosomes, DMs)是只存在于肿瘤细胞和耐药细胞中的基因扩增的主要细胞遗传学标志，为细胞中位于染色体外、小的、成对存在的无中心粒的染色质小体，是染色体外遗传单位的一种主要存在形式。1962年首次在一些恶性肿瘤细胞和渗出液及肺癌胸水的转移细胞中发现这种染 色体外的微体。目前已在白血病、恶性淋巴瘤等多种血液系统肿瘤，和肺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌及儿童神经母细胞瘤等实体性肿瘤中都可检测到双微体，双微体是恶性肿瘤基因扩增的主要的细胞遗传学标记。不同类型的肿瘤细胞中双微体具有较高的异质性，携带癌基因和多药耐药性基因扩增使细胞具有选择优势，这些基因的扩增是导致癌症发生，发展，及癌细胞产生耐药的重要元素。减少或去除细胞内的双微体，从而减少癌基因和耐药基因的扩增及其蛋白的功能，是一种有效的减少癌细胞恶性的方法。从肿瘤细胞中消除双微体上扩增的癌基因和耐药基因，能够降低其致癌性或恢复细胞对药物的敏感性，因此，去除双微体是治疗以基因扩增为标志的疾病的可行途径。目前羟基脲应用于肿瘤治疗，但对肿瘤并没有较强的特异性，羟基脲半衰期短，高剂量，易产生快速耐受性。针对肿瘤的特点进行特异性治疗可以提高肿瘤治疗的敏感性和特异性，有的放矢，我们针对肿瘤细胞最基本特征，即增殖能力强这一特点对肿瘤细胞的细胞周期进行干预，预通过减少肿瘤细胞中双微体数目和携带癌基因和耐药基因扩增，从而控制肿瘤细胞的恶性程度，针对肿瘤细胞中双微体的靶向性治疗将会成为一种新的肿瘤治疗策略。
发明内容
本发明的目的在于，针对目前肿瘤治疗的效果欠佳，从而提供一种针对含有双微体的肿瘤的靶向生物治疗策略，通过选择抑制细胞周期进程的化合物去除细胞中双微体数目和携带基因扩增而降低含有双微体的肿瘤细胞的恶性程度。本发明针对含有双微体的肿瘤细胞，选择抑制细胞周期进程的化合物吉西他滨、喜树碱、苦参碱和紫杉醇低浓度作用，其剂量低于对照组羟基脲上千倍，发现吉西他滨、喜树碱、苦参碱和紫杉醇可通过去除细胞中的双微体数目和减少携带癌基因扩增，而有效降低含有双微体的肿瘤细胞的恶性程度。因此，本发明提出了抑制细胞周期进程的化合物在制备抑制或去除肿瘤细胞中双微体药物中的应用，其特征在于所述的化合物为吉西他滨、喜树碱、苦参碱或紫杉醇其中至少一种或其组合。在本发明的一个具体实施例中，所述的肿瘤细胞为卵巢癌细胞。为了达到以上目的，本发明采用的技术方案为I、检测肿瘤细胞的细胞遗传学特征选择含有双微体的人卵巢癌细胞系UACC-1598为研究对象。(I)常规细胞培养；(2)细胞中期核型标本制备以及检测细胞株含有双微体的信息。2、细胞周期进程抑制剂对细胞中双微体的影响
选用低浓度各种细胞周期进程抑制剂持续作用此种细胞，优化条件，检测细胞中双微体的变化。选用4种与细胞周期进程相关的抑制剂①吉西他滨，核糖核苷酸还原酶抑制剂，作用于细胞周期DNA合成期(购自法国礼来公司)10-羟基喜树碱，选择性抑制DNA拓扑异构酶I (Topol)(购自上海龙翔生物医药开发有限公司)；③苦参碱，阻滞细胞在G0/G1期，抑制DNA拓扑异构酶II (Τ0Ρ0 II)(购自中国芜湖甙尔塔医药科技有限公司)；④紫杉醇，微管稳定剂，抑制细胞有丝分裂，停止在细胞周期G2期和M期(购自上海龙翔生物医药开发有限公司)。以已知有作用的羟基脲(购自上海龙翔生物医药开发有限公司)作为阳性对照。(I)双微体数目检测抑制剂作用后，按照常规方法进行中期核型制备，计数50-100个核型中的双微体数目。(2)双微体携带基因扩增水平检测已知人卵巢癌细胞UACC-1598细胞中双微体上携带EIF5A2和MYCN基因扩增，通过实时定量PCR (qPCR)方法检测抑制剂作用下EIF5A2和MYCN基因的扩增水平。3、细胞周期进程抑制剂对细胞生物学行为的影响(I)绘制细胞生长曲线检测加入抑制剂作用后的细胞增殖能力变化；(2)流式细胞术检测加入抑制剂后的细胞周期变化；分别收集加入抑制剂和对照组细胞，依cycle TEST PLUS DNA试剂盒提供的操作步骤进行，行流式细胞术检测细胞周期的改变。(3)平板克隆形成实验检测抑制剂作用后的细胞克隆形成能力；(4)侵袭小室实验检测细胞侵袭能力。应用BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber对抑制剂和对照组细胞进行重
组基底膜侵袭实验。由此方案可特异性地选择细胞周期进程抑制剂作用含有双微体的肿瘤细胞，细胞周期进程抑制剂通过减少细胞中双微体的数目而有效降低肿瘤细胞的恶性程度。本发明的方法的有益效果是对于双微体阳性的肿瘤细胞的生物治疗提供新的靶向性治疗方案，提高治疗的特异性。针对含有双微体的肿瘤细胞，通过用细胞周期进程抑制剂作用可以减少肿瘤细胞中的双微体数目及携带癌基因的扩增，从而有效降低肿瘤细胞的恶性程度。
图I是人卵巢癌UACC-1598及4号单克隆细胞中期染色体核型分析图；图2是人卵巢癌UACC-1598及4号单克隆细胞双微体数目统计散点图；图3是羟基脲(HU)和吉西他滨(GEM)作用后卵巢癌细胞中双微体数目统计散点图；图4是喜树碱、苦参碱和紫杉醇作用后的卵巢癌细胞中双微体数目统计散点图；图5是羟基脲(HU)和吉西他滨(GEM)作用后卵巢癌细胞双微体携带基因扩增实时定量PCR柱状图；图6是喜树碱、苦参碱和紫杉醇作用后的卵巢癌细胞双微体携带基因扩增实时定量PCR柱状图； 图7是羟基脲(HU)和吉西他滨(GEM)作用后卵巢癌细胞生长曲线图；图8是喜树碱、苦参碱和紫杉醇作用后卵巢癌细胞生长曲线图；图9是羟基脲(HU)和吉西他滨(GEM)作用后卵巢癌细胞克隆形成能力统计图；图10是喜树碱、苦参碱和紫杉醇作用后卵巢癌细胞克隆形成能力统计图；图11是羟基脲(HU)和吉西他滨(GEM)作用后卵巢癌细胞的重组基底膜图。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例I、检测卵巢癌细胞的细胞遗传学特征选择含有双微体的人卵巢癌细胞系UACC-1598为研究对象。为了解人卵巢癌细胞系UACC-1598含有双微体的情况，首先制备中期染色体标本。将处于对数生长期的UACC-1598细胞加入终浓度为O. 01 μ g/mL的秋水仙素，37°C继续培养l_2h，将细胞用吸管吹打下来，将细胞悬液转入离心管中1000r/min离心8min,PBS冲洗两次,加入37°C预热的O. 075mol/L的KCL，在37°C水浴中低渗作用ll_15min，逐滴加入ImL新鲜固定液(甲醇冰醋酸=3:1)进行预固定，1500r/min离心5min,弃上清加入IOmL固定液,轻轻混勻，室温固定30min, 1500r/min离心5min,重复一次,弃上清，加入适当固定液混勻，将细胞悬液以一定高度滴于预冷的载玻片上，室温晾干。Giemsa染液染色5min,流水冲洗,晾干。置于显微镜下观察，拍照。我们从培养的UACC-1598细胞中分离含有双微体多的单克隆细胞株，UACC-1598-4，如图I所示为典型的细胞中期分裂相(箭头所示为双微体)，来说明接下来的抑制剂作用对双微体减少的影响更为显著。计数50-100个UACC-1598细胞和UACC-1598-4细胞分裂相中的双微体数目，结果如图2所示。由此，选择含有双微体的细胞株UACC-1598-4为研究对象进行研究。实施例2、细胞周期进程抑制剂对细胞中双微体的影响细胞中双微体的产生及维持存在是随细胞周期进行的一种缓慢过程和状态。优化条件后用低浓度细胞周期进程抑制剂羟基脲(HU)、吉西他滨(GEM)分别以终浓度为150 μ M和5/10/20nM持续作用卵巢癌细胞UACC-1598-42周、喜树碱以Ing/mL的终浓度作用卵巢癌细胞UACC-1598-43周、苦参碱以31. 25ng/mL的终浓度作用卵巢癌细胞UACC-1598-42周、紫杉醇以O. 05ng/mL的终浓度作用卵巢癌细胞UACC-1598-41周，细胞在37°C、5%C02条件下培养，检测对卵巢癌中双微体的影响。I、双微体数目检测按上述剂量和时间采用细胞周期进程抑制剂作用卵巢癌细胞后，检测细胞中双微体的数目情况。结果通过分别计数每组60-100例中期分裂相的双微体，我们检测到在加入羟基脲(HU)、吉西他滨(GEM)、喜树碱、苦参碱和紫杉醇持续作用卵巢癌细胞后，双微体数目明显减少，通过统计学方差分析SNK两两比较法(Student-Newman-Neuls), P〈0. 05,有统计学意义(图3和4)。通过以上实验，发现加入羟基脲(HU)、吉西他滨(GEM)、喜树碱、苦参碱和紫杉醇作用可减少肿瘤细胞中的双微体数目，说明细胞进程抑制剂可减少肿瘤细胞中的双微体数 目。2、双微体携带基因水平检测已知UACC-1598-4细胞中双微体上携带EIF5A2和MYCN基因扩增，接下来，通过实时定量PCR技术检测抑制剂作用下EIF5A2和MYCN基因的扩增水平。①实时定量PCR检测双微体携带基因扩增水平按上述剂量和时间各种抑制剂作用后，按QIAamp DNA Extract Kit说明书操作提取细胞总DNA。检测已知的UACC-1598-4细胞中双微体上携带的基因EIF5A2和MYCN的DNA扩增水平。检索NCBI Gene数据库，获得EIF5A2和MYCN基因序列，应用Primer3. O software设计并合成基因特异性引物。所用引物由Invitrogen公司合成,序列如下hMYCN-F :5’-ACCACAAGGCCCTCAGTAC-3’hMYCN-R :5，-GCAACGGCATTCTCTCAG-3’hEIF5A2-F :5’-TACTTGGCAGAGATTAAACAGG-3’hEIF5A2-R :5’-ACAAAGTATTTGCACCTTGAAG-3’hACTB-F :5，-ACCGCGAGAAGATGACCCAG-3’ hACTB-R : 5，-ACCGCGAGAAGATGACCCAG-3’将qPCR反应体系加入96孔板中，在Roche LightCycler480型荧光定量PCR仪SYBR Green I/HRM Dye (465-510)系统下运行。每一样本测量3次，按照说明书提供的最佳反应条件，94°C 4min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，共 45 个循环；EIF5A2 和 MYCN 的 DNA扩增水平以ACTB为内参进行比较，计算不同实验的数据平均值土标准差。统计方差分析SNK两两比较法(Student-Newman-Neuls)有统计学意义。结果如图5和6所示，羟基脲(HU)、吉西他滨(GEM)、喜树碱、苦参碱和紫杉醇作用后，与对照组相比，EIF5A2和MYCN的DNA扩增水平明显下降。说明抑制剂会通过减少UACC-1598-4细胞中双微体数目而减少双微体上携带EIF5A2和MYCN的基因扩增。3、细胞周期进程抑制剂对细胞生物学行为的影响(I)绘制细胞生长曲线检测抑制剂对卵巢癌细胞增殖能力的影响将加入各种抑制剂和对照组UACC-1598-4细胞分别按每孔O. 5 X IO4个接种入96孔板培养。次日开始每天取3孔计数，取平均值作为日平均细胞数，连续计数，绘制细胞生长曲线，结果如图7和8所示。与对照组细胞相比，加入羟基脲(HU)、吉西他滨(GEM)、喜树碱、苦参碱和紫杉醇后细胞生长速度明显降低，说明抑制剂可降低细胞增殖能力。(2)流式细胞术检测细胞周期用羟基脲(HU)、吉西他滨(GEM)、喜树碱、苦参碱和紫杉醇作用的卵巢癌细胞，双微体数目及携带基因扩增减少，细胞周期是否会发生变化，应用流式细胞术检测细胞周期的分布情况。分别收集抑制剂作用的卵巢癌细胞及对照组细胞，胰酶消化，全培养液终止消化，1500r/min离心5min沉淀细胞,之后用冷的PBS洗3次重悬细胞，1500r/min离心5min。之后用75%的％冷乙醇，4° C固定过夜(超过24h)，之后再用冷的PBS洗两遍。依cycleTEST PLUS DNA试剂盒提供的操作步骤进行，行流式细胞术检测细胞周期的改变，重复3次。结果如表I和表2所示，羟基脲(HU)、吉西他滨(GEM)、喜树碱、苦参碱和紫杉醇作 用后，细胞周期分布中，Gl期细胞分布减少，S+G2期细胞分布增多，卡方检验，有统计学意义，说明DNA合成减慢，细胞增殖不旺盛。表I羟基脲(HU)和吉西他滨(GEM)作用后卵巢癌细胞细胞周期分布
权利要求
1.抑制细胞周期进程的化合物在制备抑制或去除肿瘤细胞中双微体药物中的应用，其特征在于所述的化合物为吉西他滨、喜树碱、苦参碱或紫杉醇其中至少一种或其组合。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述的肿瘤细胞为卵巢癌细胞。
全文摘要
本发明提供了一种抑制细胞周期进程的化合物在制备抑制或去除肿瘤细胞中双微体药物中的应用，属于肿瘤生物治疗技术领域。本发明针对含有双微体的肿瘤细胞，选择抑制细胞周期进程的化合物吉西他滨、喜树碱、苦参碱和紫杉醇进行低浓度作用，其剂量低于对照组羟基脲上千倍，结果发现吉西他滨、喜树碱、苦参碱和紫杉醇可通过去除细胞中的双微体数目和减少携带癌基因扩增，从而有效降低含有双微体的肿瘤细胞的恶性程度。本发明的提出提高了恶性肿瘤治疗的特异性，是对现有治疗方案的改进，对于临床治疗具有指导意义。
文档编号A61K31/7068GK102755345SQ20121025749
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月24日 优先权日2012年7月24日
发明者于丹红, 于旸, 傅松滨, 孙冬琳, 孙文靖, 孟祥宁, 金焰, 陈 峰 申请人:哈尔滨医科大学