细胞周期因子y及其用途的制作方法

专利名称：细胞周期因子y及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及细胞周期因子Y及其用途。
背景技术：
PFTKl蛋白属于⑶K蛋白激酶家族成员之一，已有的研究证明，其在肝癌发生和细 胞周期调控中有重要功能作用。近年来，对PFTKl的研究表明，PFTKl是CDK家族的成员之一(Shu，F.等(2007). Functional characterization of human PFTKl as a eye1 in-dependent kinase. ProcNatl Acad Sci USA 104,9248-53)。PFTKl 可以与细胞周期因子 Cyclin D3 (CCND3) 以及蛋白抑制因子Ρ21αρ1结合形成一个三元复合物，并参与对细胞周期G1/S的调控。已 有许多证据证明，只有细胞周期受到严密而精确的调控，细胞才能维持正常运转，细胞周 期失控的超常快速运行将导致细胞癌变。由此可见调控细胞周期进展的CDK家族成员 PFTKl是肿瘤发生过程的重要因素。此外PFTKl还被证明与细胞的癌化直接相关在癌化 的肝细胞中PFTKl表达量上调；在侵入性Ifep3B细胞中抑制PFTKl的表达后导致细胞在侵 入，趋化迁移和运动方面的能力明显降低；相反的在非侵入性细胞HKCI-C3中提高PFTKl 的表达后细胞的微丝肌动蛋白聚合增强，在侵入和运动方面的能力提高(Pang，Ε. Y.等， N. (2007). Identification of PFTAIRE protein kinase 1, a novel cell division cycle-2 related gene,in the motile phenotype of hepatocellularcarcinoma cells. Hepatology 46，436_45)。说明PFTKl与细胞癌化引起的运动表型直接相关。综上，已有的研究已经证明PFTKl参与细胞周期的调控，并且参与肿瘤发生过程， 因此本领域迫切需要找到调控PFTKl或与PFTKl相互作用的蛋白，以期找到新的调控细胞 周期或肿瘤发生发展的因子。

发明内容
本发明的目的在于提供细胞周期因子Y及其用途。在本发明的第一方面，提供细胞周期因子Y或其激动剂或拮抗剂的用途，用于制 备调控细胞周期的制剂。在一个优选例中，所述的细胞周期因子Y或其激动剂用于制备促进细胞周期进程 的制剂；或所述的细胞周期因子Y的拮抗剂用于制备抑制细胞周期进程的制剂。在另一优选例中，所述的促进细胞周期进程包括促进细胞进入S期或G2/M期； 或所述的抑制周期细胞进程包括抑制细胞由G2期进入M期，或抑制细胞由Gl期进 入S期。在另一优选例中，所述的细胞周期因子Y的拮抗剂选自特异性结合细胞周期因 子Y的抗体；或特异性干扰细胞周期因子Y表达的干扰分子。
在另一优选例中，所述的特异性干扰细胞周期因子Y表达的干扰分子是如SEQ IDNO 3-7任一(较佳地为SEQ ID NO :5(507-si))所示核苷酸序列的干扰分子。在另一优选例中，所述的细胞周期因子Y通过与PFTAIRE蛋白激酶I(PFTKl)相互 作用调控细胞周期。在另一优选例中，所述的细胞周期因子Y调控肿瘤细胞的细胞周期，影响肿瘤的 发生或发展。在本发明的另一方面，提供一种筛选调控细胞周期的潜在物质的方法，所述方法 包括(a)在测试组中，向表达细胞周期因子Y的体系中添加待筛选的候选物，并检测细 胞周期因子Y的表达或活性；并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、表达细胞周期因 子Y的体系中，检测细胞周期因子Y的表达或活性；(b)将步骤(a)测试组中细胞周期因子Y的表达或活性与对照组中细胞周期因子 Y的表达或活性进行比较，如果测试组中细胞周期因子Y的表达或活性在统计学上高于(优选显著高于，较 佳的高20%或更高；更佳的高40%或更高；进一步更佳的高60%或更高)对照组，就表明 该候选物是促进细胞进入S期或G2/M期的潜在物质；若测试组中细胞周期因子Y的表达或 活性在统计学上低于(优选显著低于，较佳的低20%或更低；更佳的低40%或更低；进一 步更佳的低60%或更低)对照组，就表明该候选物是抑制细胞由G2期进入M期，或抑制细 胞由Gl期进入S期的潜在物质。在本发明的另一方面，提供细胞周期因子Y的用途，用于与PFTAIRE蛋白激酶 1 (PFTKl)相互作用(相互结合)，调控PFTAIRE蛋白激酶1的亚细胞定位或活性。在一个优选例中，所述的细胞周期因子Y选自(a) SEQ ID NO=I所示氨基酸序列的蛋白；或(b) (a)限定的蛋白的保守性变异蛋白质或其活性片段；或所述的PFTAIRE蛋白激酶1选自(i)SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白；或(ii) (i)限定的蛋白的保守性变异蛋白质或其活性片段。在另一优选例中，(b)项选自(1)具有SEQ ID NO=I中第143-243位氨基酸序列的蛋白；(2)具有SEQ ID NO :1中第55-341位氨基酸序列的蛋白；(3)具有SEQ ID NO :1中第84-341位氨基酸序列的蛋白；(4)具有SEQ ID NO=I中第1-310位氨基酸序列的蛋白；(5)具有SEQ ID NO=I中第1-243位氨基酸序列的蛋白；或(6)具有SEQ ID NO 1中第1-153位及第196-341位氨基酸序列的蛋白。或(ii)项选自(I)具有SEQ ID NO 2中第135-419位氨基酸序列的蛋白；或(II)具有SEQ ID NO 2中第135-430位氨基酸序列的蛋白。在本发明的另一方面，提供一种分离的蛋白，所述的蛋白选自(1)具有SEQ ID NO=I中第143-243位氨 酸序列的蛋白；
(2)具有SEQ ID NO :1中第55-341位氨基酸序列的蛋白；(3)具有SEQ ID NO :1中第84-341位氨基酸序列的蛋白；(4)具有SEQ ID NO=I中第1-310位氨基酸序列的蛋白；(5)具有SEQ ID NO=I中第1-243位氨基酸序列的蛋白；(6)具有SEQ ID NO 1中第1-153位及第196-341位氨基酸序列的蛋白；(7)具有SEQ ID NO 2中第135-419位氨基酸序列的蛋白；或(8)具有SEQ ID NO 2中第135-430位氨基酸序列的蛋白。在一个优选例中，所述的蛋白不具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的全长序列。在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的蛋 白。在本发明的另一方面，提供一种质粒载体，它含有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体；或其 基因组中整合有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种复合物，所述的复合物含有细胞周期因子Y和 PFTAIRE蛋白激酶1，两者相互结合。在本发明的另一方面，提供所述的复合物的用途，用于筛选调控PFTAIRE蛋白激 酶1的亚细胞定位或活性的物质。在本发明的另一方面，提供一种利用所述的复合物筛选调控PFTAIRE蛋白激酶1 的亚细胞定位或活性的潜在物质的方法，所述方法包括(a)在测试组中，向细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1相互作用的反应体系中 添加待筛选的候选物，并检测细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1相互作用情况；并且， 在对照组中，在不添加所述候选物的、细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1相互作用的反 应体系中，检测细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用情况；(b)将步骤(a)测试组中细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用情况 与对照组中细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用情况进行比较，如果测试组中细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用在统计学上强于 (优选显著强于，较佳的强20%或更强；更佳的强40%或更强；进一步更佳的强60%或更 强)对照组，就表明该候选物是促进PFTAIRE蛋白激酶1定位于细胞膜上或增强PFTAIRE 蛋白激酶1的激酶活性的潜在物质；如果测试组中细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1 的相互作用在统计学上弱于(优选显著弱于，较佳的弱20%或更弱；更佳的弱40%或更弱； 进一步更佳的弱60%或更弱)对照组，就表明该候选物是抑制PFTAIRE蛋白激酶1定位于 细胞膜上或降低PFTAIRE蛋白激酶1的激酶活性的潜在物质。在本发明的另一方面，提供一种抑制细胞周期进程的制剂，所述制剂是干扰分子， 其核苷酸序列如SEQ ID NO 3-7任一(较佳地为SEQ ID NO 5)所示。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。


图IA显示了在16种人组织中CCNY转录成4kb和2kb两个转录本。利用CCNY作为探针进行Northern blot分析，β-actin作为内参。图IB显示了在检测的细胞系中，CCNY的转录本只有在肝癌细胞H印G2中才有高 表达。利用了 CCNY N端162bp的核苷酸作为探针进行Northern blot分析，β-actin作 为内参。图2显示了 CCNY具有影响细胞周期的功能。(A)用pEGFPN3-CCNY或作为对照的pEGFPN3分别转染293T细胞，48h后进行流式 细胞分析。 (B)用pEGFPN3-CCNY或作为对照的pEGFPN3分别转染Ifep3B细胞，48h后进行流 式细胞分析。(C)用pEGFPN3-CCNY或作为对照的pEGFPN3分别转染H印G2细胞，48h后进行流 式细胞分析。(D)分别用 pSUPER-GFP-466，pSUPER-GFP-489, pSUPER-GFP-507，pSUPER-GFP-754 或作为对照的pSUPER-GFP转染293T细胞，48h后，提取RNA进行荧光定量PCR分析。1代
表第一次实验结果，2代表第二次实验结果。(E) pSUPER-GFP-507 (CCNY RNAi)或作为对照的 pSUPER-GFP (Mock RNAi)分别转染 293T细胞，72h后，提取RNA进行荧光定量PCR分析，用β-actin RNA作为对照。(F) pSUPER-GFP-507 或作为对照的 pSUPER-GFP 分别转染 293T 细胞，通过 Double Thymidine法将细胞阻断于G1/S过渡期，释放后，在不同的时间点收取细胞进行流式细胞 分析。其中，2N表示G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞，中间值代表S期细胞。(G) pSUPER-GFP-507或作为对照的pSUPER-GFP分别转染293T细胞，通过 Nocodazole将细胞阻断于M期，释放后，在不同的时间点收取细胞进行流式细胞分析。其 中，2N表示G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞，中间值代表S期细胞。(H)pSUPER-GFP-507或作为对照的pSUPER-GFP分别转染293T细胞，G418筛选出 稳定表达细胞株。提取蛋白，用抗CCNY抗体Western检测CCNY蛋白水平，抗tubIin抗体 作为上样量对照。(I)用 0. 5mM Mimosine 分另Ij 处理 CCNY RNAi (pSUPER-GFP-507)禾Π 对照 (pSUPER-GFP)细胞株24小时，使其同步化于Gl期，释放后，在不同的时间点收取细胞进行 流式细胞分析。其中，2N表示G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞，中间值代表S期细胞。图3显示了 CCNY与PFTKl的相互作用以及它们的相互作用所需位点。(A) CCNY与PFTKl在酵母双杂交系统的相互作用。(B)在哺乳动物中CCNY与PFTKl的体内免疫共沉淀实验。(C)在酵母双杂交系统的，利用CCNY与PFTKl的突变体寻找它们的相互作用所需 位点，为构建的CCNY突变体。(D)在酵母双杂交系统的，利用CCNY与PFTKl的突变体寻找它们的相互作用所需 位点，为构建的PFTKl的突变体。图4显示了 CCNY调控PFTKl的定位。(A) CCNY多克隆抗体的特异性检测。(B)内源性CCNY或者PFTKl在小鼠睾丸不同亚细胞组分中的定位。(C) pEGFPC2-PFT和pMycN3_CCNY两个真核表达载体单独转染293T细胞，外源性单独表达的CCNY与PFTKl在293T细胞中的间接免疫荧光定位。(D)外源性共同表达的CCNY与PFTKl在293T细胞中的共定位。图5显示了 CCNY调控PFTKl的激酶活性。(A)用CCNY多克隆抗体从小鼠脑组织中免疫沉淀CCNY后，进行Western blot分 析，用抗丝氨酸磷酸化的抗体进行检测，发现内源性的CCNY发生丝氨酸磷酸化。 (B) pEGFPC2-PFTKl和pMgcN3_CCNY在293T细胞单独表达或者共同表达后，提取细 胞总蛋白，进行Western blot分析，用抗GFP或者Myc的抗体来检测各个蛋白的表达情况， 用抗磷酸化Ser检测蛋白的磷酸化情况。发现在PFTKl存在时外源性CCNY的丝氨酸磷酸 化增强。(C)过量表达CCNY促使外源性PFTKl的激酶活性增强。在293T细胞中分别过量 表达PFTKl，CCNY以及CCNY/PFTK1，免疫沉淀相应蛋白检测对PFTKl以及Rba37的激酶活性。图6显示了 CCNY的第二位肉桂酰化修饰位点决定它的膜定位。(A)CCNY的肉桂酰化修饰位点及该位点上的G2A和N3A两个点突变体。CCNYG2A 代表了 CCNY第2位甘氨酸突变成丙氨酸，CCNY N3A CCNY第3位天冬酰胺突变成丙氨酸。(B)pEGFPN3-CCNY(CCNY-GFP)， pEGFPN3_CCNY G2A(G2A-GFP)， pEGFPN3_CCNY N3A (N3A-GFP)以及 pEGFPC2_CCNY (GFP-CCNY)表达载体分别转染 293T 细胞，DNA 用 DAPI 标 记DNA (蓝色)，在荧光显微镜下观察各个融合蛋白的亚细胞定位。(C) pEGFPN3-CCNY和pEGFPN3_CCNY G2A分别转染293T细胞，收取细胞，将细胞的 细胞膜和胞质/核组分分离后，进行western blot分析。T 总蛋白；M 膜蛋白组分；C 胞 质/核蛋白组分；NS 非特异性条带可用于上样量的参照。
具体实施例方式本发明人经过深入的研究，首次确定了一个与细胞周期的调节相关的蛋白，即细 胞周期因子Y(CyclinY，CCNY)。本发明人还发现，CCNY能与蛋白激酶家族成员PFTAIRE蛋 白激酶I(PFTKl)相互作用，从而发挥调控PFTKl激酶活性或细胞定位的作用。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原 始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化 的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化 的。如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构
成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上
由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。CCNY或其生物活性片段CCNY是一个能与PFTKl相互作用的蛋白，它属于细胞周期因子家族中的一名 新成员。本发明人分离得到的编码CCNY的cDNA片段全长为1723bp (GenBank登录号 AY504868)，其中含有一个1026bp的完整开放阅读框，序列分析表明其编码一个341氨基酸 的蛋白(SEQ ID NO :1)。BLAST搜索结果发现，在该蛋白的143-243aa之间包含一个Cyclin 家族成员特有的Cyclin box结构域，因此本发明人将之命名为细胞周期因子Y(CyclinY， CCNY)。
在人的16个组织中，CCNY在睾丸中大量表达，而在其他组织中表达量较低。在不 同的细胞系中，CCNY在肝癌细胞系HepG2中表达量最高，而在其它细胞系中表达量较低。通 过过量表达CCNY以及用RNAi抑制CCNY的表达以分析CCNY在细胞周期中的功能作用，结 果表明，过量表达的CCNY促进S和G2/M期细胞的积累，而用RNAi抑制CCNY的表达后，细 胞周期的进展受到抑制。在本发明中，所用的CCNY可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动 物。此外，所述的CCNY也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生 产重组CCNY。优选的，本发明可采用重组的CCNY。任何适合的CCNY均可用于本发明。所述的CCNY包括全长的CCNY或其生物活性 片段(或称为活性片段)。例如，所述的CCNY的氨基酸序列可以与SEQ ID N0:1所示的序 列基本上相同。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的CCNY的氨基酸序列也 包括在本发明中。CCNY或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基 酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的 技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使 本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变 生物活性。见 Watson 等 Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/ Cummings Pub. Co. P224。任何一种CCNY的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，CCNY的生物活 性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的CCNY的全部或部分功能。通常情况 下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长CCNY的活性。在更优选的条件下，所述活性 片段能够保持全长CCNY的60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、99 %或100 %的活性。作为本发明的优选方式，所述的CCNY的生物活性片段选自具有SEQ ID NO 1中 第143-243位氨基酸序列的蛋白；具有SEQ ID NO=I中第55-341位氨基酸序列的蛋白；具 有SEQ ID NO :1中第84-341位氨基酸序列的蛋白；具有SEQ ID NO 1中第1-310位氨基酸 序列的蛋白；具有SEQ ID NO 1中第1-243位氨基酸序列的蛋白；或具有SEQ ID NO :1中 第1-153位及第196-341位氨基酸序列的蛋白。经验证，CCNY的上述生物活性片段保留了 全长CCNY的生物活性，或比全长CCNY具有更优异的生物活性。本发明也可采用经修饰或改良的CCNY，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、 代谢和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的CCNY。所述经过修饰或改良的CCNY可以是一 种CCNY的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的CCNY可 以是与天然存在的CCNY具有较小的共同点，但也能调节细胞周期或与PFTKl相互作用，且 不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响CCNY的生物活性的变化形式都可用 于本发明中。一旦分离获得了所述蛋白的序列，就可以用重组法来大批量地获得该蛋白。这通 常是将其编码基因克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分 离得到。此外，对于较短的蛋白而言，也可采用人工合成(如通过多肽合成仪合成)的方法 来合成有关序列，人工合成的方法可简便且快速地得到所需要的蛋白。本发明还包括了编码所述的CCNY的生物活性片段的分离的核酸，也可以是其互补链。编码CCNY的生物活性片段的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方 法获得。在获得了编码所述的CCNY的生物活性片段的DNA序列之后，将其连入合适的表达 载体，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到所要的 蛋白。本发明还包括了包含编码所述CCNY的生物活性片段的核酸分子的载体。所述的 载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。所 述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够 调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它 就是可操作地连于编码序列。此外，含有编码所述CCNY的生物活性片段核酸序列的重组细胞也包括在本发明 中。“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌 等；例如可为大肠杆菌细胞(E. coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真 核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。PFTKl蛋白或其生物活性片段PFTKl基因是本发明人早期利用简并PCR方法筛选得到的人Cdc2相关蛋白激酶基 因，其全长为1410bp (GenBank登录号AF119833)，编码一个含469个氨基酸残基的蛋白质 (SEQ ID NO :2)。任何适合的PFTKl均可用于本发明。所述的PFTKl包括全长的PFTKl或其生物活 性片段(或称为活性片段)。例如，所述的PFTKl的氨基酸序列可以与SEQ ID NO 2所示 的序列基本上相同。任何一种PFTKl的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，PFTKl的生物 活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的PFTKl的全部或部分功能。通常 情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长PFTKl的活性。在更优选的条件下，所述 活性片段能够保持全长PFTKl的60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的活性。本发明还包括PFTKl的保守性变异蛋白，其具有与PFTKl蛋白相同功能的、SEQID NO :2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个， 较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在 C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5 个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改 变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变 蛋白质的功能。作为本发明的优选方式，所述的PFTKl的生物活性片段选自具有SEQ ID N0:2中 第135-419位氨基酸序列的蛋白；或具有SEQ ID NO :2中第135-430位氨基酸序列的蛋白。 经验证，PFTKl的上述生物活性片段保留了全长PFTKl的生物活性，或比全长PFTKl具有更 优异的生物活性。CCNY的激动剂或拮抗剂及其用途如本文所用，所述的CCNY的激动剂包括了促进剂、上调剂等。任何可提高CCNY 蛋白的活性、维持CCNY蛋白的稳定性、促进CCNY蛋白的表达、促进CCNY蛋白的分泌、延长 CCNY蛋白有效作用时间、或促进CCNY的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调节细胞周期，特别是促进细胞进入S期或G2/M期(即促进细胞积累在S期或G2/M期)的 有效物质。如本文所用，所述的CCNY的拮抗剂包括了抑制剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。任 何可降低CCNY蛋白的活性、降低CCNY蛋白的稳定性、抑制CCNY蛋白的表达、减少CCNY蛋白 有效作用时间、抑制CCNY蛋白的分泌、或抑制CCNY的转录和翻译的物质均可用于本发明， 作为可用于调节细胞周期，特别是抑制细胞由G2期进入M期、或抑制细胞由Gl期进入S期 的有效物质。作为本发明的优选方式，所述的CCNY的拮抗剂是(但不限于)特异性抗CCNY蛋 白的抗体，或特异性沉默CCNY基因表达的反义分子(如小干扰RNA或反义核苷酸等)。作为本发明的优选方式，所述的CCNY的拮抗剂是SEQ ID NO :3_7任一(较佳地为 SEQ ID NO 5)所示的干扰分子。其可良好地抑制CCNY的表达。筛选方法在得知了所述的CCNY对于调节细胞周期的用途后，可以基于该特征来筛选调节 CCNY的表达或活性，进而调节细胞周期的物质。因此，本发明提供一种筛选可用于调节细胞周期的潜在物质的方法，所述的方法 包括将候选物质与表达CCNY(包括其生物活性片段)的体系接触；和检测候选物质对 CCNY的影响；若所述候选物质可提高CCNY的表达或活性，则表明该候选物质是就表明该候 选物是促进细胞进入S期或G2/M期的潜在物质；若所述候选物质可降低CCNY的表达或活 性，就表明该候选物是抑制细胞由G2期进入M期，或抑制细胞由Gl期进入S期的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到CCNY的表达或活性的 改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达CCNY的体系。所述的体系包括(但不限于)溶液体系、亚细胞体系、细胞体系、组织体系、器官 体系、或动物体系。本发明还提供一种复合物，所述的复合物含有CCNY蛋白和PFTKl蛋白，两种蛋白 相互结合。本发明人通过酵母双杂交以及免疫共沉淀技术证明，CCNY与PFTKl能够相互结 合，从而发挥调控PFTKl活性以及细胞内定位的作用。因此，所述的复合物可以作为筛选改 变这种调控作用的筛选模型。因此，本发明还提供了一种筛选调控PFTAIRE蛋白激酶1的亚细胞定位或活性的 潜在物质的方法，所述方法包括向CCNY蛋白(包括其生物活性片段)和PFTKl蛋白(包括 其生物活性片段)相互作用(相互结合)的反应体系中添加待筛选的候选物，并检测CCNY 蛋白和PFTKl蛋白相互作用情况；如果细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用在 统计学上增强，就表明该候选物是促进PFTAIRE蛋白激酶1定位于细胞膜上或增强PFTAIRE 蛋白激酶1的激酶活性；如果细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用在统计学 上减弱，就表明该候选物是抑制PFTAIRE蛋白激酶1定位于细胞膜上或降低PFTAIRE蛋白 激酶1的激酶活性。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到CCNY蛋白 和PFTKl蛋白相互作用的变化，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物 的、CCNY蛋白和PFTKl蛋白相互作用的反应体系。本发明人还构建了多种CCNY和PFTKl的突变体用于双杂交实验，证明了 PFTKl 与CCNY的相互作用，并确定了它们结合的区域，CCNY的cyclin box和PFTKl的PFTAIRE基序为它们的相互结合所必须。体内和体外试验证明内源CCNY能与PFTKl在体内结合， 外源表达的CCNY也与PFTKl结合，这种结合不受CCNY在细胞内的定位所影响。外源表 达的CCNY定位于细胞膜上，内源性CCNY也能与细胞膜结合，CCNY可能是通过肉桂酰化 (Myristoylation)修饰而定位于膜上的蛋白。细胞定位实验和磷酸化试验证明CCNY对 PFTKl有调控作用，CCNY可以调控PFTKl在细胞内的定位，PFTKl与CCNY结合后能使PFTKl 聚集在细胞质膜周围，而单独表达的PFTKl定位于细胞质中。CCNY的结合能够激活PFTKl， CCNY与PFTKl的结合不但提高了 PFTKl自身磷酸化的能力，还提高了 PFTKl对RB的磷酸化 水平，而且膜结合的CCNY能发生丝氨酸磷酸化，这种磷酸化会因为PFTKl的结合而增强。在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领 域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术、噬菌体展示技术、酵母双杂交系统或免疫共沉 淀技术。其中，酵母双杂交是一种大规模快速研究蛋白-蛋白间相互作用的方法，具有简 单、稳定的优点。在本发明的一个优选例中，采用了酵母双杂交系统来鉴定CCNY蛋白和 PFTKl蛋白的相互作用。更具体的，在酵母细胞中，一种与DNA-结构域融合的诱饵蛋白与一 种与活化域融合的猎物蛋白相互作用。相互作用的成对分子结合于专一的序列模式，从而 活化两个独立的报道基因的转录。在本发明的一种优选方式中，采用免疫沉淀技术来验证蛋白与蛋白之间的特异性 相互作用。所述的免疫共沉淀技术的原理是在保持蛋白-蛋白相互作用的条件下，收获和 裂解细胞，从细胞提取液中特异性地免疫沉淀目的蛋白，然后通过电泳等方法分离免疫沉 淀物。具有已知特性的蛋白的共沉淀，可采用抗该蛋白的抗体，通过比如Western印迹来检 测。此外，如果细胞在裂解前已经用标记物进行过标记，则可通过放射自显影或其它免疫学 技术来观察共沉淀的蛋白。作为本发明的优选方式，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细 胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于调节细胞周期或调控PFTAIRE蛋白激酶 1的亚细胞定位或活性真正有用的物质。另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于调节细胞周期或调控 PFTAIRE蛋白激酶1的亚细胞定位或活性的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个 筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出真正有用的物质。由于现有技术中已知PFTKl参与细胞周期的调节以及参与肿瘤的发生发展，因此 对PFTKl具有调控作用的CCNY也具有潜在的调控肿瘤发生发展的应用价值。可以推测CCNY 既可以直接涉及癌化过程中细胞周期的调控失常又能够通过调控PFTKl的活性而干涉癌 化细胞的侵入和运动能力，因而对CCNY的研究最终将对肿瘤发生的检测、诊断和治疗具有 重要的生物学和医学意义。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。I、材料和方法Northern 分析不同细胞系(A431、ECV304、HELA、!fepG2、Huh7、293T、7721、C0S7、B16、NIH3T3；这 些细胞分别获自中国科学院细胞库)的总RNA是利用Qiagen公司的RNeasy Mini Kit试 剂盒提取。20 μ 1上样量包括RNA样品12μ 1(25μ g)，4y 1甲酸，2 μ 1 10XMOPS，2 μ 1上样 缓冲液、65°C加热10min，0°C冷却2min，离心5s，上样。电泳在含甲醛的变性胶上进行(Ig 琼脂糖，IOml 10XMOPS,87ml DEPC处理水，加热融化稍冷后加入2. 7ml 37%甲醛)。电泳 条件为100mA，50-70V，5-7h电泳完成后同样用毛细法转膜，转膜液用5 X SSC。转膜过夜后， 取出膜，不能使膜干透，用Bio-Ra GS GeneLinker C3 protocol紫外交联，加入IOml预杂 交液，65°C，2h后更换为IOml杂交液，加入探针65°C杂交过夜，用2XSSC，0. 1% SDS, 65°C 洗膜两次，每次30min。杂交好的膜不要晾干，用保鲜膜包好后_70°C压片。重杂交洗膜用 0. 5% SDS，90-100°C加热 5-10min，或按照 Clontech 推荐用 0. 5% SDS，90_100°C加热 IOmin 后让其自然冷却IOmin后取出备用，若不立即用，用保鲜膜包好后置于-20°C保存。SiRNA介导的基因沉默和荧光定量PCR466 序列(466-si)489 序列(489-si)507 序列(507-si)754 序列(754-si)942 序列(942-si)
5，-GAAGTGCCACCAGATTATG-3，(SEQ ID NO 3) 5，-ACACAACCCAGAGCAGAAG-3，(SEQ ID NO 4) 5，-GCAGATTTACCGGTTCGTT-3’ (SEQ ID NO 5) 5，-CTAGAGCGACAGTTTCTTG-3’ (SEQ ID NO 6) 5，-GGACCTAAGAAGATCCGCG-3’ (SEQ ID NO 7)常规方法设计针对这些序列的pSuper载体，得到pSUPER_GFP_466， pSUPER-GFP-489, pSUPER-GFP-507，pSUPER-GFP-754 或作为对照的 pSUPER-GFP。使用荧光 定量PCR检测干扰的有效性。利用Qiagen公司的RNeasy Mini Kit试剂盒提取转染不同质 粒293T细胞(获自ATCC)的总RNA。取5 μ g总RNA使用Invitrogen公司的SuperScript III first-strand synthesis system试剂盒完成RNA的反转录。随后的定量PCR实验是 使用Qiagen公司的QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒，在ABI7500机器上完成。人的 β-actin持家基因作为对照。CCNY和β-actin的标准曲线是分别pB42AD_Cyclin Y(酵 母双杂交筛选人脑cDNA文库获得)和pRFP-actin (获自Contech)为模板，设立5个稀释 滴度，通过三次平行实验建立。通过Primerbank的帮助，设计和使用如下Cyclin Y引物Cyclin Y 引物 1-F :5，-tcaatccttcagatcatcctcgg-3，(SEQ ID NO 8)；Cyclin Y 引物 I-R :5，-tggttgactgactgtgctatca-3，(SEQ ID NO 9)；Cyclin Y 弓丨物 2_F:5，-gaccgggagaacatagacga-3，(SEQ ID NO 10)；
0143]Cyclin Y 引物 2_R :5，-aaatggtggagcaggaactg-3，(SEQ ID N0:11)。Actin则使用如下引物ACTIN. F 5' -gctccggcatgtgcaa—3，(SEQ ID NO 12)；ACTIN. R :5，_aggatcttcatgaggtagt_3，(SEQ ID NO 13)。酵母双杂交的方式鉴定蛋白的相互作用挑取1 3个2 3mm直径的EGY48酵母(购自Clontech)菌落与50ml YPD (或对应的营养筛选SD)培养基中；30°C 300rpm培养到稳定态(0D600 > 1. 5)；转接到另一瓶 50ml YPD (或对应的营养筛选SD)培养基中，0D600 = 0. 2 0. 3 ；30°C 300rpm培养约三个 小时，0D600 = 0. 4 0. 6时取出。室温离心4000rpm 3min，弃上清，细胞重悬于25ml无菌 水中；室温离心4000rpm 3min，弃上清；重悬于1. 5ml ρΗ7· 51ΧΤΕ/0. IMLiAc中。准备PEG/ LiAc溶液；在1. 5ml Eppendof管中依次加入酵母质粒0. 1 μ g(如果共转化，则每种质粒各 加入0. 1 μ g)，10 μ 1 10mg/ml鱼精DNA,混勻；加入0. Iml酵母感受态细胞和0. 6ml PEG/ LiAc，振荡混勻；30°C 200rpm培养30min ；42°C热冲击15min，期间不时轻轻摇勻；冰浴1 2min ；高速离心15s，吸掉上清，用0. 2ml TE重悬细胞；涂布于适当的营养筛选SD平板上。 取一张Whatman滤纸，覆盖于相应的选择性培养基上(碳源为半乳糖)，用灭菌牙签从选择 性培养基平板上挑取酵母转化子菌落(直径1 2mm)点到滤纸上，30°C培养2天，然后取出 小心浸入液氮中(菌落面朝上)，约半分钟后取出，置室温几分钟，将滤纸(菌落面朝上)放 于用 Z buffer/X-gal 溶液(100ml Zbuffer 中加入 1. 67ml 20g/L 的 X_gal，0. 27ml β -巯 基乙醇；Z buffer含6(kimoVLNa2HPO4，40mmol/L NaH2PO4, IOmmo 1/L KCl,lmmol/L MgSO4)预 湿的滤纸上，30°C培养0. 5 8h，检验菌落是否显蓝色，8h内显蓝色的菌落β -半乳糖苷酶 活性为阳性。免疫共沉淀和激酶活性检测实验转染质粒的哺乳细胞培养24-48小时，弃去细胞培养液，用PBS洗两次。在RIPA 裂解液(50mM Tris-HCl pH 7. 5, ImM EDTA, 50mM NaCl,0. 5%NP-40, ImM EDTA)中补加各种 蛋白酶抑制剂，按60mm培养皿0. 5ml, IOOmm培养皿Iml的用量将裂解液均勻覆盖在细胞表 面，在冰上放置20分钟；然后刮下细胞，收集到1. 5ml离心管中，超声4°C，12000rpm离心10 分钟，上清即为细胞裂解液。按需要分装成小份，保存于-80°C。当从小鼠组织中提取总蛋 白时，取200mg组织，用2ml的PBS溶液洗涤后弃去上清，沉淀重悬于2ml的PBS溶液，将组 织勻浆后，IOOOg离心5分钟，去掉上清，沉淀再重悬于RIPA裂解液中，超声。在4°C 14000g 条件下离心lOmin，弃沉淀，上清即为组织裂解液。取500 μ 1细胞抽提物，加入25 μ 1床体积的蛋白G琼脂糖珠，在4°C旋转混合1小 时后低速离心，吸取上清加入5 μ g相应的单抗，在4°C旋转混合1小时，然后加入30 μ 1床 体积的蛋白G琼脂糖珠，继续混合2小时。用于Western Blot的免疫共沉淀物用裂解液洗涤五次，然后重悬在2X蛋白质电 泳上样缓冲液中，进行SDS-PAGE电泳。用湿法将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上，用含5% 脱脂奶粉的TBS-T溶液封闭膜2-3小时，一抗4°C结合过夜。用TBS-T室温洗膜1次，5分 钟。用相应的二抗于室温结合1小时，再用TBS-T洗膜四次，每次5分钟，用吸水纸吸尽多 余的液体，用SuperSignal ECL试剂显色。用于激酶实验的免疫共沉淀物，用裂解液洗涤三次，再用洗涤液(50mM HEPESpH 7. 5, ImM DTT)洗涤一次，离心，去上清。用 25 μ 1 反应体系(50mM HEPES pH7. 5，ImM DTT, IOmM)将免疫沉淀的产物重悬，在30°C反应30分钟，加入SDS-PAGE上样缓冲液阻断反应， 进行SDS-PAGE电泳，放射显影。CCNY多克隆抗体的制备用引物5，-GATGGATCCAAGATGGGGAACACTACCTC-3，(SEQID NO 14)，5，-ATACTCGAG CTCCGTAGTTAAGAGATGATG-3，(SEQ ID NO 15)，以利用双杂交筛选人脑CDNA文库所获的CCNY全长cDNA片段为模板，PCR扩增CCNY基因的全长开放阅读框，在其上下游分别引入BamHl/ Xhol酶切位点，将CCNY基因的全长开放阅读框插入到pET28a(+)(购自MERCK)载体多克 隆位点的BamHl/Xhol酶切位点之间，构建成为pET28a_CCNY质粒。导入大肠杆菌表达菌株 BL21,0. ImMIPTG诱导3h，表达的His-CCNY融合蛋白大部分集中在包涵体中，因此取沉淀。 沉淀分别用1M，2M，4M尿素裂解缓冲液洗一次，然后于4°C 14000rpm离心20分钟，弃上清。 沉淀用5XSDS蛋白缓冲液变性，8% SDS-PAGE胶分离，考马斯亮兰染色，将目的条带，割胶 分离，电洗脱，洗脱液用作抗原，然后按照常规方法免疫兔子，获得CCNY蛋白的抗体，经验 证发现，该抗体结合CCNY的特异性良好(图4A)。亚细胞定位检测质粒经Qiaqen公司Plasmid Midi Kit纯化后，用磷酸钙法或者脂质体法转 染细胞，质粒用量为20 μ g/Φ IOcm皿。培养48h。弃去培养液，用PBS洗涤细胞1次， 以4%多聚甲醛(paraformaldehyde)固定细胞20min ；用PBS洗涤细胞1次；用0. TritonX-IOO 处理 5min 后，细胞在 1 μ g/ml DAPI (4，，6-diamidino-2_phenylindole)中 进行细胞核染色5min ；免疫荧光实验时需要在含有0. 1% Triton X-100和5% BSA的PBS 溶液中封闭1小时，接着将anti-Myc (Santa Cruz，l 150稀释)抗体加入1 % BSA的 PBS溶液中杂交3小时，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟，接着孵育FITC或TRITC耦联 的二抗(Sigma，1 400稀释)1小时，再次用PBS洗涤细胞3次；再在lyg/mlDAPlG’， 6-diamidino-2-phenylindole)中进行细胞核染色5min。用镊子将盛有细胞的盖玻片从培 养皿中揭起，置于暗房中晾干；用ProLong antifade (Invitrogen)将盖玻片固定在载玻片 上，在暗房晾干；使用荧光显微镜在不同波长紫外光光源下观察并拍照。载体构建插入CCNY片段的双杂交的表达质粒(PB42AD-CCNY)的是本发明人筛选人脑cDNA 文库时，直接获得的含有CCNY基因的全长开放阅读框的表达质粒。PEGFPN3-CCNY的构建如下以pB42AD_CCNY为模板，利用以下引物5，-CCGCTCGAGAGATGGGGAACACTACCTCGTGCT-3，(SEQ ID NO 16)；5，-CGCGGATCCAGAGATGATGGCTGGGGACCA-3，(SEQ ID NO 17)；PCR扩增CCNY基因的全长开放阅读框，在其上下游分别引入XhoI/BamHI酶切位 点，将CCNY基因的全长开放阅读框插入到pEGFPN3 (购自Clontech)载体多克隆位点的 XhoI/BamHI酶切位点之间，构建成为pEGFPN3_CCNY表达质粒。插入片段经测序确证。分别含有466序列、489序列、507序列、754序列、942序列的pSuper (获自 Oligoengine)载体的构建如下化学合成针对CCNY的发夹状的寡核苷酸正反向各64个碱 基，将其退火形成双链，插入到PSuper载体多克隆位点的Bglll/Hindlll酶切位点之间，构 建相应的RNAi质粒。466序列、489序列、507序列、754序列、942序列对应的CCNY的发夹 状的寡核苷酸64个碱基的正反序列如下466 正向核苷酸片段(SEQ ID NO 18)5’ GATCCCCGAAGTGCCACCAGATTATGTTCAAGAGACATAATCTGGTGGCACTTCTTTTTA 3’ ；466 反向核苷酸片段(SEQ ID NO 19)5， AGCTTAAAAAGAAGTGCCACCAGATTATGTCTCTTGAACATAATCTGGTGGCACTTCGGG 3’ ；489 正向核苷酸片段(SEQ ID NO 20)
5’ GATCCCCACACAACCCAGAGCAGAAGTTCAAGAGACTTCTGCTCTGGGTTGTGTTTTTTA 3’ ；489 反向核苷酸片段(SEQ ID NO 21)5， AGCTTAAAAAACACAACCCAGAGCAGAAGTCTCTTGAACTTCTGCTCTGGGTTGTGTGGG 3，；507 正向核苷酸片段(SEQ ID NO 22)5’ GATCCCCGCAGATTTACCGGTTCGTTTTCAAGAGAAACGAACCGGTAAATCTGCTTTTTA 3’ ；507 反向核苷酸片段(SEQ ID NO 23)5， AGCTTAAAAAGCAGATTTACCGGTTCGTTTCTCTTGAAAACGAACCGGTAAATCTGCGGG 3’ ；754 正向核苷酸片段(SEQ ID NO 24)5’ GATCCCCCTAGAGCGACAGTTTCTTGTTCAAGAGACAAGAAACTGTCGCTCTAGTTTTTA 3’ ；754 反向核苷酸片段(SEQ ID NO 25)5， AGCTTAAAAACTAGAGCGACAGTTTCTTGTCTCTTGAACAAGAAACTGTCGCTCTAGGGG 3，；942 正向核苷酸片段(SEQ ID NO 26)5’ GATCCCCGGACCTAAGAAGATCCGCGTTCAAGAGACGCGGATCTTCTTAGGTCCTTTTTA 3’ ；942 反向核苷酸片段(SEQ ID NO 27)5 ’ AGCTTAAAAAGGACCTAAGAAGATCCGCGTCTCTTGAACGCGGATCTTCTTAGGTCCGGG3’。插入PFTKl片段的双杂交的表达质粒(PB42AD-PFTK1)的构建如下通过兼并PCR 的方式获得编码PFTKl完整开放阅读框的cDNA，以此为模版，利用引物5，-GACTGAATTCATGTGTGACCTCATTGAGCCGCAGCCGGC-3，(SEQ ID NO 28)；5，-GACTGGATCCTGCTCTTGAGATTGTGCTGCTTGTCAGTG-3，(SEQ ID NO 29)；PCR扩增PFTKl基因的全长开放阅读框，在其上下游分别引入EcoRI/BamHl酶切位 点，将PFTKl基因的全长开放阅读框插入到pEGFPC2载体(购自Clontech)多克隆位点的 EcoRI/BamHl酶切位点之间，构建成为pEGFPC2_PFTKl质粒。插入片段经测序确证。插入PFTKl片段的双杂交的表达质粒(pGiIda-PFTKl)的构建如下将 PEGFPC2-PFTK1质粒以EcoRI和BamHl双酶切，得到PFTKl基因的全长开放阅读框的带有粘 性末端的的片段，将该片段插入到PGilda载体多克隆位点的EcoRI/BamHl酶切位点之间， 构建成为融合蛋白酵母系统表达质粒pGilda-PFTK，PFTKl基因的阅读框与LexA的一致。包含PFTKl突变体的表达载体的构建如下基于前述构建pGiIda-PFTKl，采用常 规的定点突变方法，将其中对应于编码PFTKl氨基酸序列N端第119位和282位S的密码 子突变为编码A的密码子(PFTK1 S119A/S282A)；将其中对应于编码PFTKl氨基酸序列N端 第164位K的密码子突变为编码R的密码子(PFTK1 K164R)；将其中对应于编码PFTKl氨 基酸序列N端第176位F的密码子缺失突变(PFTK1 F176 Δ )；将其中对应于编码PFTKl氨 基酸序列N端第224位H的密码子突变为编码N的密码子(PFTK1 Η224Ν)；将其中对应于 编码PFTKl氨基酸序列N端第246位D的密码子突变为编码A的密码子(PFTK1 D256A)。包含CCNY突变体的表达载体的构建如下以PB42AD-CCNY为模板，利用引物5，-GATGGATCCAGATGGGGAACACTACCTC-3，(SEQ ID NO 30)；5，-GATCTCGAGTAAGAGATGATGGCTGGGGAC-3，(SEQ ID NO 31)；PCR扩增CCNY基因的全长开放阅读框，在其上下游分别引入BamHl/Xhol酶切位 点，将CCNY基因的全长开放阅读框插入到pGilda载体(购自Clontech)的多克隆位点的 BamHl/Xhol酶切位点之间，构建成为pGilda_CCNY表达质粒。
以PB42AD-CCNY为模板，利用引物5，-GTACTCGAGATGGAATTCAATCCTTCAGATCATCC-3，(SEQ ID NO 32)；5，-GATCTCGAGTAAGAGATGATGGCTGGGGAC-3，(SEQ ID NO 33)；PCR扩增编码CCNY氨基酸序列55-341之间序列的片段，插入到pGilda载体的多 克隆位点的EcoRI/Xhol酶切位点之间，构建成为pGiIda-CCNY(55-341)表达质粒。以PB42AD-CCNY为模板，利用引物5，-ATAGAATTCCTCTTCATTAACCATCATC-3，(SEQ ID NO 34)；5，-GATCTCGAGTAAGAGATGATGGCTGGGGAC-3，(SEQ ID NO 35)；扩增编码CCNY 84-341之间序列的片段，插入到pGi 1 da载体的多克隆位点的 EcoRI/Xhol酶切位点之间，构建成为pGiIda-CCNY(84-341)表达质粒。以pB42AD-CCNY为模板，利用引物5，-ATAGAATTCGATGGAAGGATGCTCTTAG-3，(SEQ ID NO 36)；5，-GATCTCGAGTAAGAGATGATGGCTGGGGAC-3，(SEQ ID NO 37)；扩增编码CCNY 137-341之间序列的片段，插入到pGilda载体的多克隆位点的 EcoRI/Xhol酶切位点之间，构建成为pGiIda-CCNY(137-341)表达质粒。以pGilda-CCNY为模板，利用引物5，-CGTCAGCAGAGCTTCACCATT-3，(SEQ ID NO 38)；5，-GATGGATCCGTTCAAATCGTCTATGTTCTCC-3，(SEQ ID NO 39)；扩增编码CCNY 1-54之间序列的片段，插入到pGilda载体的多克隆位点的EcoRI/ BamHl酶切位点之间，构建成为pGiIda-CCNY(1_54)表达质粒。 以pB42AD-CCNY为模板，利用引物5，-GATGGATCCAGATGGGGAACACTACCTC-3，(SEQ ID NO 40)；5，-ATACTCGAGGTCTTTCAGGATCTGGCAG-3，(SEQ ID NO 41)；扩增编码CCNY 1-243之间序列的片段，插入到pGilda载体的多克隆位点的 BamHl/Xhol酶切位点之间，构建成为pGilda-CCNY(l_243)表达质粒。以pB42AD-CCNY为模板，利用引物5，-GATGGATCCAGATGGGGAACACTACCTC-3，(SEQ ID NO 42)；5，-CGACTCGAGCTCGCAGAGGCGAGAGATG-3，(SEQ ID NO 43)；扩增编码CCNY 1-310之间序列的片段，插入到pGilda载体的多克隆位点的 BamHl/Xhol酶切位点之间，构建成为pGilda-CCNY(l_310)表达质粒。以pB42AD-CCNY为模板，利用引物5，-GATGGATCCAGATGGGGAACACTACCTC-3，(SEQ ID NO 44)；5，-GATGGTACCCGAAAGAGGGTGAAGATTTTCATC-3，(SEQ ID NO 45)；扩增编码CCNY 1-153之间序列的片段，插入到pGilda载体的多克隆位点的 BamHl/Kpnl酶切位点之间，构建成为pGiIda-CCNY(1-153)表达质粒。以pB42AD-CCNY为模板，利用引物5，-GATGGTACCGAAAGACTTTTAACATACGCAGAG-3，(SEQ ID NO 46)；5，-GATCTCGAGTAAGAGATGATGGCTGGGGAC-3，(SEQ ID NO 47)；扩增编码CCNY 196-341之间序列的片段，插入到pGiIda-CCNY(1_153)载体的Kpnl/Xhol酶切位点之间，构建成为pGilda-CCNYA (154-195)表达质粒。pEGFPC2-PFTKl (表达GFP-PFTK1的表达载体)的构建如下利用引物5，-GACTGAATTCATGTGTGACCTCATTGAGCCGCAGCCGGC-3，(SEQ ID NO 48)；5，-GACTGGATCCTGCTCTTGAGATTGTGCTGCTTGTCAGTG-3，(SEQ ID NO 49)；PCR扩增PFTKl基因的全长开放阅读框，在其上下游分别引入EcoRI/BamHl酶切位 点，将PFTKl基因的全长开放阅读框插入到pEGFPC2载体多克隆位点的EcoRI/BamHl酶切 位点之间，构建成为PEGFPC2-PFTK1质粒。插入片段经测序确证。 pMgcN3-CCNY (表达CCNY-Myc的表达载体)的构建如下利用引物5，-CCGCTCGAGAGATGGGGAACACTACCTCGTGCT-3，(SEQ ID NO 50)；5，-CGCGGATCCAGAGATGATGGCTGGGGACCA-3，(SEQ ID NO 51)；PCR扩增CCNY基因的全长开放阅读框，在其上下游分别引入XhoI/BamHl酶切位 点，将CCNY基因的全长开放阅读框插入到pMycN3载体(将pEGFPN3质粒中标签蛋白GFP 替换为标签蛋白Myc改造成pMycN3载体)多克隆位点的XhoI/BamHl酶切位点之间，构建 成为pMycN3-CCNY表达载体。插入片段经测序确证。pEGFPN3-G2A的构建如下基于前述构建pEGFPN3_CCNY，采用常规的定点突变方 法，将其中对应于编码CCNY氨基酸序列N端第2位G的密码子突变为编码A的密码子。pEGFPN3-N3A的构建如下基于前述构建pEGFPN3_CCNY，采用常规的定点突变方 法，将其中对应于编码CCNY氨基酸序列N端第3位N的密码子突变为编码A的密码子。pEGFPC2-CCNY的构建如下以pB42AD_CCNY为模板，利用引物5，-GATGGTACCAGATGGGGAACACTACCTCGTGC-3，(SEQ ID NO 52)；5，-CGCGGATCCAGAGATGATGGCTGGGGACCA-3，(SEQ ID NO 53)；PCR扩增cylcinY基因的全长开放阅读框，在其上下游分别引入Kpnl/BamHl酶切 位点，将cylcinY基因的全长开放阅读框插入到pEGFPC2载体(购自Clontech)多克隆位 点的Kpnl/BamHl酶切位点之间，构建成为pEGFPC2_cyclinY质粒。II、实施例实施例1、CCNY基因的转录CCNY是本发明人利用酵母双杂交的方法筛选得到的一个能与PFTKl相互作用的 蛋白，它属于细胞周期因子家族中的一名新成员。本发明人以CCNY基因为模板来标记探针，进行杂交实验，Northern杂交检测到 CCNY大小分别为4. Okb和2. Okb的两个转录本。在检测的16个人组织(各组织代号如下 He为心脏；Br为脑；PL为胎盘；Lu为肺；Li为肝脏；SM为骨骼肌；Ki为肾；Pa表示胰腺；Sp 为脾；Th为胸腺；Pr为前列腺；Te为睾丸；Ov为卵巢；SI为小肠；Co为结肠；PBL为外周血 白细胞)中，4. Okb转录本呈组成性低水平表达，然而2. Okb转录本则有所不同，它在不同组 织中的表达量差异很大，在睾丸中大量表达，在心脏和骨骼肌中也有较高的表达量，而在其 他组织中却表达量很低(图1A)。本发明人以CCNY基因5’端162个核苷酸作为模板来标记探针，进行杂交实验， 检测CCNY基因在不同细胞系中的表达情况。杂交实验结果表明，在这几种细胞系中都有 4. Okb和2. Okb两个CCNY转录本。虽然CCNY在各个细胞系中都有转录(图1B)，但是在大 部分细胞中的转录量都较低，只有在肝癌细胞株HepG2细胞中能检测到高的转录量。
实施例2、CCNY影响细胞周期的进展从结构上分析，CCNY蛋白是Cyclin家族的成员，从功能上分析，CCNY参与对细胞 周期的调控。将构建CCNY的真核表达载体pEGFPN3-CCNY并将它和空载体pEGFPN3 (购自 Clontech)分别转染293T细胞，培养48小时后进行流式细胞分析，分析过量表达CCNY对细 胞周期的影响。结果表明，外源性过量表达CCNY的细胞S期和G2/M期的细胞数目增多，S 期细胞数目从32%增加到41%，G2/M细胞数目从8%增加到16%，而Gl细胞数目由58% 降到41% (图2A)。本发明人在其它细胞株中也检测到相似的趋势变化。以H印3B细胞(获自中国科 学院细胞库)作为实验对象，将真核表达载体PEGFPN3-CCNY转染!fep3B细胞或H印G2细 胞，分析过量表达CCNY对细胞周期的影响。与对照相比，过表达CCNY之后，!fep3B细胞处于 G2/M期的细胞从19. 90%增加到29. 16% (图2B) ；HepG2细胞处于S期的细胞从18. 11% 增加到25. 01% (图2C)。结果表明，过表达CCNY能够改变细胞周期的分布，提示CCNY在 调控细胞周期的过程中发挥作用。本发明人通过基因沉默的手段抑制内源性CCNY在293T细胞中的表达。在293T细 胞中转染目的siRNA载体(466，489，507，754和942)或者作为对照的siRNA (pSuper-GFP) 载体，培养48小时后，收获细胞，提取总RNA，反转录后进行荧光定量PCR试验，结果表明 466-si，489-si，507-si和754-si都能有效抑制CCNY在293T细胞中的表达(图2D)。选 用507-si来进行进一步的研究，它可以将CCNY的mRNA水平降低60%以上(图2E)。507-si转染的293T细胞，培养24小时后，通过双胸腺嘧啶脱氧核苷 (DoubleThymidine)阻断的方法把细胞同步化于G1/S期，释放细胞后，每隔1小时胰酶消 化，收取细胞，碘化丙啶染色后通过流式细胞仪进行分析。结果表明G2/M过渡期的细胞进 程受到抑制(图2F)。接着用507-si转染293T细胞，培养24小时后，通过600ng/ml Nocodazole将细 胞同步化于M期，释放细胞，每隔2小时胰酶消化，收取细胞，碘化丙啶染色后通过流式细胞 仪进行分析。结果表明G1/S过渡期的细胞进程受到抑制(图2G)。本发明人进一步用G418筛选出了稳定表达507_siRNA和对照空载体siRNA的细 胞株，抽提总蛋白后进行Western检测，结果显示与对照相比507-si稳定株中CCNY蛋白水 平得到了显著的下调(图2H)。用0. 5mM Mimosine分别处理细胞24小时，使其同步化于 Gl期，释放后，在不同的时间点收取细胞进行流式细胞分析。结果显示释放11个小时之后 对照组细胞大部分进入了 S期，而CCNY RNAi组细胞在13个小时后才大部分进入S期，此 时对照组细胞已有一部分进入G2/M期了(图21)。说明RNAi CCNY能够抑制细胞从Gl期 进入S期，揭示了 CCNY具有促进细胞从Gl期向S期转化的功能。图2F，图2G和图21都说 明，利用RNAi下调细胞内CCNY水平，并分别把细胞同步化于G1/S期，M期或Gl期，都能减 慢细胞周期的进程。综合上述结果，表明CCNY对于细胞周期的进程有作用。实施例3、CCNY与PFTKl的结合作用为了验证PFTKl与CCNY的相互作用，将插入PFTKl片段和CCNY片段的两种双杂 交的表达质粒共转化酵母受体菌EGY48 (获自Clontech)，通过检测共转化子的β _半乳糖 苷酶活力检测它们在酵母双杂交系统的相互作用，结果显示CCNY能与PFTKl结合(图3Α)。
为了进一步证实CCNY与PFTKl的相互作用，本发明人运用免疫共沉淀的方法研究 内源性的CCNY与内源性的PFTKl在老鼠脑组织中的相互作用，结果证实二者在小鼠脑组织 中能够结合(图3B)。为了确定CCNY上与PFTKl结合的区域，本发明人用PCR的方法构建CCNY (位点计 算参照GenBank登录号AY504868公开的序列)的各种突变体到双杂交的表达载体pGilda 上，在酵母双杂交系统中分别检测它们与PB42AD-PFTK1的相互作用，结果表明cyclin box 结构域对两者的相互作用十分重要，而N端和C端的区域的缺失并不影响CCNY与PFTKl的 结合(图3C)。尽管cyclin box两侧的序列也是CCNY与PFTKl结合所需要的，但这些序列 可能只是在维持cyclin box的正常结构中起作用。PFTKl是一个⑶K分子，分析PFTKl的结构发现，像其它⑶K分子一样，在PFTKl从 第135-430 (位点计算参照GenBank登录号AF119833公开的序列)约300个氨基酸的这 个保守的激酶催化结构域区段中可以预测到许多潜在的功能结构域和活性位点，比如，ATP 结合结构域、Ser/Thr激酶活性位点和PSTAIRE基序(图3D)。针对PFTKl上这些预测的 功能位点，本发明人构建了一系列的突变。其中包括=PFTKl的PFTAIRE序列中的苯丙氨酸 Phe (F)缺失的突变体F176A，突变了 14_3_3相互作用位点的突变体S119A/S282A(第119 位由S突变为A/第282位由S突变为A)，预测的ATP结合位点突变了的突变体K164R(第 164位由K突变为R)，预测的亚铁血红素结合位点突变了的突变体H224N(第224位由H突 变为N)，以及预测的激酶活性位点突变了的突变体D256A (第256位由D突变为A)(图3D)， 将这些突变体构建到双杂交的表达载体PGilda中，在酵母双杂交系统中分别检测它们与 PB42AD-CCNY的相互作用，结果表明除了 F176A外，剩余的这些突变体均不影响PFTKl与 CCNY的相互作用(图3D)。在酵母双杂交系统中，只有PFTKl的F176 Δ突变体不能与CCNY 相互作用，从而证明了 PFTAIRE序列是参与结合CCNY的重要位点(图3D)。本发明人同时 证明了 PFTAIRE序列是一个CCNY特异的结合位点，因为PFTAIRE序列中的苯丙氨酸的缺失 并不能影响PFTKl与其它蛋白比如14-3-3的结合，CCNY含有一个cyclin box结构域，而 这个结构域是Cyclin结合并激活⑶K所必需。实施例4、CCNY是PFTKl的调控亚基利用细胞组分分离的方法，本发明人检测了内源性PFTKl在睾丸组织中的表达情 况。结果表明，内源的PFTKl和CCNY主要定位于睾丸组织的细胞膜和胞质中，只有极少部 分能存在于细胞核内(图4B)。所用CCNY抗体(anti-CCNY)为多克隆抗体，它的特异性检 测如图4A所示。本发明人通过荧光定位的方式观察外源性PFTKl (GFP-PFTK1)或CCNY融合蛋白 (CCNY-Myc)在293T细胞内单独表达时的定位。结果发现，与内源性PFTKl不同，外源性表 达的PFTKl融合蛋白只能定位于胞质中，而外源性表达的CCNY融合蛋白则定位于细胞膜 上，提示在体内PFTKl的膜定位极受到CCNY的调控(图4C)。为了检验以上假设，本发明人通过荧光定位的方式观察外源性PFTKl (GFP-PFTK1) 或CCNY融合蛋白(CCNY-Myc)在细胞内共同表达时的亚细胞定位。尽管单独表达的 GFP-PFTK1融合蛋白定位于细胞质中，而单独表达的CCNY-Myc融合蛋白则基本结合在膜上 (图4C)；一旦将CCNY融合蛋白和PFTKl融合蛋白在细胞内共同表达，它们会呈现出明显的 共定位于膜上的现象(图4D)。
CCNY-PFTK1的亚细胞定位分析的结果揭示该复合可能作用的活性空间，对进一步 研究它们的功能，寻找它们的作用底物提供了线索。Cyclin分子可以调控⑶K的亚细胞定位，更是Cdk蛋白激酶活性和底物的专一性 方面所必需的。因而本发明人检测了 CCNY对PFTKl的激酶活性的调控。本发明人通过免 疫沉淀和Western blot分析的方式发现小鼠脑组织中内源性的CCNY的丝氨酸位点上存在 磷酸化(图5A)。而当本发明人将pEGFPC2-PFTKl和pMgcN3_CCNY在293T细胞共同表达时，发现 CCNY的这种丝氨酸磷酸化在PFTKl存在下被明显增强(图5B)。上述结果表明CCNY发生丝氨酸磷酸化，并且这种磷酸化在PFTKl的存在下被明显 增强。PFTKl除了可以增强CCNY的磷酸化外，它对其它底物的激酶活性也受到CCNY的 调控。通过免疫共沉淀和激酶实验检测CCNY对PFTKl激酶活性的影响，结果表明在CCNY 存在时，PFTKl对Rba37的磷酸化作用增强(图5C)。同时本发明人在该激酶实验也检测到 PFTKl自身的磷酸化，并且发现CCNY会使它的自身磷酸化水平增强(图5C)。综合以上结果，可以得出，CCNY是一个PFTKl的调控亚基，它可以调控PFTKl的亚 细胞定位，并增强PFTKl的激酶活性。实施例5、CCNY与细胞膜的结合是由肉桂酰化修饰决定CCNY的膜定位现象引起了本发明人的注意，蛋白定位于膜上的方式通常有两种 自身存在能定位到膜上的信号；或者与其它蛋白结合后被定位到膜上。对CCNY的蛋白序列 分析后，本发明人发现在它的N端存在一个潜在的肉桂酰化修饰位点(图6A)。提示由于肉 桂酰化的修饰影响了 CCNY蛋白的亚细胞定位，导致CCNY能够结合在细胞膜上。为了检验CCNY是不是因为肉桂酰化而定位于膜上，本发明人利用PCR方法，构建 了两个CCNY点突变的表达质粒编码CCNY氨基酸序列第2位Gly突变成Ala的表达载体 PEGFPN3-G2A和编码CCNY氨基酸序列第3位N突变成A的表达载体pEGFPN3_N3A。这两个 突变体的荧光定位实验结果表明，第2位氨基酸突变的突变体G2A完全丧失了与膜结合的 功能，只能弥散在胞质并大量聚集于细胞核。第3位氨基酸突变的突变体N3A显示出与野 生型CCNY相似的定位，表明这种膜结合能力的丧失完全是第2位Gly特异性的(图6B)。同时本发明人构建了 pEGFPC2-CCNY表达质粒，在这个载体中，CCNY蛋白的N端融 合了一个GFP蛋白，从而可以屏蔽肉桂酰化的修饰位点。对PEGFPC2-CCNY表达的蛋白进行 定位分析，结果表明，与G2A突变体相同，GFP-CCNY蛋白只能弥散在胞质并大量聚集于细胞 核(图6B)。为了充分证明这一点，本发明人对转染了 pEGFPN3-G2A和pEGFPN3_CCNY的293T 细胞进行组分分离试验，将分离的细胞质和细胞膜组分进行Western blot检测，结果表明 只CCNY能在膜组分中检测到(图6C)。以上实验充分证明，CCNY是一个由于肉桂酰化修饰定位于膜上的蛋白。N-肉桂 酰化是一个重要的不可逆修饰。但是在某些条件下，比如PH的改变，钙离子的结合或其他 蛋白的结合等等，蛋白的结构会发生改变，N端的myristoyl基被掩盖，此时蛋白就可以与 膜解离，因而，肉桂酰化修饰决定的蛋白与膜的结合是一个可逆的过程。因为这种由肉桂酰 化修饰决定的膜定位存在着复杂调控，决定CCNY在体内的定位也存在复杂调控，因而它对PFTKl的调控将更加复杂，提示这一蛋白及它与PFTKl的复合物对细胞的生命活动具有重 要的影响。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
细胞周期因子Y或其激动剂或拮抗剂的用途，其特征在于，用于制备调控细胞周期的制剂。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的细胞周期因子Y或其激动剂用于制备 促进细胞周期进程的制剂；或所述的细胞周期因子Y的拮抗剂用于制备抑制细胞周期进程的制剂。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的促进细胞周期进程包括促进细胞进 入S期或G2/M期；或所述的抑制周期细胞进程包括抑制细胞由G2期进入M期，或抑制细胞由Gl期进入S期。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的细胞周期因子Y的拮抗剂选自特异 性结合细胞周期因子Y的抗体；或特异性干扰细胞周期因子Y表达的干扰分子。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的特异性干扰细胞周期因子Y表达的干 扰分子是SEQ ID NO :3-7任一所示核苷酸序列的干扰分子。
6.一种筛选调控细胞周期的潜在物质的方法，其特征在于，所述方法包括(a)在测试组中，向表达细胞周期因子Y的体系中添加待筛选的候选物，并检测细胞周 期因子Y的表达或活性；并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、表达细胞周期因子Y的 体系中，检测细胞周期因子Y的表达或活性；(b)将步骤(a)测试组中细胞周期因子Y的表达或活性与对照组中细胞周期因子Y的 表达或活性进行比较，如果测试组中细胞周期因子Y的表达或活性在统计学上高于对照组，就表明该候选物 是促进细胞进入S期或G2/M期的潜在物质；若测试组中细胞周期因子Y的表达或活性在统 计学上低于对照组，就表明该候选物是抑制细胞由G2期进入M期，或抑制细胞由Gl期进入 S期的潜在物质。
7.细胞周期因子Y的用途，其特征在于，用于与PFTAIRE蛋白激酶1相互作用，调控 PFTAIRE蛋白激酶1的亚细胞定位或活性。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的细胞周期因子Y选自(a)SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的蛋白；或(b)(a)限定的蛋白的保守性变异蛋白质或其活性片段；或所述的PFTAIRE蛋白激酶1选自(i)SEQID NO :2所示氨基酸序列的蛋白；或(ii)(i)限定的蛋白的保守性变异蛋白质或其活性片段。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，(b)项选自(1)具有SEQID NO 1中第143-243位氨基酸序列的蛋白；(2)具有SEQID NO :1中第55-341位氨基酸序列的蛋白；(3)具有SEQID NO :1中第84-341位氨基酸序列的蛋白；(4)具有SEQID NO 1中第1-310位氨基酸序列的蛋白；(5)具有SEQID NO 1中第1-243位氨基酸序列的蛋白；或(6)具有SEQID NO 1中第1-153位及第196-341位氨基酸序列的蛋白。或(ii)项选自(I)具有SEQID NO 2中第135-419位氨基酸序列的蛋白；或(II)具有SEQID NO 2中第135-430位氨基酸序列的蛋白。
10.一种分离的蛋白，其特征在于，所述的蛋白选自(1)具有SEQID NO 1中第143-243位氨基酸序列的蛋白；(2)具有SEQID NO :1中第55-341位氨基酸序列的蛋白；(3)具有SEQID NO :1中第84-341位氨基酸序列的蛋白；(4)具有SEQID NO 1中第1-310位氨基酸序列的蛋白；(5)具有SEQID NO 1中第1-243位氨基酸序列的蛋白；(6)具有SEQID NO 1中第1-153位及第196-341位氨基酸序列的蛋白；(7)具有SEQID NO 2中第135-419位氨基酸序列的蛋白；或(8)具有SEQID NO 2中第135-430位氨基酸序列的蛋白。
11.一种筛选调控PFTAIRE蛋白激酶1的亚细胞定位或活性的潜在物质的方法，其特征 在于，所述方法包括(a)在测试组中，向细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1相互作用的反应体系中添加 待筛选的候选物，并检测细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1相互作用情况；并且，在对 照组中，在不添加所述候选物的、细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1相互作用的反应体 系中，检测细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用情况；(b)将步骤(a)测试组中细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用情况与对 照组中细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用情况进行比较，如果测试组中细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用在统计学上强于对照 组，就表明该候选物是促进PFTAIRE蛋白激酶1定位于细胞膜上或增强PFTAIRE蛋白激酶 1的激酶活性的潜在物质；如果测试组中细胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作 用在统计学上弱于对照组，就表明该候选物是抑制PFTAIRE蛋白激酶1定位于细胞膜上或 降低PFTAIRE蛋白激酶1的激酶活性的潜在物质。
12.—种抑制细胞周期进程的制剂，所述制剂是干扰分子，其核苷酸序列如SEQ IDNO 3-7任一所示。
全文摘要
本发明涉及细胞周期因子Y及其用途。本发明首次确定了一个与细胞周期的调节相关的蛋白，即细胞周期因子Y(CCNY)。CCNY能与蛋白激酶家族成员PFTAIRE蛋白激酶1(PFTK1)相互作用，从而发挥调控PFTK1激酶活性或细胞定位的作用。
文档编号A61K48/00GK101920006SQ20101020870
公开日2010年12月22日 申请日期2010年6月13日 优先权日2009年6月16日
发明者姜梅, 李珊, 陈江野, 高衍昆 申请人:中国科学院上海生命科学研究院