斑节对虾细胞周期蛋白e基因序列及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列及其制备方法和用途，旨在提供一种斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列，该序列用于检测肿瘤是否扩散或者作为靶位点设计治疗肿瘤的药物或者调节斑节对虾卵巢发育过程，有利于人工催熟斑节对虾细胞；其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；制备方法通过提取斑节对虾总RNA，来cDNA第一链的合成，再以合成的第一链cDNA作为模板，利用cDNA末端快速扩增技术对目的基因的5ˊ和3ˊ末端进行PCR扩增；然后对斑节对虾细胞周期蛋白E基因的测定，最后以进行斑节对虾细胞周期蛋白E基因分布和表达测定；属于分子生物学中基因克隆领域。
【专利说明】斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种细胞周期蛋白E基因序列，具体地说，是涉及一种斑节对虾细胞 周期蛋白E基因序列，本发明还涉及该斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，属于 分子生物学中基因克隆领域。
【背景技术】
[0002] 细胞周期蛋白E是细胞周期调控过程中一个非常重要的蛋白，主要在细胞G1期与 CDK7结合并起作用，周期蛋白E属于G1期的正调节因子，主要对G1期到S期的过渡进行调 控，与同作为G1/S转换点功能调控的因子CyclinD、抑癌基因视网膜神经胶质细胞瘤蛋白 (retinob lastoma protein，Rb)、转录因子 E2F、抑癌基因 p53、KIP 家族、CDK2、4、5 等相互 作用共同决定细胞周期的正常进行。周期蛋白E在进入S期后便立即被泛素化降解。
[0003] 目前发现的Cyclin家族成员可分为10大类：A?J，包括亚型共15种，其中周期 蛋白E是参与细胞周期G1/S期转换的重要正性调节因子且在人的研究中最为广泛，大多集 中于周期蛋白E对肿瘤治疗方面。近些年来，各国对肿瘤的研究逐渐集中在细胞周期调控 方面，而周期蛋白E与CDK2结合后的复合物在周期调控方面起着举足轻重的作用，特别是 其涉及的G1期磷酸化作用，更是当前的研究热点。
[0004] 随着基因克隆技术的发展，目前周期蛋白E基因在很多物种中相继被克隆出来， 如 Homo sapiens :人（AAM54043. 1) ;Danio rerio:斑马鱼（ΝΡ_001002075· 1) ;Megachile rotundata :切叶蜂（ΧΡ_003700054· 1) ;Carassius auratus:鲫鱼（BAA85846. 1)等，但在对 虾中研究较少。
[0005] 目前斑节对虾的养殖过程存在雌性对虾性腺发育不同步，且人工催熟效果差的问 题，而细胞周期调控的研究对探讨卵巢发育机理即雌虾性成熟问题具有相当重要的意义， 所以，期望通过对周期蛋白E的研究为发现新的催熟方法提供一定的理论支持。
【发明内容】
[0006] 针对上述问题，本发明的以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设计的PCR 扩增引物，并通过RACE技术克隆到斑节对虾细胞周期蛋白E基因的全表达序列，有利于人 工催熟斑节对虾。
[0007] 为解决前一技术问题，本发明提供的第一个技术方案是这样的：该斑节对虾细胞 周期蛋白E基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0008] 本发明提供的后一技术方案是这样的：该斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制 备方法，依次包括下述方法 ：
[0009] 1)总RNA的提取
[0010] 对斑节对虾解剖并取出性腺混合液，将性腺混合液于Trizol中匀浆，提取斑节对 虾总RNA并用DEPC水悬浮，保存；
[0011] 2)cDNA第一链的合成
[0012] 将步骤1)中的斑节对奸性腺总RNA与反转录引物混合，在反转录酶的作用下合成 cDNA第一链；
[0013] 3)斑节对虾细胞周期蛋白E基因的PCR扩增、克隆
[0014] 以步骤1)中合成的第一链cDNA作为模板，利用cDNA末端快速扩增法对目的基因 的5 z和:T末端进行PCR扩增；
[0015] 其中：
[0016] 在:T RACE中，利用降落PCR方法，用接头引物和cycE-Fl、cycE-F2进行PCR扩 增；
[0017] 在5 z RACE中，首先利用末端转移酶在cDNA末端加上polyC尾巴后，以加尾的 cDNA为模板，以cycE-Rl和oligo-dG为引物进行一次PCR，所得PCR产物取用cycE-R2和 oligo-dG进行二次PCR扩增；
[0018] 4)对斑节对虾细胞周期蛋白E基因的测定
[0019] 所得到的PCR产物在分离检测后，再将PCR产物纯化，克隆到pMD-18T载体中，转 化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，挑取阳性克隆，测序；
[0020] 5)斑节对奸细胞周期蛋白E的分布和表达
[0021] a)提取斑节对奸不同组织的RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit操作手册 进行反转录为cDNA模板；将不同组织样品cDNA稀释作为模板，采用SYBR Green I染料法， 在Eppendorf荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析；
[0022] b)依照 TaKaRa SYBR? PrimeScriptTM RTPCR Kit 试剂盒说明书进行 PCR 反应， 再采用相对ACT法分析Pmcyclin E基因在各样品中的相对表达量；
[0023] c)分别提取实验室保存的经过MIH处理及眼柄切除手术的卵巢RNA，然后按照上 述a)所示方法进行反转录及荧光定量。
[0024] 进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，步骤2)所述的 反转录引物反转录引物的序列为：5>GGCCACGCGACTAGTAC(T) 16〈3。
[0025] 进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，步骤2)所述的 反转录酶为M-MLV。
[0026] 进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，步骤2)所述的 接头引物的序列为：5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC〈3。
[0027] 进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，步骤2)所述的 反应条件：42°C 60min，70°C 15min。
[0028] 进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，步骤3)所述的
[0029] cycE-Fl ：5>ACGCCAACCTGACTACCT<3 ；
[0030] cycE-F2 ：5>CTACAGACTACATAGACCGCTAC<3 ；
[0031] cycE-Rl ：5>CTGGTGGACTCGGGTGTTGG<3 ；
[0032] cycE-R2 :5>CTGAATTTGTGCCATGTTTC〈3。
[0033] 进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，步骤3)所述的 3 ' RACE 中反应条件：94°C，5min ;94°C，45s ;6(TC，30s ;72°C，45s ;35cycles ;72°C，10min。
[0034] 进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，步骤3)所述 的在 5 z RACE 中反应条件：94°C，5min ;94°C，45s ;61°C，30s ;72°C，45s ;35cycles ;72°C， 10min〇
[0035] 进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，步骤b)中PCR 反应使用引物为：
[0036] cyclinE-FFl ：5>AAAACCGATGAGAAGACT<3 ；
[0037] cyclinE-FF2 ：5>TCCTACAGAAGACACCCT<3 ；
[0038] RTEF-F ：5>AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT<3 ；
[0039] RTEF-R :5>CGTGGTGCATCTCCACAGACT〈3。
[0040] 该斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列用于检测肿瘤是否扩散或者作为设计治疗 肿瘤药物的靶位点或者调节斑节对虾卵巢发育过程。
[0041] 与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下优点：
[0042] 本发明的是以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设计的PCR扩增引物，并 通过RACE技术克隆到斑节对虾细胞周期蛋白E基因的全表达序列；此外通过斑节对虾细胞 周期蛋白E基因设计荧光定量PCR引物，对周期蛋白E基因在斑节对虾卵巢各个发育时相 的分布情况及在经过MIH注射或眼柄切除手术的卵巢组织中的分布情况进行研究分析。不 仅为研究斑节对虾细胞周期蛋白E在卵巢发育中的作用奠定基础，而且可以为斑节对虾养 殖过程中所出现的性腺发育参差不齐的情况从分子层面提供理论基础，并且对斑节对虾卵 巢发育过程中起重要作用，有利于人工催熟斑节对虾，节约培养成本。
[0043] 细胞周期蛋白E作为细胞周期调控中一个重要的蛋白，在细胞分裂、细胞周期调 控、肿瘤发生等方面起重要作用，可以作为肿瘤是否扩散的重要检测指标，可以作为靶位点 来设计治疗肿瘤的药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0044] 图1是斑节对虾周期蛋白E基因 mRNA组织表达模式；
[0045] 垂直线表示平均值土标准误差（重复样品数=4)，不同的字母表示存在显著性差 异（Ρ〈0· 05)。
[0046] 图2是细胞eye 1 in Ε分别在经过ΜΙΗ注射、眼柄切除的斑节对虾卵巢中的表达情 况；垂直线表示平均值土标准误差（重重复样品数=3)。
【具体实施方式】
[0047] 为了更好的理解、实施本发明的权利要求，下面结合具体实施例，对本发明的权利 要求做进一步的详细说明，但本发明并不限于下述实施例，而是以权利要求为限。
[0048] 1、总RNA的提取
[0049] 试验所用的雌雄斑节对虾（鲜重200g左右）均取自于海南三亚，室内水族箱内 暂养三天，水温控制在24?25°C之间。取所需性腺组织约50mg用剪刀剪碎加入lml的 Trizol (美国invitrogen公司）进行勻楽，按Trizol试剂盒使用手册提取斑节对奸总RNA 并用DEPC水悬浮，电泳观察所提取RNA的完整性，并置于-80°C保存。
[0050] 总RNA具体提取步骤：
[0051] (1)加 200yL 预冷氯仿，涡旋振荡 lmin 混匀，静置 5min，12000g，4°C，15min。
[0052] (2)取三分之一上清溶液，加入等体积的预冷的异丙醇，颠倒混匀，冰上放置 lOmin，12000g，4°C，lOmin。
[0053] (3)倒掉上清，加 lmL75%乙醇重悬沉淀，7500g，4°C离心5min。
[0054] (4)重复步骤3 -次，并用枪头吸出上清，干燥5?lOmin
[0055] (5)加 40 μ LddH20 溶解沉淀
[0056] (6) RNA的电泳检测：将电泳槽、梳齿等置于3% H202过夜浸泡，配置1. 5%的琼脂 糖凝胶（用〇. 5 X TBE溶液配制），取5 μ L总RNA加1 μ L上样缓冲液，进行30min电泳检 测，对提取的RNA质量进行测定。
[0057] 2、cDNA第一链的合成
[0058] 取步骤1中斑节对虾性腺总RNA与反转录引物（5>GGCCACGCGACTAGTAC(T) 16〈3) (10pmol/L)混合在反转录酶（M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA -链。
[0059] cDNA的反转录实验按照相关试剂盒（PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa))操作方法进行，具体如下：
【权利要求】
1. 一种斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 制备权利要求1所述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的方法，其特征在于，依次 包括下述方法： 1) 总RNA的提取 对斑节对虾解剖并取出性腺混合液，将性腺混合液于Trizol中匀浆，提取斑节对虾总 RNA并用DEPC水悬浮，保存； 2. cDNA第一链的合成 将步骤1)中的斑节对奸性腺总RNA与反转录引物混合，在反转录酶的作用下合成cDNA 第一链； 3) 斑节对虾细胞周期蛋白E基因的PCR扩增、克隆 以步骤1)中合成的第一链cDNA作为模板，利用cDNA末端快速扩增法对目的基因的 5 z和:T末端进行PCR扩增； 其中： 在:T RACE中，利用降落PCR方法，用接头引物和cycE-Fl、cycE-F2进行PCR扩增； 在5 z RACE中，首先利用末端转移酶在cDNA末端加上polyC尾巴后，以加尾的cDNA为 模板，以cycE-Rl和oligo-dG为引物进行一次PCR，所得PCR产物取用cycE-R2和oligo-dG 进行二次PCR扩增； 4) 对斑节对虾细胞周期蛋白E基因的测定 所得到的PCR产物在分离检测后，再将PCR产物纯化，克隆到pMD-18T载体中，转化大 肠杆菌DH5ci感受态细胞，挑取阳性克隆，测序； 5) 斑节对虾细胞周期蛋白E的分布和表达 a)提取斑节对奸不同组织的RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit操作手册进行 反转录为cDNA模板；将不同组织样品cDNA稀释作为模板，采用SYBR Green I染料法，在 Eppendorf荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析； 用相对ACT法分析Pmcyclin E基因在各样品中的相对表达量； c)分别提取实验室保存的经过MIH处理及眼柄切除手术的卵巢RNA，然后按照上述a) 所示方法进行反转录及突光定量。
3. 根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，其特征在于， 步骤2)所述的反转录引物的序列为：5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16〈3。
4. 根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，其特征在于， 步骤2)所述的反转录酶为M-MLV。
5. 根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，其特征在于， 步骤2)所述的反应条件：42°C 60min，70°C 15min。
6. 根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，其特征在于， 步骤 3)所述的 cycE-Fl :5>ACGCCAACCTGACTACCT〈3 ; cycE-F2 ：5>CTACAGACTACATAGACCGCTAC<3 ； cycE-Rl ：5>CTGGTGGACTCGGGTGTTGG<3 ； cycE-R2 :5>CTGAATTTGTGCCATGTTTC〈3。
7. 根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，其特征 在于，步骤 3)所述的 3 z RACE 中反应条件：94°C，5min ;94°C，45s ;60°C，30s ;72°C，45s ; 35cycles ;72°C,10min〇
8. 根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，其特征在 于，步骤 3)所述的在 5 z RACE 中反应条件：94°C，5min ;94°C，45s ;61°C，30s ;72°C，45s ; 35cycles ;72°C,10min〇
9. 根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列的制备方法，其特征在于， 步骤b)中PCR反应使用引物： cyclinE-FFl ：5>AAAACCGATGAGAAGACT<3 ； cyclinE-FF2 ：5>TCCTACAGAAGACACCCT<3 ； RTEF-F ：5>AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT<3 ； RTEF-R :5>CGTGGTGCATCTCCACAGACT〈3。
10. 权利要求1所述的斑节对虾细胞周期蛋白E基因序列用于检测肿瘤是否扩散或者 作为设计治疗肿瘤药物的靶位点或者调节斑节对虾卵巢发育过程。
【文档编号】C12Q1/68GK104099340SQ201410367585
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年5月20日
【发明者】赵超, 邱丽华, 江世贵, 周发林, 傅明骏 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所