斑节对虾细胞周期蛋白h基因序列及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列及其制备方法和用途，旨在提供斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列，可以作为设计抗肿瘤药物的靶位点或者调节斑节对虾卵巢发育过程，有利于人工繁殖斑节对虾细胞；该H基因序列的核苷酸如SEQ?ID?NO：1所示；制备方法是通过提取斑节对虾总RNA来cDNA第一链的合成，再以合成的第一链cDNA作为模板，利用降落PCR法，用接头引物和cycH-F1、cycH-F2对目的基因的3ˊ末端进行两次PCR扩增；然后对斑节对虾细胞周期蛋白H基因的测定，最后进行对斑节对虾细胞周期蛋白H基因分布和表达测定；属于分子生物学中基因克隆领域。
【专利说明】斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种细胞周期蛋白Η基因序列，具体地说，是涉及一种斑节对虾细胞 周期蛋白Η基因序列，本发明还涉及该斑斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列的制备方法，属 于分子生物学中基因克隆领域。
【背景技术】
[0002] 细胞周期调控是一个精确调控的过程。在细胞分裂过程中真核生物的细胞周期可 以概括为两个大的阶段：细胞分裂间期（即G1时期、S时期和G2时期）和细胞分裂期（即 Μ时期），在细胞分裂时期，需要许多周期蛋白参与调控以保证其精确性。
[0003] 周期蛋白Η基因做为CAK的重要组成部分，从酵母到人类具有高度的保守型。CAK 的激活需要周期蛋白Η基因与CDK7及ΜΑΤΙ结合，通过对CAK的磷酸化来实现其激酶活性。 周期蛋白Η基因也参与通用转录复合物TFIIH的构成。TFIIH是一个多蛋白复合物，在转 录、DNA修复及细胞周期调控中起重要作用。与其他周期蛋白相比周期蛋白Η基因在整个 细胞周期中表达量稳定，所有周期时相均有表达。另有证据表明CDK2、CDK4及CDK6等的磷 酸化都与周期蛋白Η基因密切相关，周期蛋白Η基因通过对这些底物的磷酸化从而实现对 细胞周期的准确调控，进而可以实现对卵巢发育的调控。
[0004] 长期以来，斑节对虾的人工繁育问题一直都是限制斑节对虾养殖产业发展的技术 瓶颈。在实际生产过程中，亲虾的性腺成熟参差不齐，难以集中育苗的问题是对虾养殖过程 中一个非常重要的限制因素。眼柄切除手术作为促进亲虾性腺同步成熟的常用方法，对亲 虾本身存在非常大破坏性，不利于可持续养殖，加大了养殖成本。因此出于寻求一种新的对 虾繁育方法的需求，对对虾卵巢发育机理及其分子调控机理进行研究势在必行。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，本发明的以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设计的PCR 扩增引物，并通过RACE技术克隆到斑节对虾细胞周期蛋白Η基因的全表达序列，有利于人 工催熟斑节对虾。
[0006] 为解决前一技术问题，本发明提供的第一个技术方案是这样的：该斑节对虾细胞 周期蛋白Η基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0 :1所示。
[0007] 本发明提供的后一技术方案是这样的：该斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列的制 备方法，依次包括下述方法 ：
[0008] 1)总RNA的提取
[0009] 对斑节对虾解剖并取出肌肉、卵巢、肝胰腺、脑、心脏、肠、精巢、胃组织，并分别将 各组织溶于Trizol中匀浆，提取斑节对虾总RNA并用DEPC水悬浮，保存；
[0010] 2)cDNA第一链的合成
[0011] 将步骤1)中的斑节对奸总RNA与反转录引物混合，在反转录酶的作用下合成cDNA 第一链；
[0012] 3)斑节对虾细胞周期蛋白Η基因的PCR扩增、克隆
[0013] 以步骤2)合成的第一链cDNA作为模板利用降落PCR法，用接头引物和cycH-Fl、 cycH-F2对目的基因的：Τ末端进行两次PCR扩增得PCR产物；
[0014] 4)对斑节对虾细胞周期蛋白Η基因的测定
[0015] 对步骤3)所得到的PCR产物分离检测、纯化后，再将PCR产物克隆到pMD-18T载 体中，转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，挑取阳性克隆，测序；
[0016] 5)斑节对虾细胞周期蛋白Η基因的分布和表达
[0017] a)提取斑节对虾不同组织以及不同发育时期的卵巢的总RNA，按照 PremeScriptTM RT reagent Kit操作手册进行反转录为cDNA模板；将不同组织样品cDNA 稀释作为模板，采用SYBR Green I染料法，在Eppendorf?荧光定量PCR仪上进行扩增和数 据分析；
[0018] b)依照 TaKaRa SYBR? PrimeScriptTM RTPCR Kit 试剂盒说明书进行 PCR 反应， 实验数据采用相对Λστ法分析斑节对虾细胞周期蛋白Η基因在各样品中的相对表达量。
[0019] 进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列的制备方法，步骤2)所述的 反转录引物反转录引物为：5>GGCCACGCGACTAGTAC(T) 16〈3。
[0020] 进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列的制备方法，其特征在于，步 骤2)所述的反转录酶为M-MLV。
[0021] 进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列的制备方法，步骤2)所述的 反应条件：42°C 60min，70°C 15min。
[0022] 进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列的制备方法，步骤3)所述的 接头引物为：5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC〈3。
[0023] 进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列的制备方法，步骤3)所述的
[0024] cycH-Fl ：5>AACCATTCCGCCCAGTAGAAG<3 ；
[0025] cycH-F2 :5>AACCTCCTGCCTCGGACACT〈3。
[0026] 进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列的制备方法，步骤3)中两次 扩增的所述反应条件均为：94°C，5min ;94°C，30s ;55°C，45s，35cycles ;72°C，60s ;72°C， 10min〇
[0027] 进一步的，上述的斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列的制备方法，步骤b)中PCR 反应使用引物步骤b)中PCR反应使用引物为：
[0028] RTCYCH-F ：5>CGTGAGATTGAAGGCAAGTTAGA<3 ；
[0029] RTCYCH-R :5>GCTTCCCCAATGCAGGAA〈3。
[0030] 该斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列作为设计抗肿瘤药物的靶位点或者调节斑 节对虾卵巢发育过。
[0031] 与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下优点：
[0032] 1、本发明提供的技术方案是以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设计的 PCR扩增引物，并通过RACE技术克隆到斑节对虾细胞周期蛋白Η基因的全表达序列；此外 通过斑节对虾细胞周期蛋白Η基因设计荧光定量PCR引物，对周期蛋白Η基因在斑节对虾 卵巢各个发育时相的分布情况及在不同组织中的分布情况进行研究分析，更好的了解生物 体细胞中的信号通路的机制。不仅为研究斑节对虾细胞周期蛋白Η基因在卵巢发育中的作 用奠定基础，而且可以为斑节对虾养殖过程中所出现的性腺发育参差不齐的情况从分子层 面提供理论基础；有利于人工繁育斑节对虾，并且减小了养殖成本。
[0033] 2、本发明提供的细胞周期蛋白Η作为细胞周期调控中一个重要的蛋白，在细胞分 裂、细胞周期调控、肿瘤发生、DNA的转录修复等方面起重要作用，也是对相关方向进行研究 的一个重要突破点，可以用来作为抗肿瘤药物设计的靶位点，在斑节对虾卵巢发育过程中 起重要作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1是斑节对虾细胞周期蛋白Η基因 mRNA组织表达模式；
[0035] 其中：垂直线表示平均值土标准误差（重重复样品数=4)，不同的字母表示存在 显著性差异（P〈〇. 05)。
[0036] 图2是斑节对虾细胞周期蛋白Η基因 mRNA卵巢发育六期表达模式；
[0037] 其中：垂直线表示平均值土标准误差（重重复样品数=4)。不同的字母表示存 在显著性差异（P〈〇. 05)。
【具体实施方式】
[0038] 为了更好的理解、实施本发明的权利要求，下面结合具体实施例，对本发明的权利 要求做进一步的详细说明，但本发明并不限于下述实施例，而是以权利要求为限。
[0039] 1、总RNA的提取
[0040] 试验所用的雌雄斑节对虾（鲜重200g左右）均取自于海南三亚，室内水族箱内暂 养三天，水温控制在24?25°C之间。解剖，取肌肉、卵巢、肝胰腺、脑、心脏、肠、精巢、胃等组 织，并分别将组织于lmL Trizol(Invitrogen，日本）中勻楽，按Trizol试剂盒使用手册提 取斑节对虾总RNA并用DEPC水悬浮，电泳观察所提取RNA的完整性，并置于-80°C保存。
[0041] 1、总RNA具体提取步骤：
[0042] (1)加 200 μ L 预冷氯仿，涡旋振荡 lmin 混勻，静置 5min，12000g，4°C，15min。
[0043] (2)取三分之一上清溶液，加入等体积的预冷的异丙醇，颠倒混匀，冰上放置 lOmin，12000g，4°C，lOmin。
[0044] (3)倒掉上清，加 lmL75%乙醇重悬沉淀，7500g，4°C离心5min。
[0045] (4)重复步骤3 -次，并用枪头吸出上清，干燥5?lOmin
[0046] (5)加 40 μ LddH20 溶解沉淀
[0047] (6) RNA的电泳检测：将电泳槽、梳齿等置于3% H202过夜浸泡，配置1. 5%的琼脂 糖凝胶（用〇. 5 X TBE溶液配制），取5 μ L总RNA加1 μ L上样缓冲液，进行30min电泳检 测，对提取的RNA质量进行测定。
[0048] 2、cDNA第一链的合成
[0049] 取步骤1中斑节对虾总RNA与反转录引物（5>GGCCACGCGACTAGTAC (T) 16〈3) (10pmol/L)混合在反转录酶（M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA-链，
[0050] cDNA的反转录实验按照相关试剂盒（PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa))操作方法进行。
[0051]
【权利要求】
1. 一种斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 制备权利要求1所述的斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列的方法，其特征在于，依次 包括下述方法： 1) 总RNA的提取 对斑节对虾解剖并取出肌肉、卵巢、肝胰腺、脑、心脏、肠、精巢、胃组织，并分别将各组 织溶于Trizol中匀浆，提取斑节对虾总RNA并用DEPC水悬浮，保存； 2. cDNA第一链的合成 将步骤1)中的斑节对奸总RNA与反转录引物混合，在反转录酶的作用下合成cDNA第 一链； 3) 斑节对虾细胞周期蛋白Η基因的PCR扩增、克隆 以步骤2)合成的第一链cDNA作为模板利用降落PCR法，用接头引物和cycH-F 1、 cycH-F2对目的基因的：Τ末端进行两次PCR扩增得PCR产物； 4) 对斑节对虾细胞周期蛋白Η基因的测定 对步骤3)所得到的PCR产物分离检测、纯化后，再将PCR产物克隆到pMD-18T载体中， 转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，挑取阳性克隆，测序； 5) 斑节对虾细胞周期蛋白Η基因的分布和表达 a) 提取斑节对奸不同组织以及不同发育时期的卵巢的总RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit操作手册进行反转录为cDNA模板；将不同组织样品cDNA稀释作为模板，采用 SYBR Green I染料法，在Eppendorf荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析； b) 依照TaKaRaSYBR? PrimeScriptTM RTPCR Kit试剂盒说明书进行PCR反应，实验 数据采用相对△CT法分析斑节对虾细胞周期蛋白Η基因在各样品中的相对表达量。
3. 根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列的制备方法，其特征在于， 步骤2)所述的反转录引物为：5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16〈3。
4. 根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列的制备方法，其特征在于， 步骤2)所述的反转录酶为M-MLV。
5. 根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列的制备方法，其特征在于， 步骤2)所述的反应条件：42°C 60min，70°C 15min。
6. 根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列的制备方法，其特征在于， 步骤3)所述的接头引物为：5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC〈3。
7. 根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列的制备方法，其特征在于， 步骤 3)所述的 cycH-Fl 为：5>AACCATTCCGCCCAGTAGAAG〈3 ; cycH-F2 为：5>AACCTCCTGCCTCGGACACT〈3。
8. 根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列的制备方法，其特征在 于，步骤3)中两次扩增所述的反应条件均为：94°C，5min ;94°C，30s ;55°C，45s，35cycles ; 72°C，60s ;72°C，lOmin。
9. 根据权利要求2所述的斑节对虾细胞周期蛋白H基因序列的制备方法，其特征在于， 步骤b)中PCR反应使用引物为： RTCYCH-F ：5>CGTGAGATTGAAGGCAAGTTAGA<3 ； RTCYCH-R : 5>GCTTCCCCAATGCAGGAA〈3。
10.权利要求1所述的斑节对虾细胞周期蛋白Η基因序列作为设计抗肿瘤药物的靶位 点或者调节斑节对虾卵巢发育过程。
【文档编号】C12N15/70GK104099339SQ201410366921
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年5月20日
【发明者】赵超, 邱丽华, 江世贵, 周发林, 傅明骏 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所