调控马铃薯低温糖化的多核苷酸序列及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种调控马铃薯低温糖化的多核苷酸序列及其应用。该多核苷酸如序列表中SEQ?ID?NO:1所示。本发明通过StBAM1、StBAM9基因获得所述多核苷酸序列后，在马铃薯中同时干涉StBAM1和StBAM9两个基因，可极显著降低还原糖的含量，提高马铃薯抗低温糖化的能力，远超过StAmy23、StBAM1、StBAM9单独在低温糖化中的功能。
【专利说明】调控马铃薯低温糖化的多核苷酸序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程【技术领域】，具体涉及一种调控马铃薯低温糖化的多核苷 酸序列，及其在提高马铃薯块茎抗低温糖化能力、优良加工品种选育方面的应用。
【背景技术】
[0002] 马铃薯iMerios-- L.)是继水稻、小麦和玉米之后的世界第四大粮食作 物，同时也是蔬菜、饲料和工业原料作物，在世界上多个国家和地区广泛分布种植。随着我 国经济发展和产业结构调整，马铃薯用作粮食的比例正逐步减少，而作为快餐食品、加工制 品的比例大量增加。
[0003] 用于加工的马铃薯块茎，除要求具有普通马铃薯对于营养丰富、产量高、抗病、抗 逆、成熟期适中等要求外，更重要的具有干物质含量高、还原糖含量低和抗低温糖化等特点 (张永成&阮建平，2005)。其中，块茎还原糖含量和抗低温糖化的水平，将在很大程度上决定 加工品质(屈冬玉等，2001)。因为在加工过程中，块茎内的还原糖与氮化合物的α-氨基酸 进行"Maillard Reaction"致使薯片或薯条表面颜色加深，味道变苦，并且此反应中产生的 丙烯酰胺具有潜在的神经毒性，危害消费者健康，严重影响加工品质(成善汉等，2006)。马 铃薯加工业中，为延长加工时间，减少因贮藏期间块茎失水皱缩、腐烂、发芽等造成的原料 损失，消除为抑制病虫害施用化学药剂而带来的健康问题和环境危害，通常采用低温条件 来贮藏收获后的马铃薯块茎。但这导致了马铃薯块茎中还原糖的积累，即所谓的低温糖化， 这正是多种品种不适合加工的主要原因。
[0004] 现有研究表明，参与马铃薯块茎低温糖化的途径主要是蔗糖降解、糖酵解、淀粉 降解，这些途径涉及到的关键酶的作用将直接影响块茎淀粉合成和糖的积累（Malone等， 2006)。其中淀粉降解是低温下还原糖积累的一种重要途径，淀粉降解包括淀粉水解和磷酸 解，磷酸解是在淀粉颗粒结合蛋白R1、淀粉磷酸合酶（STP)等作用下进行的，而淀粉水解主 要是通过淀粉酶（α-淀粉酶、β-淀粉酶)的作用进行。Fulton等（2008)研究发现拟南芥基 因组中共有9个β -淀粉酶基因(似#7-似#幻，原核表达定位于叶绿体的BAM1、BAM2、BAM3 和ΒΑΜ4蛋白，ΒΑΜ1、ΒΑΜ2和ΒΑΜ3有β -淀粉酶活性而ΒΑΜ4没有，并通过一系列突变体材料 证明β-淀粉酶对其叶片淀粉降解有较大作用。研究发现块茎在低温贮藏条件下，贮藏前 几周α-淀粉酶、β-淀粉酶活性急剧上升，同时还原糖含量大幅上升（Cottrell et al.， 1993)，暗示了贮藏块茎淀粉降解主要是由淀粉酶的水解作用来完成。Cochrane等（1991) 通过分析4°C和10°C储藏不同时间的四个马铃薯栽培种（RecorcUWil ja、Pentland Dell和 Brodick)的淀粉酶活、糖含量，发现低温下淀粉酶活性与还原糖积累非常相关。Scheidig 等（2002)通过反义RNA干扰马铃薯叶片叶绿体定位的β -淀粉酶基因表达，导 致转基因株系叶片淀粉酶活降低，淀粉积累。Bagnaresi等（2008)通过番爺GeneChip分离 出一些马铃薯块茎低温贮藏差异表达基因，其中有两个是β -淀粉酶(沒#77和沒#77 )，具有 明显的低温诱导特性。拟南芥基因组中编码3个α -淀粉酶（AMYUAMY2和ΑΜΥ3)，Zeeman 等（2007)发现叶绿体定位的AMY3有淀粉酶活性。当通过T-DNA插入分别突变和同时突变 这3个基因，突变体与野生型叶片淀粉降解速度相同（Yu et al 2005)，对其淀粉降解无显 著作用，可能是体内别的蛋白对其功能有补偿作用。Zhang等（2002)研究发现甘薯收获后 在20°C储藏的前60 d淀粉含量的降低与α-淀粉酶活性成正比，说明α-淀粉酶与淀粉降 解相关。拟南芥突变体sex4叶绿体中α-淀粉酶活性降低，夜间淀粉降解速度减慢，叶片 淀粉积累，表明 α-淀粉酶活性影响淀粉降解（Zeeman et al 1998 ;Zeeman and ap Rees 1999)。Gausing等（1990)申请了 a-淀粉酶基因专利（PCT/DK1990/000108)，通过遗传 转化马铃薯，反义抑制淡表达，8°C低温处理的转基因株系块茎淀粉降解受到抑 制，还原糖含量下降；超量表达增加了淀粉降解，还原糖含量升高，初步显示 可调节块茎低温糖化。
[0005] 马铃薯基因组中含有如下7个β -淀粉酶基因：泣似#7、泣似#￥、 泣似#5、泣似#6、泣似#7 (若按与拟南芥9个β -淀粉酶基因同源程度命名的话，则对应命 名％ StBAMl、StBAM3、StBAM4、StBAM5、StBAM7、StBAM8、StBAM9)琳 a -淀犧基里 StAmyl、 汾^野(Zhang et al 2014)。目前，关于泣似#7-泣似挪在马铃薯块茎低温糖化代谢过 程中的作用并无相关文献报道。
[0006]
【发明内容】
[0007] 本发明利用马铃薯基因组数据库中公布的相应序列设计引物，以野生种马铃 薯5：知riAaWiiicDNA为模板，克隆了泣似#7、泣似J份基因，并构建同时干涉泣似#7和 的双干涉载体，遗传转化马铃薯进行转基因功能验证，发现双干涉转基因株系可提 高马铃薯块茎抗低温糖化的能力，效果显著优于单独干涉汾也?Jd泣似#八泣似i份的转基 因株系。
[0008] 鉴于此，本发明的目的在于提供一种调控马铃薯低温糖化的多核苷酸序列及其应 用。
[0009] 为了实现上述目的，本发明创造性地选择基因编码区751-989bp (239bp) 和泣似J份基因编码区976-1193bp (218bp)为双干涉片段区域，基于Gateway和重叠 PCR原理，分别设计各自干涉区域片段扩增引物，分别以质粒pMD-泣似#7、pMD-泣似J份为 模板，扩增泣似#7干涉片段区域751-989bp T1T2和泣似J份干涉片段区域976-1193bp T3T4,回收相应目的片段，再将两种回收产物混合，并以此混合物为模板，BlB9-Tl-attBl、 BlB9-T4-attB2为引物进行重叠PCR，将两个片段拼接一起，得到一个457bp的多核苷酸序 列。采用该多核苷酸序列构建载体、转化，所得马铃薯转基因株的马铃薯块茎抗低温糖化能 力得到了显著的提升。
[0010] 因此，本发明第一个方面提供了一种多核苷酸序列，它的多核苷酸如序列表中SEQ ID NO: 1 所示。 toon] 本发明的第二个方面提供了分别包含上述多核苷酸序列的表达载体；其中优选的 表达载体是pHellsgate8载体。
[0012] 本发明的第三个方面提供了分别包含上述表达载体的细胞；其中优选的细胞是大 肠杆菌DH5a或农杆菌LBA4404。
[0013] 本发明通过试验研究发现，同时干涉泣似#2、份这两个基因的双干涉转基因 株系中，还原糖含量极显著降低，效果明显优于汾也?jd泣似#2、泣似J份单独在低温糖化 中的功能，极大的提高了马铃薯抗低温糖化的能力，并改善了加工品质。因此，本发明的第 四个方面提供了上述多核苷酸序列或似挪基因的工业应用。即：上述的多核苷 酸序列SEQ ID NO: 1在马铃薯抗低温糖化中的应用。或者：泣似#7联用泣似J份在马铃薯 抗低温糖化中的应用。
[0014] 与现有技术相比，本发明人通过泣似#2、泣似J份基因获得所述多核苷酸序列后， 在马铃薯中同时干涉和份两个基因，可极显著降低还原糖的含量，提高马铃薯 抗低温糖化的能力，远超过StAmy23、StMMl、5?似单独在低温糖化中的功能。
[0015]
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1 :泣似泣似#7基因编码区扩增结果图，其中，泳道1: Trans2K plus，泳道 2_. StBAM9，m StBAMl。
[0017] 图2 :干涉载体RNAi-(泣似#7+泣似#没）结构图。
[0018] 图3 :转基因株系不同温度处理块茎炸片图片。
[0019] 图4 :转基因株系低温贮藏4°C、30d块茎炸片色泽指数。
[0020] 图5 :转基因株系低温贮藏4°C、30d块茎葡萄糖、果糖、还原糖、蔗糖含量。
[0021] 图6 :转基因株系低温贮藏4°C、30d块茎β -淀粉酶活性。
[0022] 图7 :转基因株系低温贮藏4°C、30d块茎淀粉含量。
【具体实施方式】
[0023] 以下结合具体实施例对本发明做出更详细的描述。根据以下的描述和这些实施 例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征。并且在不偏离本发明精神和范围的前提 下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。本发明通过在马铃薯 中同时干涉泣似被和泣似挪这两个基因，显著的提高了马铃薯块茎抗低温糖化的能力，效 果明显优于单独干涉汾卸成?、泣似i//、泣似i份的转基因株系。同时干涉泣似#7、泣似i份这 两个基因在抗低温糖化、油炸加工品质方面的应用均属于本发明的保护范围。
[0024] .汹盼基因的克隆与分析 本发明中的2个基因是根据马铃薯基因组数据库（Potato Genome Sequence Consortium)公布的序列 PGSC0003DMC400002800 (泣似#7)、PGSC0003DMC400018848 (泣似设计引物扩增基因全长序列，引物序列如下： StBAMlV (5f -ATGGCGATGAGTATGCCACAC-3,) StBAMIR (5f -TTAGTGCATGAGGGCCATTGC-3,) StBAM9F (5f -ATGGAGGTTTCAGTGATGGGAA-3,) StBAM9R (5f -CTAAGCTGCTTGCATCTGGAGATGA-3,) 由以上全长〇RF引物，通过PCR的方法，以野生种马铃薯5：知riAaWiiicDNA为模板， 扩增泣似#7、份编码区(见图1 )，胶回收相应目标片段做AT克隆连接至PMD18-T载体， 连接产物热击转化大肠杆菌DH5ci。阳性克隆提取质粒，酶切检测并测序验证序列，测序工 作由上海桑尼公司完成。
[0025] 基因全长开放阅读框为1740bp，编码579个氨基酸和一个终止密码子， 用Pfam程序分析，属于Glycosyl hydrolase family 14,与目前公布的拟南芥似#7序列 有76%同源性，属于一个新的与马铃薯块茎抗低温糖化性状相关的候选基因。泣似J份基因 全长开放阅读框为1605bp，编码534个氨基酸和一个终止密码子，用Pfam程序分析，属于 Glycosyl hydrolase family 14,与目前公布的拟南芥似挪有63%同源性，也属于一个新 的与马铃薯块茎抗低温糖化性状相关的候选基因。
[0026] 双干涉RNAi -(泣似#7+泣似#幻载体构建 选择泣似#7基因编码区751-989bp (239bp)和泣似J份基因编码区976-1193bp (218bp)为双干涉片段区域，基于Gateway和重叠 PCR原理，分别设计各自干涉区域片段扩 增引物，引物序列为： BlB9-Tl-attBl (5' -AAAAAGCAGGCTGTCCAATGCCATTCTGATTTC-3'）、 B1B9-T2 (5' - TAAGTCGTCTCCCAAGATCCCCCCATTCAGGCTTACCAA-3'）、B1B9-T3 (5' - GGTAAGCCTGAATGGGGGGATCTTGGGAGACGACTTATG-3'）、BlB9-T4-attB2 (5, -AGAA AGCTGGGTCCATCTCTGTTGGCTGTGTTAT -3'）， 分别以质粒pMD-泣似#7、pMD-泣似J份为模板，扩增泣似#7干涉片段区域751-989bp T1T2和泣似J份干涉片段区域976-1193bp T3T4,回收相应目的片段，再将两种回收产物混 合，并以此混合物为模板，BlB9-Tl-attBl、BlB9-T4-attB2为引物进行重叠 PCR，将两个片 段拼接一起（457bp，见序列表中的序列1)，胶回收目的片段产物。以此为模板，利用通用引 物： attBl (5' -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'）、 attB2 (5' -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'）， 进行第二轮PCR扩增，胶回收产物通过BP反应（目的片段1.4ul，ro〇NR221质粒lul， BP酶0. 6ul，25°C重组16h，加0. 3 ul蛋白酶K，37°C反应10 min)重组到pD0NR221载体，阳 性克隆PD0NR221- 似#7+泣似挪)通过LR反应(入门载体1. 2 μ L，phellsgate8 1. 2 μ L， LR 酶 0.6yL，25°C重组 16h，加 0.3 ul 蛋白酶 K，37°C反应 10 min。）重组到 pHellsgate8 载体，热击转化大肠杆菌DH5a，Xhol单酶切检测阳性克隆并测序验证。测序正确阳性克隆 电击转化农杆菌LBA4404, PCR检测为阳性的即为双干涉载体RNAi-(泣似#7+泣似J份）（见 图2)。保存阳性克隆，用于进一步的遗传转化。
[0027] 遗传转化 将RNAi-(泣似双干涉载体的农杆菌LBA4404接种于加50 mg/L Spe和 50 mg/L Rif的YEB培养基中，于28°C、200 r/min摇床上培养至0D6QQ为0. 5左右。4000 r/min离心6 min，其沉淀用3%MS液体培养基重新悬浮。将生长12-16周、直径0. 5 cm左 右的E3试管薯切成1-2 mm厚的薄片，在上述农杆菌菌液中浸泡12 min，每隔3 min摇一 次。浸染结束后取出薯片，用无菌滤纸吸干表面菌液。转入共培养培养基S1:3%MS+1 (mg/ L)IAA+0· 2 (mg/L)GA3+0. 5(mg/L)6-BA+2(mg/L)ZT 培养皿中，于 23°C 暗培养 2 d 后，转到 S2 培养基：S1+ 75 mg/L Kam+400 mg/L Cef中，置于光照强度2000 lux，光周期16 h/d，温度 23°C的条件下培养直到抗性芽再生。当抗性芽长达0.5-1 cm时，将其切下转入生根培养基 S3:3%MS+50 mg/L Kam+200 mg/L Cef筛选。对生根的芽进行DNA提取，35S通用引物PCR 检测转基因阳性植株。
[0028] 你心· - 6?似幻转基因功能鉴定 发明人将3个尺隱1-泣办?7^(12、15、18)干涉转基因株系、3个尺隱1-泣似#7(2、3、4) 干涉转基因株系、3个RNAi-Si^4i^(2、10、14)干涉转基因株系、3个 (10、11、18)双干涉转基因株系和对照(转基因所用的受体材料E3)同时种植在同一个温室 大棚中，相同的管理条件，每个株系种植16盆，植株长势良好，薯块成熟度高，转基因株系 在田间农业性状上与对照无显著差异。收获转基因株系块茎常温20°C避光保存7-10天 后，用来测定糖、淀粉等指标。用来测糖的块茎低温4°C避光处理10d、15d、30d，常温20°C 处理0d、30d，每个处理选取3个大小均匀（大于50g)的薯进行取样。测糖的每个薯纵切一 分为二，薯的一半用来炸片，炸片所用的工艺流程是：原料马铃薯--清洗--去皮--切 片--漂洗一一脱水--油炸(普通调和油，恒温170°C，3min)。薯的另一半用来测定基因 的表达量、还原糖含量、淀粉含量、淀粉酶活性等指标，每个时间点取3个生物学重复。
[0029] 首先对RNAi-汾^野么?、RNAi-泣似#7、RNAi-泣似和RNAi-(泣似#7+泣似#没）转 基因株系块茎4°C分别储藏0 d、10d、30d和20°C贮藏0d、30d后，进行了油炸加工品质、色 泽指数分析，直观的结果显示对照和转基因株系之间20°C贮藏0d、30d炸片色泽均无明显 差别，但是4°C贮藏下，各转基因株系的炸片色泽不等程度的浅于对照（图3)。由4°C 30d 的炸片图片初步可以看出RNAi-S^j^转基因株系块茎色泽与对照无差异，RNAi-S_#7 转基因株系块茎色泽也无显著改善，而RNAi-^i^J份和RNAi-转基因株 系块茎炸片色泽有一定改善，尤其是RNAi-(泣似#7+泣似#幻转基因株系与对照相比，炸片 色泽最浅(见图3)。而且炸片色泽指数分析结果显示，干涉转基因株系与对 照无差异，RNAi-泣似#7和RNAi-泣似J份转基因块茎与对照相比，色泽指数较低；而双干涉 RNAi-(泣似#7+泣似转基因株系炸片色泽指数显著低于对照(见图4)，直观上可看出同 时干涉了泣似#7和泣似J份后效果明显好于单独干涉、泣^^份的转基因株 系，在低温糖化中的功能优于汾卸7力、泣似#7、泣似i份。
[0030] 判断马铃薯块茎抗低温糖化能力的重要指标是还原糖的积累量， 申请人:对处理的 转基因株系和对照材料的块茎进行了葡萄糖、果糖、蔗糖含量的测定。干涉转 基因株系块茎4°C储藏30天时，葡萄糖、蔗糖含量与对照相比无显著差异，果糖含量稍有下 降(见图5);RNAi-^i^#7干涉转基因株系4°C储藏30天块茎葡萄糖、果糖、蔗糖含量与对照 相比显著降低，其中RNAi-^i^#7-3、4株系块茎葡萄糖含量比E3分别降低了 28%、27% (见 图5A)，果糖含量比E3降低了 29%、25% (见图5B) ;3个RNAi-Si^J份干涉转基因株系4°C 30d块茎葡萄糖、果糖含量也均小于对照E3，RNAi-^i^i^-2, 14株系达到了极显著水平，其 葡萄糖含量分别比E3降低了 44%、38%(见图5A)，果糖含量分别比E3降低了 40%、42%(见图 5B)，蔗糖含量无显著差异(见图5C);而3个双干涉RNAi-(泣似#7+泣似#幻转基因株系块 茎在4°C储藏30天的葡萄糖、果糖和蔗糖含量均显著低于对照E3,在葡萄糖、果糖含量上这 三个株系都达到极显著水平，还原糖含量显著下降，尤其是RNAi-(泣似#7+泣似#9) -11株 系葡萄糖含量比E3降低了 58% (见图5A)，果糖含量比E3降低了 48% (见图5B)，蔗糖含量 差异不太显著(见图5C)。从总的还原糖含量上看，双干涉RNAi-(泣似#7+泣似转基因 株系还原糖含量显著低于RNAi-^^T^、RNAi-^i^#7和干涉株系，3个双干 涉转基因株系都达到了极显著水平(见图5C)，表明了同时干涉和份后块茎还 原糖含量大幅度下降，对低温糖化的调节效果显著优于单独干涉似#7、5?似#没。
[0031] 发明人又对处理的转基因株系块茎进行了 β-淀粉酶活性和淀粉含量的测定， 淀粉酶活性用淀粉酶试剂盒(Megazyme，Ireland)测定，根据马铃薯块莖淀粉酶特性测定 方法有改动。淀粉含量通过 Amyloglucosidase (Roche 11202367001)测定（Hargreaves and ap Rees, 1988)。RNAi-泣似#7、RNAi-泣似#9、双干涉 RNAi-(泣似#7+泣似#9)转 基因株系块茎4°C处理30天后，其β -淀粉酶活性相比对照都有一定的下降，尤其是双 干涉RNAi-(泣似#7+泣似转基因株系β -淀粉酶活性不仅极显著低于对照，而且 相比于RNAi-泣似#7、RNAi-泣似J份转基因株系也显著降低（见图6)。对于淀粉含量， RNAi-SiAsjd RNAi-Si^4#7、RNAi-Si^^i^、双干涉 RNAi-(泣似#7+泣似#9)干涉转基因株 系4°C处理30天的块茎淀粉都有不同程度的积累，仅有双干涉RNAi-(泣似#7+泣似转基 因株系达到显著水平(见图7)。结果暗示了同时干涉这两个基因后，转基因株系块茎β-淀 粉酶活显著降低，淀粉积累，且酶活降低程度和淀粉积累程度都显著高于RNAi-泣办?jd?、 RNAi-^i^4#7和干涉转基因株系。
[0032] 现有的试验结果表明，同时干涉泣似#2、泣似J份这两基因后，马铃薯块茎还原糖 含量大幅度下降，对低温糖化的调节效果显著优于单独干涉似#7、5?似#9,是在 马铃薯块茎抗低温糖化上很具潜力的功能基因。
【权利要求】
1. 调控马铃薯低温糖化的多核苷酸序列，该序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
2. 包含权利要求1所述多核苷酸序列的表达载体。
3. 根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于：它是pHellsgate8载体。
4. 包含权利要求2或3所述表达载体的细胞。
5. 根据权利要求4所述的细胞，其特征在于：它是大肠杆菌DH5ci或农杆菌LBA4404。
6. 权利要求1所述的多核苷酸序列SEQ ID NO: 1在马铃薯抗低温糖化中的应用。
7. 泣似#7联用泣似J份在马铃薯抗低温糖化中的应用。
【文档编号】C12N15/84GK104120131SQ201410366768
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】宋波涛, 侯娟, 谢从华, 柳俊 申请人:华中农业大学