核苷酸序列的用途
【专利摘要】本发明公开了SEQ?ID?NO.1或2所示的核苷酸序列在制备者治疗恶性乳腺癌的药物中的用途。本发明还公开了一种治疗恶性乳腺癌的药物。本发明公开的核苷酸序列是诊断恶性乳腺癌的靶标位点，可用于快速筛选治疗乳腺癌的药物，本发明公开的药物可用于治疗恶性乳腺癌，具有实际应用价值。
【专利说明】核苷酸序列的用途
[0001]本申请是专利申请号:201210243379.x, 申请人::?卢州医学院，申请日:2012年7月13日的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及核苷酸序列的用途，具体涉及调控ERa表达的核苷酸序列序列的用途。
【背景技术】
[0003]乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，好发于40~60岁绝经前后的妇女，发病率仅次于胃癌和肺癌，并有逐年上升的趋势。乳腺癌的治疗方式众多，包括外科治疗、化学治疗、放射治疗和中医中药治疗。外科治疗主要方式是手术切除，化学治疗包括手术前、中和后的化疗，放射治疗是作为手术后补充治疗或晚期、复发病例的姑息治疗，中医中药治疗是我国传统治疗方法，可改善患者的全身情况，减轻化、放疗的反应，常作为手术、放射治疗的辅助手段。大量研究表明，不同亚型的乳腺癌之间具有不同的生物学特征，并不是任意一种乳腺癌治疗方法对所有的患者都适用。
[0004]雌激素受体(ERa )是与乳腺癌密切相关的小分子，大多数乳腺癌发生最初，表达雌激素受体(ERa)，并依赖雌激素生长，对激素敏感、抗性弱，预后好，治疗难度小。随着病程发展，一些乳腺癌不再表达ER α，获得非依赖雌激素的特征，对激素的敏感性差、抗性强，预后差，治疗难度大，属于恶性乳腺癌，恢复ER α表达后可以恢复乳腺癌恢复激素治疗的敏感性，治疗难度降低。
[0005]因此，可以通过检测乳腺癌细胞ERa表达水平，判断乳腺癌是否为恶性乳腺癌，还可以通过控制ERa的表达改善乳腺癌的恶性程度。
【发明内容】
[0006]本发明的发明目的之一是提供ERa基因上的TWIST蛋白结合位点。本发明另一发明目的是提供检测前述结合位点与TWIST蛋白是否结合的试剂盒，以及抑制前述结合位点与TWIST蛋白结合的药物。
[0007]上述ERa基因上的TWIST蛋白结合位点，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，该位点含有601个碱基，其中，长度为332bp的序列是TWIST蛋白结合的关键序列，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。用基因工程的方法，可将SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所式的核苷酸序列克隆到其他载体上，形成重组载体，如，pGL-332ER a -Pro-Luc重组质粒。
[0008]NuRD复合体是一个多亚基的复合体，包括ATP酶部分和组蛋白脱乙酰酶部分，广泛参与基因转录抑制，TffIST蛋白通过募集Nu`RD复合体，结合到ERa基因的SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所示序列区域上，抑制ERa表达，导致乳腺癌恶化。
[0009]因此，一方面，可以通过检测TWIST蛋白是否结合到ER α基因的SEQ IDN0.1或者SEQ ID N0.2所示序列的区域上，确定待检乳腺癌是否为恶性乳腺癌，检测试剂盒包括任选的用于检测TWIST蛋白与SEQ ID N0.1或者SEQ IDN0.2所示核苷酸序列的结合物的试剂。该检测试剂可以为染色质免疫共沉淀技术用试剂和扩增SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所示核苷酸序列的试剂。优选地，所述染色质免疫共沉淀技术用试剂包括抗TWIST蛋白抗体，所述扩增SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所示核苷酸序列的试剂包括SEQ IDN0.7~8所示的引物对2。[0010]另一方面，可以通过抑制TWIST蛋白或者NuRD复合体结合到ERa基因的SEQ IDN0.1或者SEQ ID N0.2所示序列的区域上，使ERa表达阳性，恢复恶性乳腺癌对激素敏感性。TWIST基因沉默剂可抑制TWIST基因表达，降低TWIST蛋白含量，抑制TWIST蛋白结合到ERa基因上，可以作为治疗恶性乳腺癌的药物。组蛋白脱乙酰酶抑制剂及其衍生物可以抑制被募集到ERa基因上的NuRD复合体的活性，也可以作为治疗恶性乳腺癌的药物。优选地，所述的TWIST基因沉默剂为沉默TWIST基因的shRNA (shTWIST或者shT)，其中，与TffIST基因相匹配的特异性核苷酸序列如SEQ ID N0.19所示，shRNA全长如SEQ ID N0.20所示；所述的组蛋白脱乙酰酶抑制剂为曲古抑素A。SEQ ID N0.19所示的核苷酸序列是与TffIST基因相匹配的特异性核苷酸序列，能与TWIST特异性结合而沉默TWIST基因，该段序列为shRNA的核心序列，得到该序列后，本领域普通技术人员可以根据shRNA核心序列及载体性质设计得到其余核苷酸序列，也可以人工合成小分子干扰RNA (Small interferingRNA，siRNA)试剂。
[0011]本发明所述恶性乳腺癌，是指乳腺癌细胞中ERd表达呈阴性；TWIST蛋白(gpTffISTl蛋白)，是一种转录因子，为高度保守的碱性螺旋-环-螺旋蛋白，在动物与人类的胚胎发育中起关键调控作用，TWIST基因，编码TWIST蛋白的核苷酸序列；shRNA是shorthairpin RNA的缩写，译为“短发夹RNA” ；与TWIST基因相匹配的特异性核苷酸序列:是指能与TWIST特异性结合而沉默TWIST基因的核苷酸序列。
[0012]本发明提供的了 SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所示序列，是TWIST蛋白的结合位点，可作为恶性肿瘤乳腺癌患诊断和治疗的靶标基因，用于制备恶性乳腺癌检测试剂，筛选治疗恶性乳腺癌的药物，具有实际利用价值。本发明提供的恶性乳腺癌检测试剂盒能准确检测待检组织是否为恶性乳腺癌，可用于早期监控和检测恶性乳腺癌，实施早期预防和治疗，减少损害。本发明提供的药物可以重启ERa基因表达，恢复恶性乳腺癌对激素的敏感性，具有良好的市场应用前景。
[0013]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0014]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1检测TWIST蛋白在FLAG-TWIST HEK293细胞中ER α结合位点的ChIP高通量测序图谱。(Chip即染色质免疫沉淀)。
[0016]图2ChIP_PCR 检测结果。
[0017]图3使用HA抗体和β-actin (下)进行Western blot和突光素酶活性测定(上)进行了三次重复试验，p<0.001。
[0018]图 4ChIP-re-ChIP 实验分析 FLAG-TWIST 的 HEK293 和 FLAG 的 HEK293 对照细胞的结果。
[0019]图5表达无靶向性shRNA (shCtrl)或靶向干扰TWIST mRNA(shT)的shRNAMDA-MB-435细胞用标明的TWIST蛋白，MTA2, HDAC2或RbAp46抗体做ChIP分析结果图。
[0020]图6shCtrl或shT的MDA-MB-435细胞用乙酰化或甲基化的组蛋白H3K9抗体的ChIP分析结果图。
[0021]图 7 在 SUMl315，MDA-MB-435(MDA435)，
[0022]MDA-MB-231 (MDA231)，T47D和MCF-7人类乳腺癌细胞系进行实时定量检测逆转录PCR分析TWIST的mRNA水平⑴和ER a (E)，数据规范化到GAPDH的mRNA水平，表现为土平均标准差。
[0023]图8Western blot分析人类乳腺癌细胞系的TWIST蛋白和ER α表达，β-actin作为内参蛋白。
[0024]图9在TWIST阴性的T47D人类乳腺癌细胞系中过表达TWIST后的TWIST和ERa的mRNAs由实时RT-PClUIUS，p〈0.001。注意过表达TWIST后ER α的mRNA表达降低了。
[0025]图10转染对照载体或TWIST蛋白表达载体的MCF-7细胞中Western blot分析ER a、E-cadherin、TWIST 蛋白和 β-actin。
[0026]图11 在表达非靶性 shRNA (shCtrl)或 shRNA TWIST mRNA (shT)的 4T1 和MDA-MB-435 (MDA435)乳腺癌细胞中实时 RT-PCR 检测 ER a mRNA 水平，**，p〈0.001。
[0027]图12TSA对ER α表达的调节作用。shTWIST或对照shRNA (shCtrl)的4T1和MDA-MB-435细胞用330nM的TSA(+)处理。使用ERa和β-actin蛋白抗体进行印迹分析。
[0028]图13半定量RT-PCR分析中国人女性乳腺浸润性导管癌中ER α，TWIST和GAPDH的mRNA表达。
[0029]图14免疫组化分析(棕色)人类乳腺浸润性导管癌中ERa，TffIST蛋白表达。用ERa，TWIST蛋白抗体对28位人类乳腺浸润性导管癌的组织免疫染色，图片在显微镜400倍放大倍数下拍摄。
[0030]图1528个人类乳腺浸润性导管癌组织的免疫组织化学的TWIST蛋白和ER α的统计数据汇总。
[0031]图16MDA-MB-435乳腺癌细胞内源性表达TWIST蛋白的ChIP实验检测结果。【具体实施方式】
[0032]实施例1TWIST蛋白与ERa基因TWIST蛋白结合位点结合可以抑制ERa基因表达
[0033]1、实验材料
[0034](I)细胞系
[0035]HEK293稳定细胞系，HEK293T细胞系，均为市售品；可被Doxcycline (DOX)诱导的FLAG-TffIST 或者 FLAG 的 HEK293 稳定细胞系，按照文献 Fu Junjiang, Li Qin, Tao He, JunQin, Jun Hong, Jiemin Wong, Lan Liao and Jian ming Xu.The TWIST/Mi2/NuRD ProteinComplex and its Essential Role in Cance r Metastasis.Cell Res:275-289(2011).所述方法制备。
[0036]2、实验方法
[0037](一)FLAG-TffIST标签和单独FLAG对照标签的HEK293细胞的ChIP (染色质免疫共沉淀技术)实验
[0038](I)将带有FLAG-TWIST标签和单独FLAG对照标签的HEK293细胞在15cm的培养皿中培养到细胞密度达到65%时，加入0.1 μ g/ml的DOX诱导16h ；
[0039](2)步骤(1)细胞用福尔马林交联固定并溶解在Iml包含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液中，3000g离心5分钟；
[0040](3)洗涤沉淀物，用600 μ I含有蛋白酶抑制剂的溶液重悬沉淀物，后用超声波破碎至DNA片段长度为200-500bp ；
[0041](4)用 1.4ml 含有 2mM 的 EDTA, IOOmM 的 Nacl , 20mM 的Tris-HCl (pH8.0),0.5%Triton X_100和蛋白酶抑制剂的溶液重新洗涤和稀释步骤(3)所得上清液，得样本；[0042](5)每0.4ml步骤(4)所得样本与6 μ I的M2-FLAG标签抗体珠混合，复合物在4°C旋转孵育过夜；
[0043](6)抗体珠连续用ChIP I，II和III缓冲液和含有ImM DTT的TE buffer洗涤；
[0044](7)用5yg蛋白酶K洗脱和65°C消化蛋白-DNA复合物过夜，DNA从交联蛋白中释放出来；
[0045](8)用酚和氯仿抽提DNA，沉淀溶解在20 μ I的ddH20中用于做PCR分析和如下高通量测序及分析。
[0046](9)高通量测序及分析:将得到的DNA片段用T4DNA连接酶连接到oligo上构建DNA库后，高通量测序仪测序，序列读数分析用BWA法在人类Mar.2006汇编(hgl8)中映出，用MACS鉴定出峰值和用整合的基因组浏览器(IGB)来观察，详见
[0047]http://www.affymetrix.com/partners programs/programs/developer/tools/download igb.affx。
[0048]10)根据步骤(9)的结果，分离和测定出调控ERa表达的DNA序列，序列如SEQ IDN0.2所示的核苷酸序列。根据SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，设计三对引物进行实时定量PCR，分析ChIP结果，验证步骤(9)的结论。
[0049](二)重组质粒的构建及荧光素报告分析
[0050](I)质粒构建
[0051]目的基因:位于人类ER α中内含子7的TWIST蛋白结合区域的332bp的DNA片段。以人类基因组DNA为模板，PCR扩增得到，扩增引物(SEQ ID N0.3~4所示的引物):
[0052]ER a -BamHl-F(5，-cgcggatccGGGGGGAGGTTCTTCTTC-3，)
[0053]ER a -Sal1-R(5，-acgcgtcgacTTATTGCTCAGAAATAGTCATG-3，)。
[0054]将PCR扩增获得的目的基因片段用BamHl和SalI在37°C双酶切3_5小时，用胶回收试剂盒回收纯化酶切产物，与相同BamHl和SalI双酶切和纯化的pGL3-Pro-Luc载体(promega公司)连接和筛选阳性克隆，从而亚克隆到pGL3-Pro_Luc载体，从而构建PGL-332ERa -Pro-Luc质粒，克隆的DNA片段的序列正确性用DNA测序法证实，与SEQ IDN0.2相同。[0055](2)荧光素报告基因分析
[0056]HEK293T细胞在12孔板培养到密度为40%时，将一定量50ng的pGL3-Pro_Luc或 pGL-332ERa -Pro-Luc，一定量 120ng 的 pSG5-HA_TWIST 质粒或 pSG5 空质粒和 30ng 的β -半乳糖β -Gal表达质粒用脂质体共转染。
[0057]转染2天后检测荧光素酶效果和β -gal活性，每个样本的荧光素酶活性都是被β -gal活性所标准化的，所有的实验均重复三次。
[0058]3、实验结果
[0059](一)FLAG-TWIST标签和单独FLAG对照标签的HEK293细胞的ChIP结果
[0060](I)关于FLAG-TWIST标签和单独FLAG对照标签的HEK293细胞的ChIP-高通量DNA测序结果如图1所示，该图说明人类ERa基因上只有一个TWIST蛋白结合位点，且该结合位点位于ER α基因内含子7内，定位在6号染色体上第152458103位，左右300bp，如SEQ ID N0.1所示。进一步对其进行序列分析，显示该结合位点存在6个潜在的TWIST蛋白结合E-boxes (CANNTG)。根据该结果，设计三对引物:
[0061]引物对1: [0062]Pl (5，-tcacaccttgcttcgcatag-3，)
[0063]P2(5， -tgagctcagaaatccacttcc-3，)
[0064]用于扩增ERa基因的内含子I区域，确定该区域是否是阴性对照区域；
[0065]弓丨物对2:
[0066]P3(5， -agctgggctcactcacacat-3，)
[0067]P4(5， -gaggcatagagcagagtcacc-3，)
[0068]用于扩增ERa基因的内含子7区域，确定该区域是否含有TWIST蛋白结合位点；
[0069]引物对3:
[0070]P5(5， -acctgtgagcagggtgactt-3，)
[0071]P6(5， -acaaaaacccgcaacttcct—3，)
[0072]用于扩增ERci基因的3’端
[0073]用于扩增ERa基因3’端区域，确定该区域是否是阴性对照区域。
[0074](2)如图2所示:用引物对2(P3/P4)扩增ChIP分离的DNA样本，比较FLAG-TWIST标签细胞和FLAG标签细胞，前者的扩增量是后者的1200倍，而以引物对I (P1/P2)和引物对3 (P5/P6)扩增ChIP分离的DNA样本，均难以增得扩增条带。进一步验证了前述结论是正确的，也说明引物对2可以准确扩增包含TWIST蛋白结合位点的区域。
[0075](二)荧光素报告基因分析结果
[0076]如图3所示:
[0077]当pGL3-332ERa -Pr0-Luc报告基因质粒和TWIST对照空载体共转染入ΗΕΚ293Τ细胞时，TffIST蛋白不表达，荧光强度高；当PGL3-332ERa -PiO-Luc报告基因质粒和TWIST表达载体共转染入ΗΕΚ293Τ细胞时，TffIST蛋白表达，荧光强度显著低于前者。
[0078]当pGL3-Pro_Luc报告基因质粒和TWIST对照空载体共转染入HEK293T细胞时，TWIST蛋白不表达，荧光强度高；当pGL3-Pro-Luc报告基因质粒和TWIST表达载体共转染入HEK293T细胞时，TffIST蛋白表达，荧光强度与前者无显著差异。
[0079]实验说明，存在332bp的ERa序列时，过表达的TWIST蛋白显著地抑制了报告基因的活性，缺乏332bp的ERa序列时，TWIST蛋白的过表达没有抑制报告基因的活性，证明TWIST蛋白可以结合在如SEQ ID N0.2所示的长度为332bp的序列上，也就是说，SEQ IDN0.2所示的基因片段上面有TWIST蛋白结合位点，ER α基因的TWIST蛋白结合位点有转录抑制功能 。
[0080]实验证明:人类ER α基因上存在TWIST蛋白结合位点，位于内含子7内，定位在6号染色体上第152458103位，左右300bp，如SEQ ID N0.1所示，其TWIST蛋白结合关键位点为SEQ ID N0.2所示的序列。而且，该TWIST蛋白结合位点与TWIST蛋白结合后，会抑制ERa基因的转录，因而，可以通过检测ERa基因上的TWIST蛋白结合位点上是否结合了TWIST蛋白，确定ERa基因是否表达，也可以通过抑制ER α基因上的TWIST蛋白结合位点结合TWIST蛋白，恢复ER α的表达。
[0081]实施例2TWIST蛋白通过募集NuRD复合物到ERa基因TWIST蛋白结合区域上抑制ER α基因表达
[0082]1、实验材料
[0083](I)细胞系--被 Doxcycline (DOX)诱导的 FLAG-TWIST 或者 FLAG 的 HEK293 稳定细胞系，同实施例1。
[0084]MDA-MB-435乳腺癌细胞系，是人乳腺癌高转移细胞系，能稳定表达内源性TWIST蛋白，市售品。
[0085]表达无靶向性的短发夹RNA (shRNA)或者可以表达能特异干扰TWIST信使RNA(mRNAs)的 shRNA 稳定的 MDA-MB-435 细胞系。按照文献 Fu Junjiang, Li Qin, Tao He, JunQin, Jun Hong, Jiemin Wong, Lan Liao and Jian ming Xu.The TWIST/Mi2/NuRD ProteinComplex and its Essential Role in Cance r Metastasis.Cell Res:275-289(2011).所述方法制备。
[0086]2、实验方法
[0087](一)FLAG-TWIST标签和单独FLAG对照标签的HEK293细胞的ChlP-re-ChlP实验
[0088](1)将带有FLAG-TWIST标签和单独FLAG对照标签的HEK293细胞在15cm的培养皿中培养到细胞密度达到65%时，加入0.1 μ g/ml的DOX诱导16h ；
[0089](2)步骤(1)细胞用福尔马林交联固定并溶解在Iml包含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液中，3000g离心5分钟；
[0090](3)洗涤沉淀物，用600 μ I含有蛋白酶抑制剂的溶液重悬沉淀物，后用超声波破碎至DNA片段长度为200-500bp ;；
[0091](4)用 1.4ml 含有 2mM 的 EDTA, IOOmM 的 Nacl , 20mM 的Tris-HCl (pH8.0),0.5%Triton X_100和蛋白酶抑制剂的溶液重新洗涤和稀释步骤(3)所得上清液，得样本；
[0092](5)每0.4ml步骤(4)所得样本与6 μ I的M2-FLAG标签抗体珠混合，复合物在4°C旋转孵育过夜；
[0093](6)抗体珠连续用ChIP I，II和III缓冲液和含有ImM DTT的TE buffer洗涤；
[0094](7)用Tris-buffered saline进一步洗漆,用3XFLAG肽溶液将复合物洗脱下来；
[0095](8)被洗脱下来的材料用抗MTA2，HDAC2或Mi2抗体和琼脂糖A/G珠抗体(M1-2, MTA2和HDAC2是NuRD复合物的标准成分，)稀释，4°C旋转孵育过夜；[0096](9)用5yg蛋白酶K洗脱和65°C消化蛋白-DNA复合物过夜，DNA从交联蛋白中释放出来；
[0097](10)用酚和氯仿抽提DNA，沉淀溶解在20 μ I的ddH20中用于做PCR分析；
[0098](11)得ChIP-re-ChIP中分离出来的DNA样本；
[0099](12)以引物对2
[0100]P3(5’ agctgggctcactcacacat-3J )
[0101]P4 (5’ -gaggcatagagcagagtcacc-3’)为引物，进行实时定量 PCR,分析 ChIP 结果。
[0102](二)表达无靶向性的短发夹RNA (shRNA)或者可以表达能特异干扰TWIST信使RNA (mRNAs)的 shRNA (shT)稳定的 MDA-MB-435 细胞的 ChlP-re-ChlP 实验
[0103](I)表达无靶向性的短发夹RNA (shRNA)或者可以表达能特异干扰TWIST信使RNA(mRNAs)的shRNA稳定的MDA-MB-435细胞在15cm的培养皿中培养到细胞密度至100% ；
[0104](2)步骤(1)细胞用福尔马林交联固定并溶解在Iml包含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液中，3000g离心5分钟；
[0105](3)洗涤沉淀物，用600 μ I含有蛋白酶抑制剂的溶液重悬沉淀物，后用超声波破碎至DNA片段长度为200-500bp ；
[0106](4)用 1.4ml 含有 2mM 的 EDTA, IOOmM 的 Nacl , 20mM 的Tris-HCl (pH8.0),0.5%Triton X_100和蛋白酶抑制剂的溶液重新洗涤和稀释步骤(3)所得上清液，得样本；
[0107](5)每0.4ml步骤(4)所得``样本与6 μ I的抗TWIST蛋白抗体珠混合，4°C旋转孵育过夜；
[0108](6)抗体珠连续用ChIP I，II和III缓冲液和含有ImM DTT的TE buffer洗涤；
[0109](7)用Tris-buffered saline进一步洗漆,用3XFLAG肽溶液将复合物洗脱下来。
[0110](8)被洗脱下来的材料用抗MTA2，HDAC2, RbAp46,乙酰化组蛋白H3K9和甲基化组蛋白H3K9的抗体(MTA2，HDAC2和RbAp46是NuRD复合物的标准成分)混合，4°C旋转孵育过夜；
[0111](9)用5yg蛋白酶K洗脱和65°C消化蛋白-DNA复合物过夜，DNA从交联蛋白中释放出来；
[0112](10)用酚和氯仿抽提DNA，沉淀溶解在20 μ I的ddH20中用于做PCR分析；
[0113](11)得ChIP-re-ChIP中分离出来的DNA样本；
[0114](12)以引物对2
[0115]P3(5，-agctgggctcactcacacat-3J )
[0116]P4 (5’ -gaggcatagagcagagtcacc-3’)为引物，进行实时定量 PCR,分析 ChIP 结果。
[0117]3、实验结果
[0118](一)FLAG-TWIST标签和单独FLAG对照标签的HEK293细胞的ChlP-re-ChlP实验
结果
[0119]如图4所示，比较FLAG-TWIST标签细胞与FLAG标签细胞中，ERa基因的TWIST蛋白结合部位上M1-2，MTA2和HDAC2的量，前者是后者的100倍以上。说明了 HEK293细胞中，TffIST蛋白可以有效地将NuRD复合物募集到ERa基因上的TWIST蛋白结合区域。
[0120](二)表达无靶向性的短发夹RNA (shRNA)或者可以表达能特异干扰TWIST蛋白信使 RNA (mRNAs)的 shRNA 稳定的 MDA-MB-435 细胞的 ChIP-re-ChIP 实验结果
[0121]如图5所示，表达无靶向性的shRNA的MDA-MB-435细胞中，ERa基因上MTA2, HDAC2和RbAp46均有募集，shRNA干扰使TWIST蛋白基因沉默的MDA-MB-435细胞中，这些因子几乎未被募集到ERa基因上。NuRD复合物的核心成分能否结合到ERa基因上，与TWIST蛋白是否存在紧密相关，证实NuRD复合物的核心成分确实是与TWIST蛋白相互作用而募集到ERa基因上的TWIST蛋白结合区域。
[0122]如图6所示，表达无靶向性的shRNA的MDA_MB_435细胞中，检测出染色质相关的组蛋白H3K9乙酰化和单甲基化，说明NuRD复合物募集到了 ERa基因上，但是TWIST基因沉默的MDA-MB-435细胞中乙酰化的组蛋白H3K9增加，单甲基化的组蛋白H3K9减少，说明NuRD复合物没有募集到ER α基因上。结果证明TWIST蛋白调节的NuRD复合物募集情况与ERa基因上TWIST蛋白结合染色质区域被抑制的表观遗传染色质修饰是一致的。
[0123]NuRD复合体是一个多亚基的复合体，包括ATP酶部分和组蛋白去乙酰化(HDAC)酶部分，广泛参与基因转录抑制，特别是表观遗传调控的转录抑制。实验证明NuRD复合物的核心成分是与TWIST蛋白相互作用而募集到ERa基因TWIST蛋白结合区域上，进一步抑制ERa基因的表达。
[0124]实施例3TWIST和NuRD复合物抑制ER α表达，沉默TWIST基因和HDAC活性抑制物能重新恢复乳腺癌细胞中ERa的表达
[0125]1、实验材料
[0126](I)细胞系:
[0127]高分化的非转移性乳腺癌细胞系:高表达ER α的T47D细胞系和MCF_7细胞系，它们为非恶性乳腺癌细胞系；
[0128]低分化的转移性乳腺癌细胞系:ERa表达阴性的SUM1315细胞系、MDA_MB_435细胞系和MDA-MB-231细胞系，它们为恶性乳腺癌细胞系。
[0129]表达无靶向性的短发夹RNA (shRNA)或者可以表达能特异干扰TWIST信使RNA(mRNAs)(其核苷酸序列如SEQ ID N0.20所示)的shRNAs稳定的4T1和MDA-MB-435细胞系，按照文献Fu Junjiang, Li Qin, Tao He, Jun Qin, Jun Hong, Jiemin Wong, Lan Liao andJian ming Xu.The TWIST/Mi2/NuRD Protein Complex and its Essential Role in Cancer Metastasis.Cell Res: 275-289 (2011).所述方法制备。
[0130]2、实验方法
[0131](I)ERa和TWIST表达水平的测量
[0132]通过RT-PCR和Western blot分析方法，检测T47D细胞系、MCF-7细胞系、SUM1315细胞系、MDA-MB-435细胞系和MDA-MB-231细胞系中ERa ,TffIST的mRNA水平和ER a ,TWIST的蛋白水平。
[0133]RT-PCR:
[0134]Wlyg的人乳腺癌细胞总RNA为模板，用逆转录试剂盒构建cDNA文库。
[0135]用qPCR MasterMix Plus (Eurogentec)和 StepOnePlus 实时 PCR 系统来进行实时PCR:
[0136]引物5，-tcctaacttgctcttggacagg-3，和 5，-gtagccagcagcatgtcg-3，和 TaqManprobe22用来测量cDNA文库中ERa cDNA的水平。[0137]引物5，-gggccggagacctagatg-3，和 5，_tttccaagaaaatctttggcata_3，和 TaqMan探针50用来检测cDNA文库中TWIST cDNA水平。
[0138]每个样本的GAPDH mRNA在同样的条件下反应作为内参来标准化检测ER α和TWIST mRNAs 的水平。
[0139]Western blot:
[0140]TWISTl, E-cadherin, β-actin 和 HA-tag 抗体、单克隆 ER α 抗体(D-12)均为市售品。蛋白印迹方法的文献见一傅俊江主编:精编医学分子生物学实验指导，中国医药科技出版社，2012年2月。
[0141](2)TWIST蛋白募集NuRD复合物包含有组蛋白脱乙酰酶，比如HDAC2。TrichostainA(TSA)，曲古抑素A是一种HDAC抑制物。
[0142]将TSA加入表达无靶向性的短发夹RNA (shRNA)或者可以表达能特异干扰TWIST信使RNA (mRNAs)的shRNA稳定的4T1和MDA-MB-435细胞系中，检测ERa的表达水平。
[0143]3、实验结果
[0144]如图7~8所示，在ERa表达阴性的SUM1315和MDA-MB-435细胞系中检出高水平的TWISTmRNA和蛋白质，在ER α表达阴性的MDA-MB-231细胞系中也检出低水平的TWIST蛋白；高表达ER α的T47D和MCF-7细胞中没有检测出TWIST的mRNA和蛋白质水平。如图9~10所示，T47D细胞中，过表达TWIST抑制了 ERa的mRNA的表达；MCF-7细胞中，过表达TWIST蛋白抑制了 ERa的蛋白水平；如图11所示，细胞系中TWIST基因沉默，使ER α的mRNA表达提高了 2.5-3倍。结果显示在这些细胞系中ER α的表达与TWIST蛋白的表达呈负相关。
[0145]如图12所示，同它们各 自的空白处理组相比，表达无靶向性shRNA的TSA处理4T1和MDA-MB-435细胞中表达出更高水平的ER α蛋白(Compare lanelwith lane2andlane5with lane6) ；TSA 分别处理 shRNA 沉默 TffIST 基因的 4T1 和 MDA-MB-435 细胞中，ER α 蛋白水平并没有显著增加。(compare the ratios of ER a to β -actin in lane4withIanes2and3and in lane8with Ianes6and7)。实验一方面说明 ERa 的表达与 TWIST 的表达呈负相关，另一方面说明沉默TWIST基因或抑制NuRD中HDAC的活性都能够有效地减轻ERa基因的转录抑制。
[0146]因此，实验证明，ER α的表达被TWIST蛋白抑制，且TWIST蛋白是通过募集NuRD复合物来抑制ER α的表达。另一方面，HDAC酶抑制剂-TSA能够阻断TWIST和NuRD复合物的功能。
[0147]基于ERa的丢失导致乳腺癌细胞在内分泌激素治疗中所获得的抗药性，对乳腺癌治疗是个巨大的挑战，重新恢复ER α的表达对乳腺癌恢复激素治疗的敏感性具有重大意义。因而，TSA及其衍生物和沉默TWIST基因的shRNA (TWIST基因相匹配的特异性核苷酸序列如SEQ ID N0.19所示的)，均可以阻断TWIST和NuRD复合物对ER α表达的抑制，可重新恢复乳腺癌细胞中ERa的表达，而恢复乳腺癌对激素治疗的敏感性。
[0148]实施例4人体乳腺癌细胞中TWIST蛋白抑制ERa表达
[0149]1、实验材料:乳腺癌肿瘤和总RNA分离
[0150]在取得知情同意书的情况下，在泸州医学院附属医院收集了 28个乳腺侵袭性导管癌的组织样本。所有的实验设计过程得到了泸州医学院的同意。所有患者年龄是33到72岁的中国妇女。在这一阶段，没有患者的存活数据是可用的。取下的乳腺癌组织立刻用液氮速冻，放_80°C保存。用TRIZOL试剂盒从细胞中分离总RNA —样从乳腺癌组织中分离出总RNA，放-80°C保存。
[0151]2、实验方法
[0152](I)用半定量PCR来分析mRNA表达
[0153]Wlyg的人乳腺癌细胞总RNA为模板，用逆转录试剂盒构建cDNA文库。
[0154]设计特定引物，用乳腺癌mRNA样本做半定量RT-PCR:
[0155]RT-ERα -5(5，-gtgcctggctagagatcctg-3，)和 RT-ER α -3(5，-agagacttcagggtgctgga-3’ )来逆转录和半定量PCR来检测ER α的mRNA ；
[0156]RT-TffIST-5(5，_acgagctggactccaagatg_3，)和 RT-TWIST-3(5，-cacgccctgtttctttgaat-3’ )用来检测 TWIST 的 mRNA。[0157]每个样本的GAPDH mRNA在同样的条件下反应作为内参来标准化检测ER α和TWIST mRNAs 的水平。
[0158]总RNA逆转录反应和聚合酶链式反应(PCR)方法的文献见一傅俊江主编:精编医学分子生物学实验指导，中国医药科技出版社，2012年2月)。
[0159](2)免疫组化
[0160]乳腺癌组织被固定在10%的福尔马林中，石蜡包埋用来做免疫组化:
[0161]取4μπι厚的上述乳腺癌组织在二甲苯中去石蜡，在梯度酒精和蒸馏水中水化；
[0162]抗原修复后，用0.3%过氧化氢在甲醇中封阻内源性过氧化物酶活性，30分钟，用I XPBS洗涤，5%兔血清孵育30min来封阻非特异性背景；
[0163]载玻片用TWIST单克隆抗体或ERa抗体在含有2%血清和1%BSA的Tris-bufferedsaline中4°C孵育过夜:
[0164]漂洗过的载玻片用适当的二抗以1:100稀释，室温孵育30min，之后用与过氧化物酶结合的过氧化物酶复合物孵育:
[0165]用DAB染色法来进行免疫染色，用苏木精复染，在光学显微镜下观察。用包含有2%兔血清和1%BSA而没有一抗的TBS来孵育对照载玻片作为阴性对照。
[0166]3、实验结果
[0167]如图13~15所示，有17位(61%)的肿瘤患者具有高水平的TWIST的mRNA与蛋白，和低水平或者无法检测到ERa的mRNA和蛋白水平，7位(25%)的肿瘤患者具有低或者无法检测到TWIST的mRNA和蛋白质水平以及高水平的ERa，2位(7%)肿瘤患者TWIST和ER α的mRNA和蛋白质水平都增高，剩下2位(7%)肿瘤患者TWIST和ER α的mRNA和蛋白质水平都降低。这些结果显示在85.7%的侵袭性乳腺癌中TWIST的表达与ERa表达呈负相关。
[0168]临床实验证明，TWIST与ER α在临床患者乳腺癌肿瘤中表达呈负相关，提示TWIST过表达会抑制ERa基因的表达。
[0169]实施例4恶性乳腺癌细胞检测试剂盒及其使用方法
[0170]1、试剂盒的组成
[0171]①染色质免疫共沉淀技术用试剂:抗TWIST蛋白抗体和其他染色质免疫共沉淀技术常用试剂；[0172]②扩增SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所示核苷酸序列的试剂:
[0173]引物对2:
[0174]上游引物:5，-agctgggctcactcacacat-3?
[0175]下游引物:5’-gaggcatagagcagagtcacc-3’
[0176]和其他扩增核苷酸的常用试剂。
[0177]2、使用方法
[0178](I)取待测样本组织和细胞；
[0179]( 2 )用本发明染色质免疫沉淀技术用试剂对待测样本进行染色质免疫沉淀，获得DNA分子混合物；
[0180](3)以步骤(2)所得DNA分子混合物为模板，提取DNA，用扩增SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所示核苷酸序列的试剂进行扩增；
[0181](4)检测PCR扩增结果，若PCR扩增结果为阳性，则待测样本中存在TWIST蛋白与SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所示核苷酸序列的结合物，若PCR扩增结果为阴性，则待测样本中不存在TWIST蛋白与SEQ ID N0.1或者SEQ ID N0.2所示核苷酸序列的结合物。
[0182]3、验证实验:用本 发明试剂盒检测MDA-MB-435乳腺癌细胞
[0183]1、实验材料:MDA-MB-435乳腺癌细胞系，市售品，是人乳腺癌高转移细胞系，ERa表达阴性，为恶性乳腺癌，能稳定表达内源性TWIST蛋白，其细胞内存在TWIST蛋白与ERa基因上TWIST蛋白结合位点的结合物，用本发明试剂盒扩增应当得到扩增产物。
[0184]实验方法:
[0185](I) MDA-MB-435细胞在15cm的培养皿中培养到细胞密度至100% ；
[0186](2)步骤(1)细胞用福尔马林交联固定并溶解在Iml包含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液中，3000g离心5分钟；
[0187](3)洗涤沉淀物，用600 μ I含有蛋白酶抑制剂的溶液重悬沉淀物，后用超声波破碎至DNA片段长度为200-500bp ；
[0188](4)用 1.4ml 含有 2mM 的 EDTA, IOOmM 的 Nacl , 20mM 的Tris-HCl (pH8.0),0.5%Triton X_100和蛋白酶抑制剂的溶液重新洗涤和稀释步骤(3)所得上清液，得样本；
[0189](5)每0.4ml步骤(4)所得样本与6 μ I的抗TWIST蛋白抗体珠或者IgG抗体珠(其作为阴性对照)混合，复合物在4°C旋转孵育过夜；
[0190](6)抗体珠连续用ChIP I，II和III缓冲液和含有ImM DTT的TE buffer洗涤；
[0191](7 )用5 μ g蛋白酶K混合和65 V消化蛋白-DNA复合物过夜，DNA从交联蛋白中释放出来；
[0192](8)用酚和氯仿抽提DNA，沉淀溶解在20 μ I的ddH20中用于做PCR分析；
[0193](9)以引物对2:
[0194]P3(5，-agctgggctcactcacacat-3J )
[0195]P4(5，-gaggcatagagcagagtcacc-3J )
[0196]为引物，定量PCR分析CHIP结果。
[0197]I1、实验结果
[0198]用本发明试剂盒检测该细胞系，以抗TWIST蛋白抗体作为抗体珠，阴性对照以IgG抗体作为抗体株，检测结果如图16所示，本发明试剂盒确实可以扩增得到扩增产物，而阴性对照则基本无扩增产物，说明本发明试剂盒可以准确地检测待检样本是否为恶性乳腺癌细胞。
[0199]综上，本发明提供了 ERa基因上的TWIST蛋白结合位点，可用于恶性乳腺癌诊断试剂和治疗药物的开发；并提供了检测TWIST蛋白是否结合在ERd基因上的试剂盒，可以准确检测待检样本是否为恶性乳腺癌；还提供了抑制TWIST蛋白和NuRD复合物结合到ERa基因上的药物，可用于治疗恶性乳腺癌， 临床应用前景良好。
【权利要求】
1.SEQ ID N0.1或2所示的核苷酸序列在制备者治疗恶性乳腺癌的药物中的用途。
2.一种治疗恶性乳腺癌的药物，其特征在于:所述的药物是组蛋白脱乙酰酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂衍生物或TWIST基因沉默剂。
3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于:所述的组蛋白脱乙酰酶抑制剂为曲古抑素A，所述的TWIST基因沉默剂为沉默TWIST基因的shRNA，其中，与TWIST基因相匹配的特异性核苷酸序列如SEQ ID N0.19所示。
4.一种如SEQ ID N0. 19所不的核苷酸序列。
【文档编号】A61K31/165GK103509868SQ201310444284
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年7月13日 优先权日:2012年3月9日
【发明者】傅俊江, 张连美 申请人:泸州医学院