专利名称：检测h1和h3亚型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测Hl和H3亚型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒，尤指快速的基于 LNA和MGB修饰的短探针单重和双重荧光RT-PCR检测核苷酸序列和试剂盒，不仅适用于不 同动物组织样本中Hl和H3亚型流感病毒的准确检测，还可适用于不同动物活体样本(主 要为拭子样品)H1和H3亚型流感病毒的检测，可用于动物Hl和H3亚型流感病毒的筛查， 出入境检疫等，属于检验检疫领域。
背景技术：
自1934年首次分离出甲型流感病毒以来，由Hl或H3亚型的流感病毒已引起多次 世界性的人和动物的大流行以及大流行间期的小流行。Hl和H3亚型流感病毒感染宿主范 围广，主要感染宿主包括人，禽，猪、马以及其他多种动物。而且其中一些毒株具有在多种动 物间传播的能力，例如引起人类历史上多起大流感流感的病原均可在人、猪之间传播。从 1989年和1990年发生于我国的马流感疫情中分离出的H3N8亚型的马流感毒株(A/马/吉 林/1/89)，该毒株的6个基因片段为禽源片段。2009年全球大流行的甲型Him流感病毒 是一个新型流感变异株，目前研究已经证明该毒株可自然感染猪、犬猫等哺乳动物。目前采用TaqMan探针荧光RT-PCR对流感病毒Hl和H3亚型进行快速分型检测已 经成为目前流感病毒快速检测筛查的首选方法。但TaqMan方法一般要求探针Tm值明显高 于引物Tm值，因此在设计引物探针时探针序列往往较长。但对于流感病毒，不同感染宿主 的病毒序列之间以及新型变异毒株与经典毒株的HA序列存在很大差异，这使得很多采用 长探针的Hl和H3核酸检测方法在检测不同来源的Hl和H3亚型病毒方面受到局限。采用短探针可有效解决毒株变异导致的Hl和H3亚型流感病毒分型方法通用性较 差的问题。但采用短探针必须在不改变序列的情况下提高探针的Tm值。近期，锁核酸 (locked nucleic acid，LNA)作为一种新颖的核苷酸衍生物在生物学研究领域引起了 人们的广泛关注，它是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2' -0， 4' -C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2' -0位和4' -C位通过不同的缩水 作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖 C3' _内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。对 DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。LNA和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定 性(ΔΤπι = 3 8°C )，具有抗3'脱氧核苷酸酶降解的稳定性，合成方法相对简单，部分或 完全修饰的LNA寡核酸链可用氨基磷酸法在DNA自动合成仪上合成。在通过对不同来源的Hl亚型流感病毒的HA基因进行序列比对的基础上，发现Hl 亚型流感病毒HA基因尾部存在12nt的保守区，适合通过LNA修饰后作为短探针用于荧光 RT-PCR 检测。但在对H3亚型流感病毒的HA基因进行序列比对时，发现可以利用14nt简并短探 针建立荧光RT-PCR方法，由于存在兼并碱基，因此采用在探针3'修饰MGB(Minor Groove
4Binder)来提高探针的Tm值。本发明首次将单重和双重基于LNA和MGB的短探针荧光RT-PCR技术应用于Hl和 H3亚型流感病毒检测，提供了针对Hl和H3亚型流感病毒的基于LNA和MGB的短探针、简并 引物和试剂盒。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测针对Hl和H3亚型流 感病毒核苷酸序列，包括引物序列和基于LNA和MGB的短探针序列。本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的检测Hl和H3亚型流感病毒的 单重和双重检测试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案选择Hl和H3亚型流感病毒HA基因编码区特定序列作为靶区域，在多重序列比对 的基础上，进行引物和探针设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50%-60%，引物 内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于 5°C。探针的长度在12 14个碱基左右，采用LNA或MGB修饰，并标记荧光基团。1组检测流感病毒Hl亚型的核苷酸序列，如下1)5，-CAG ATT YTG GCG ATC TAY TC-3' (SEQ ID NO 1)2)5，-GAC CCA TTA GAR CAC ATC CAG—3，(SEQ ID NO 2)Y代表嘧啶，此处为T或C ;R代表嘌呤，此处为A或G ；3)5，-[HEX]-CCCC AG GG AG AC-[TAMRA]-3，(SEQ ID NO 3)1组检测流感病毒H3亚型的核苷酸序列，如下4)5，-TGG ATT TCM TTY GCC ATA TCA T_3' (SEQ ID N 0 4)5)5，-GCA AAT GTT GCA YCT RAT RTT G_3，(SEQ ID NO 5)6)5，-[FAM] -TGG CAR GCC CAC AT_[MGB]_3，(SEQ ID NO 6)Y代表嘧啶，此处为T或C ;R代表嘌呤，此处为A或G ;M此处为A或C ；其中序列1)和2)分别为检测Hl亚型流感病毒HA基因的正义引物和反义引物， 序列3)为检测Hl亚型流感病毒HA基因的LNA修饰的荧光短探针，用斜体表示的碱基用 LNA进行修饰，即第5、7、9、11位的碱基用LNA进行修饰，探针的5’端标记报告荧光基团 HEX(5-hexachloro-荧光素)，3，端标记淬灭荧光基团TAMRA ；序列4)和5)分别为检测H3 亚型流感病毒HA基因的正义引物和反义引物，序列6)为检测H3亚型流感病毒HA基因的 MGB修饰的荧光短探针，探针的5’端标记报告荧光基团FAM(6-carb0Xy-荧光素)，3’端标 记MGB基团。我们采用TaqMan荧光PCR检测技术建立了 Hl和H3亚型流感病毒单重和双重检 测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg2+使用浓度的优化，引 物探针浓度的优化，得到以下试剂盒。检测Hl和H3亚型流感病毒单重和双重检测试剂盒，由以下组分组成1)裂解液购自INVITR0GEN公司，按15ml/瓶进行分装，2瓶/盒。2) RT-PCR反应液，表1为Hl单重反应液配方；表2为H3单重反应液配方；表3为检测Hl和H3的双重反应液配方。
表IHl单重反应液配方
权利要求
一组检测H1和H3亚型流感病毒的核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表SEQID NO1至SEQ ID NO6，其中序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分别为检测H1亚型流感病毒HA基因的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO3为检测H1亚型流感病毒HA基因的LNA修饰的荧光探针，序列SEQ ID NO4和SEQ ID NO5分别为检测H3亚型流感病毒HA基因的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO6为检测H3亚型流感病毒HA基因的荧光探针。
2.根据权利要求1所述的检测Hl和H3亚型流感病毒的核苷酸序列，其特征在于所 述探针序列SEQ ID NO 3的5，端标记报告荧光基团HEX，3，端标记淬灭荧光基团TAMRA， 第5、7、9、11位的碱基用LNA进行修饰。
3.根据权利要求1所述的检测Hl和H3亚型流感病毒的核苷酸序列，其特征在于所 述探针序列SEQ ID NO 6的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记MGB基团。
4.一种检测Hl和H3亚型流感病毒的试剂盒，由以下组分组成1)裂解液2)Hl亚型单重荧光RT-PCR反应液，包括PCR缓冲液、RT缓冲液、MgCL2、dNTP、Hl正义 引物、Hl反义引物和Hl荧光探针3)H3亚型单重荧光RT-PCR反应液，包括RT缓冲液、MgCL2,dNTP、H3正义引物、H3反 义引物和H3荧光探针4)Hl和H3双重荧光RT-PCR反应液，包括RT缓冲液、MgCL2、dNTP、Hl正义引物、Hl反 义引物、Hl荧光探针，H3正义引物、H3反义引物、H3荧光探针5)RT-PCR酶颗粒6)Taq DNA聚合酶7)DEPC水8)阴性对照流感病毒阴性组织样品，用0.01mol/L pH7. 2PBS缓冲盐水制成20%悬 液，70°C作用1小时；9)阳性对照为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQID No. 7和SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列；其中，Hl正义引物为序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，Hl反义引物为序列表SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，Hl荧光探针为序列表SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，其5’ 端标记报告荧光基团HEX，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA，第5、7、9、11位的碱基用LNA进行 修饰，H3正义引物为序列表SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列，H3反义引物为序列表SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列，H3荧光探针为序列表SEQID No. 6所示的核苷酸序列，其5’端标 记报告荧光基团FAM，3’端标记MGB基团。
5.根据权利要求4所述的检测Hl和H3亚型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述Hl 亚型单重荧光RT-PCR反应液包括0. 5 XPCR缓冲液、0. 5 X RT缓冲液、1. 5mmol/L MgCL2, 0. 2mmol/L dNTP、0. 3 μ mol/L Hl 正义引物、0. 3 μ mol/L Hl 反义引物和 0. 3 μ mol/L Hl 荧 光探针；所述H3亚型单重荧光RT-PCR反应液包括1 XRT缓冲液、4mmol/L MgCL2、0. 05mmol/L dNTP、0. 4ymol/L H3 正义引物、0. 4 μ mol/L Η3 反义引物和 0.2 μ mol/L H3 荧光探针；所述Hl和H3双重荧光RT-PCR反应液，包括1 XRT缓冲液、4mmol/LMgCL2、0. 05mmol/ L dNTP,0. 4 μ mol/L Hl 正义引物、0. 4 μ mol/L Hl 反义引物、 . 3 μ mol/L Hl 荧光探针、·0. 4ymol/L H3正义引物、0. 4 μ mol/L H3反义引物、0. 3 μ mol/L H3荧光探针。
全文摘要
本发明公开了一组检测H1和H3亚型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒。该检测H1和H3亚型流感病毒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1至SEQ ID NO6，其中序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2分别为检测H1亚型流感病毒HA基因的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO3为检测H1亚型流感病毒HA基因的LNA修饰的荧光探针，序列SEQ ID NO4和SEQ ID NO5分别为检测H3亚型流感病毒HA基因的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO6为检测H3亚型流感病毒HA基因的荧光探针。本发明进一步提供了含有上述引物和探针的检测H1和H3亚型流感病毒的试剂盒。本发明所述的试剂盒具有快速、灵敏、特异、通用性好、重复性好及不易污染的特点。
文档编号G01N21/64GK101962690SQ201010526978
公开日2011年2月2日 申请日期2010年11月1日 优先权日2010年11月1日
发明者乔彩霞, 刘环, 张伟, 张利峰, 张向东, 张鹤晓, 柏亚铎, 汪琳, 蒲静, 谷强, 高志强 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局