编码双峰驼β-干扰素的核苷酸序列、所编码的β-干扰素及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了编码双峰驼β-干扰素的核苷酸序列、所编码的β-干扰素及其应用，涉及基因工程【技术领域】。本发明的主要技术方案为：一种编码双峰驼β-干扰素的核苷酸序列，所述核苷酸序列是SEQ?ID?NO.1中第21-581位。或者，所述核苷酸序列在高严谨条件下与SEQ?ID?NO.1中第21-581位的核苷酸序列杂交且编码双峰驼β-干扰素。或者，所述核苷酸序列与SEQ?ID?NO.1中第21-581位的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码双峰驼β-干扰素。本发明实施例还提供一种双峰驼β-干扰素，由如上所述核苷酸序列编码。优选的双峰驼β-干扰素由序列表中SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸组成。
【专利说明】编码双峰驼β-干扰素的核苷酸序列、所编码的β-干扰素及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，特别是涉及一种编码双峰驼β -干扰素的核苷酸序列、所编码的β-干扰素及其应用。
【背景技术】
[0002]β_干扰素(Interferonbeta, IFN-β )是人和动物受到细菌、病毒、核苷酸等刺激物诱导下，由成纤维细胞、白细胞等产生的一种微量、高效的细胞因子。它具有抗病毒、抑制和杀伤肿瘤细胞、免疫调节等作用，主要用于多发性硬化症、肝炎或其它病毒性感染的治疗。
[0003]1957年Alicklssacs, IeanLindenmann利用鸡胚绒毛尿囊研究流感干扰现象时发现了一种能干扰病毒繁殖的具有高度生物学活性的糖蛋白，即干扰素。干扰素是人和动物受到适宜的刺激时产生的一种微量的、具有高度生物学活性的糖蛋白，它不能直接杀伤病毒，而是通过诱导宿主细胞产生数种酶，干扰病毒的基因转录或翻译，此外，干扰素还是一类调节细胞功能的激素类蛋白质，或者说是一类重要的细胞因子，可以进行免疫调节。
[0004]根据产生干扰素的细胞类型、干扰素的理化性质和生物学活性等方面的差异，可将干扰素分成三种，即α、β、Υ干扰素。IFN-β是由成纤维细胞产生的相对分子量20000的糖蛋白，主要参与抗病毒、抗肿瘤作用。JacobsLD等(1996)研究表明IFN-β是在细菌、病毒、多聚肌苷酸多聚胞苷酸(Poly-1C)、核苷酸等刺激物诱导下，主要由成纤维细胞、白细胞等产生的一种糖蛋白。IFN-β在ρΗ2的酸性条件下可以稳定存在，在65°C加热30min不失活，酸、碱、热的稳定性明显优于IFN-Y。曾芸等(2007)研究表明IFN-β因种属不同氨基酸序列也不同。猪与人、牛、马的IFN-β氨基酸同源性分别为65.1%、65.1%和66.1%。JacobsL等(1994)研究表明，IFN-β干扰素可在大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞中实现稳定高效的表达。1993年以来国外已批准多种重组IFN-β上市用于治疗多发性硬化症。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明实施例提供一种编码双峰驼干扰素的核苷酸序列，即提供双峰驼β -干扰素基因的cDNA序列，以及由该序列编码的β -干扰素。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案:
[0007]一方面，本发明实施例提供了一种编码双峰驼干扰素的核苷酸序列，
[0008]所述核苷酸序列是SEQ ID N0.1中第21-581位。
[0009]或者，所述核苷酸序列在高严谨条件下与SEQ ID N0.1中第21-581位的核苷酸序列杂交且编码双峰驼干扰素。
[0010]或者，所述核苷酸序列与SEQ ID N0.1中第21-581位的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码双峰驼干扰素。
[0011]另一方面，本发明实施例还提供一种双峰驼β-干扰素，由如上所述核苷酸序列编码。
[0012]优选的双峰驼β -干扰素由序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸组成。
[0013]或者，为序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加获得的衍生蛋白质。
[0014]另一方面，本发明实施例还提供一种重组表达载体，包含如上所述核苷酸序列，或编码如上所述蛋白质。
[0015]另一方面，本发明实施例还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的重组表达载体。
[0016]另一方面，本发明实施例还提供一种获取编码双峰驼β -干扰素的核苷酸序列的方法，该方法中:
[0017]PCR的正向引物为:
[0018]SEQ ID NO:3:5’ -ATGATCGACAGGTGCATCCTCCAAA-3’ ；反向引物为:
[0019]SEQ ID N0:4:5’-TTTGGAGGATGCACCTGTCGATCAT-3’。
[0020]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
[0021]由于骆驼同其他动物相比，生存在环境比较恶劣的沙漠之中，有较强的抗病毒及免疫调节等能力。β-干扰素又是人和动物受到细菌、病毒、核苷酸等刺激物诱导下产生的一种具有抗病毒、抑制和杀伤肿瘤细胞、免疫调节等作用的细胞因子。本发明对目标物种基因的CDS序列进行同源性比较并作进化树，为今后研究双峰驼β -干扰素提供基础资料。
[0022]本发明研究双峰驼的干扰素序列及进化树可以直观的表现出双峰驼干扰素序列与其他物种此蛋白序列的差异，为以后驼乳中干扰素的提取及食品及药品中的添加和进一步的生化研究提供实验数据，对研究干扰素抗病毒、抑制和杀伤肿瘤细胞、免疫调节等作用，对研究多发性硬化症、肝炎或其它病毒性感染的治疗有很大的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为实施例1中双峰驼β -干扰素基因RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
[0024]图2为构建系统发生树所用β -干扰素氨基酸同源性比较；
[0025]图3为不同物种β -干扰素氨基酸序列系统进化树。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
[0027]以下实施例中，所用百分比浓度如未特定指明，均为体积百分比浓度。
[0028]实施例1:双峰驼β - 干扰素基因cDNA序列的克隆
[0029]1、组织分离(Isolat1n)
[0030]从内蒙古阿拉善盟采得双峰驼，快速屠宰并取肝脏样，将组织样迅速放入液氮中冷冻后于_70°C保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。
[0031]2.总 RNA 的分离(Total RNA isolat1n)
[0032](I)提取RNA的准备工作
[0033]玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍，180°C烘烤4小时。
[0034]匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20-30分钟，再用0.1%的DEPC(焦碳酸二乙酯)水冲洗，由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0.5%的SDS(十二烷基硫酸钠)处理。
[0035]Tip头、EP管用0.1 %的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活。
[0036]双蒸水和溶液用DEPC处理，即每10ml水或溶液加0.1mlDEPC液，室温放置过夜，高压灭菌30分钟DEPC失活。
[0037](2)组织总RNA提取
[0038]取10mg在液氮中冻存的组织样放入有 Iml Trizol (trizal reagent, invitrogenBRL,USA)的匀浆器管中匀浆。4°C 12000g离心10分钟，吸取上清液，15-30°C温育5分钟，加0.2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒，15-30°C温育2_3分钟，4°C 12000g离心15分钟。吸取上清液，加0.8ml异丙醇，混合均匀。15-30°C温育10分钟，4°C 12000g离心10分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA。倒掉上清，加Iml 75v/v%Z醇洗涤RNA，4°C 7500g离心10分钟，自然干燥或真空干燥RNA。溶于水(RNase free)中分装，_70°C保存。
[0039](3)组织总RNA的鉴定
[0040]通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如下:电泳槽用RNA清洗液(10mM NaOH, ImM EDTA)浸泡4 一 5小时，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入I X TBE待用，琼脂糖凝胶用I X TBE配制。在1ul上样缓冲液(2 X TBE,13%菲可，0.1%溴酚兰，7M尿素)中加入Iul以上组织总RNA，65°C变性10分钟后立即放入冰水中2 - 3分钟，点样于琼脂糖凝胶中电泳。
[0041]3.全长 cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)
[0042](I)引物设计及合成
[0043]根据GenBanK 发表的人(Access1n No:AAC41702.1)、鼠(Access1nNo: AAI19398.1)、牛(Access1n No:ABX72063.1)等物种的 β -干扰素基因 mRNA 序列 ORF侧翼同源序列，设计如下引物用于以双峰驼肝脏组织中总RNA为模板的PCR扩增，以获得双峰马它β -干扰素基因cDNA序列。引物用Primer Premier 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID N0:3(正向)和SEQ ID N0:4(反向)，序列信息如下:
[0044]SEQ ID N0:3:5’ -ATGATCGACAGGTGCATCCTCCAAA-3’
[0045]SEQ ID N0:4:5’ -TTTGGAGGATGCACCTGTCGATCAT-3’
[0046](2) RT-PCR 扩增
[0047]按大连宝生物反转录试剂盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求进行反转录。反转录反应液组成:1ul 2XBca 1st Buffer, 4ul 25Mm MgS04, lul dNTP Mixture, 0.5ulRnase Inhibitor(40U/ul),lul BcaBEST Polymerase(22U/ul),lul Oligo dT Primer,lulRNA Sample, 1.5ul Rnase Free dH20，总体系为 20 ul。反转录反应条件:65°C I 分钟，30°C 5分钟(15分钟-30分钟内匀速升温)，65°C 25分钟，98°C 5分钟，5°C 5分钟。PCR扩增条件:97°C变性5分钟；95°C 30秒一55°C 30秒一72°C I分钟，如此进行30次循环；72°C延伸10分钟，4 °C保存。
[0048](3)克隆和测序
[0049]PCR扩增片段的回收。片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过程如下:尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入1.5mlEP管中。按每10mg琼脂糖加入300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分钟。将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，1000g离心I分钟，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul Wl液，1000g离心15秒。倒掉管中液体，在吸附柱中加入500ul Wl液，静置I分钟后，1000g离心15秒，倒掉管中液体。离心I分钟，将吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，静置I分钟后，1000g离心I分钟，EP管中液体即为回收的DNA。
[0050]回收片段同T载体的连接。连接用TaKaRa pMD18_T Vector试剂盒，操作过程如下:在 EP 管中制备下列连接反应液:pMD 18-T Vector (50ng/ul)0.5ul, DNA 20_40ng，Solut1n 15ul，加dH20至1ul。将上述反应液在16°C反应30分钟(过夜也可以)，产物用于转化感受态细胞。
[0051]质粒的转化。从一70°C冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。10ul感受态细胞加入1ul连接产物，冰浴30分钟。42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。加400ul液体LB培养基，37°C复活50分钟。取10ul铺于LB平板上，平板含0.1 % (V/V)的氨节青霉Amp (100mg/ml)，37°C恒温培养10-15小时。
[0052]转化菌落的PCR鉴定与培养。用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液(不含模板)的EP管中晃动，使单菌落充当模板。用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同Marker—起进行琼脂糖凝胶电泳(结果如附图1所示)，鉴别T载体上是否含有目的片段，若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40ml LB液体培养基中，先在液体中加入0.1 % (V/V)的青霉素钠(100mg/ml)，37°C过夜摇菌培养，用于质粒回收。
[0053]质粒的回收。质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下:将转化培养的菌液加入1.5mlEP管中，4000转/分钟离心，倒掉液体获细菌沉淀。细菌沉淀不够时可再加一次菌液离心。在细菌沉淀中加入250ulPl液，振荡悬浮。加入250ulP2液，温和摇匀，室温静置4分钟。加入350ul P3液，温和摇匀。离心10分钟，将上清液小心移入吸附柱，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，静置I分钟，离心15秒，倒掉液体。离心I分钟，将吸附柱放入一个干净的1.5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ul Tl液，静置I分钟后，离心I分钟，EP管中液体即为回收的质粒。
[0054]质粒的酶切鉴定。为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒，采用双酶切法鉴定。本研究具体操作如下:根据TaKaRa pMD18_T Vector图，选择内切酶Bam H I和Hin d III,保证目的片段中无这两种酶的切点。组成如下酶切反应体系:Bam H I lul, Hind III lul，10XK Buffer 2ul，DNA ≤ lul，加 dH20 至 20ul。30°C反应 3 小时，琼脂糖凝胶电泳检测。
[0055]重组质粒的测序。取20ul重组质粒于EP管中，封口膜密封，交生物技术公司测序。
[0056]实施例2:双峰驼β -干扰素基因编码序列同源性比较和系统发生树构建
[0057]1、双峰驼β -干扰素的序列信息与生物信息学分析
[0058]本发明新的双峰驼β -干扰素⑶S的长度为607 bp，详细序列见SEQ ID NO:1。电泳结果见附图1，其中21-23位为起始密码子ATG，579-581位为终止密码子TGA，21-581位为编码蛋白质区域(CDS)。根据全长CDS推导出双峰驼嗅觉感受器的氨基酸序列，共186个氨基酸残基，详见 SEQ ID N0:2,在线预测(http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)结果显示，其分子量为21906.57道尔顿，等电点(pi)为5.75。
[0059]2、β -干扰素基因编码序列系统发生树构建
[0060]在GenBank上搜索并获得人、鼠等八种物种的八条β _干扰素基因的编码蛋白序列，加上本发明获得的SEQ ID N0.2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树(见附图3)。结果显示:在所选的物种当中双峰驼β_干扰素基因同猪的亲缘关系最近。与袋鼠的亲缘关系最远。
[0061]双峰驼和人、鼠、牛等动物用Clustal X中对齐的β _干扰素基因编码氨基酸序列同源性比较结果见附图2。双峰驼β -干扰素氨基酸序列与人、鼠、牛等物种β -干扰素氨基酸序列相似性见表1。各物种干扰素的氨基酸个数及蛋白分子量见表2，各物种β-干扰素的氨基酸比例见表3。
[0062]表1:不同物种β -干扰素氨基酸序列相似性
[0063]
【权利要求】
1.一种编码双峰驼β-干扰素的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列是SEQ IDN0.1 中第 21-581 位。
2.一种编码双峰驼干扰素的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列在高严谨条件下与权利要求1所述的核苷酸序列杂交且编码双峰驼β-干扰素。
3.一种编码双峰驼干扰素的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列与权利要求I所述的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码双峰驼β -干扰素。
4.一种双峰驼干扰素，由权利要求1-3任一项所述核苷酸序列编码。
5.根据权利要求4所述的双峰驼β-干扰素，其特征在于，由序列表中SEQID ΝΟ:2所示的氨基酸组成。
6.一种双峰驼干扰素，其特征在于，为序列表中SEQ ID ΝΟ:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加获得的衍生蛋白质。
7.—种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述核苷酸序列，或编码权利要求4-6任一项所述蛋白质。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求7所述的重组表达载体。
9.获取编码双峰驼干扰素的核苷酸序列的方法，其特征在于: PCR的正向引物为: SEQ ID NO:3:5’ -ATGATCGACAGGTGCATCCTCCAAA-3’ ；反向引物为:
SEQ ID NO:4:5’ -TTTGGAGGATGCACCTGTCGATCAT-3’。
【文档编号】C07K14/565GK104178493SQ201410409778
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月19日 优先权日:2014年8月19日
【发明者】陈钢粮 申请人:新疆旺源驼奶实业有限公司