专利名称：一种流式细胞电融合仪的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种流式细胞电融合仪，属于生物医学技术领域。
背景技术：
电融合技术是上世纪80年代建立起来的一种新型促融合技术。1981年Zimmerman 发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念；1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。其基本原理是将两种细胞的混合液置于低压交流电场中，使细胞聚集成串珠状，然后施加高压电脉冲，以促使细胞融合。细胞融合的主要目的是研究异种细胞融合后基因重组的影响因素，产生杂交瘤细胞，以及植物和微生物细胞杂交育种等。通过几十年的发展，电融合技术已经日臻成熟，它的许多优点也越来越得到显现，表现在如下几个方面(1) 诱导细胞融合的频率是所有融合方法中最高的，比传统方法高出10-100倍，特别是对远缘细胞、难融合的细胞的融合具有较好的效果；(2)对细胞无毒害作用，优于化学融合和病毒介导的细胞融合；(3)适用范围广泛，动物、植物和微生物都可以用该技术进行细胞融合研允。尽管细胞电融合技术在育种、杂交研究和细胞克隆方面得到了成功应用，但是还存在一些问题，即细胞自由接触而导致的有效融合率低。在传统的电融合过程中，细胞在交流电场中形成串珠状排队是随意发生的，既两种相同的细胞也可排队，在接下来的直流电场中的融合就会发生多种情况，同种细胞融合以及两个以上细胞融合都会发生，而试验所需的异种细胞直接的融合所占比例就非常小。这样将导致随后的筛选工作非常复杂，严重地降低了试验效率。本发明可以有效的达到不同种细胞一对一融合，很好的解决了一上问题。细胞融合后，异种细胞融合子的检出也是关键一步，这直接关系到后续试验的效率。传统的筛选方法是通过选择性培养基筛选，如单克隆抗体制备中用HAT培养基来筛选融合子，微生物原生质体融合用两种不同抗药性的原生质体融合后用含有两种抗生素的培养基筛选，选择培养基法对于亲本细胞的要求都很高，要求有特殊筛选标记的亲本细胞。在原生质体融合育种中有通过核酸和蛋白质的不同性质进行双亲灭活，对一株亲本进行热灭活，另一株进行紫外线灭活，通过异种融合后活性发生互补来筛选，该方法的缺点是没有特异性假阳性率很高。活性荧光染料的使用使细胞融合后可实现大规模分选，该方法用红绿两种荧光染料染两株亲本，融合后通过流式细胞仪双通道检测双染细胞并把他们分选出来收集，但该方法会有大量的假阳性细胞出现，在电击过程中发生染料渗透会使大量未融合细胞呈双染状态。因此，现有的细胞融合技术以及设备无法实现大量特异性的细胞融合。
发明内容
本发明的技术解决问题克服传统细胞融合仪和融合方法的不足，将细胞一对一电融合芯片以及流式细胞仪巧妙的结合起来，可一次性连续完成细胞一对一电融合，融合后融合子可正确检出并将每个融合子分别培养。
本发明的技术解决方案一种流式细胞电融合仪，包括细胞一对一融合部分、融合细胞检出分选部分和单细胞收集部分；所述细胞一对一融合部分1包括细胞融合室2、多对平行的细胞定位通道3和细胞吸取通道4，在细胞电融合芯片1中间设有中空密闭的细胞融合室2，细胞融合室2两端分别为第一细胞加样孔6和第二细胞加样孔7 ；细胞融合室2两侧底部分布有多对平行的细胞定位通道3，每个细胞定位通道3与细胞吸取通道4连通，细胞吸取通道4逐级连通放大至末端开口延至上下两端的第一细胞吸取口 5和第二细胞吸取口 8 ；第一细胞加样孔6和第二细胞加样孔7及第一细胞吸取口 5和第二细胞吸取口 8分别通过软管与两种不同的细胞液连接，第一细胞吸取口 5和第二细胞吸取口 8分别与注射泵或电极连接；在注射泵的吸取作用下从第一细胞加样孔6和第二细胞加样孔7进入的细胞液向细胞融合室2流入，在一侧每个细胞定位通道3处吸取一个细胞；另一侧的细胞定位通道3吸取另一种细胞，细胞吸取完毕后，分别在细胞吸取通道4末端的第一细胞吸取口 5和第二细胞吸取口 8的电极加电，使细胞发生一对一的电融合，细胞融合后的混合细胞液被直接泵入流式细胞分选部分；所述融合细胞检出分选部分包括样品管9、鞘液罐10、喷嘴 12、激光器13、荧光检测器14、分光器15、集光器16、正电荷偏转板17、负电荷偏转板18、收集器19、补液口 26、计算机24、流速调节泵25和液滴充电器21 ；所述单细胞收集部分由培养板定位装置23和位于培养板定位装置23上的96孔板22组成；融合后的混合细胞液被泵入样品管9中，与鞘液罐10中的鞘液混合后进入照射室11，照射后从喷嘴12处喷出，由流速调节泵25调节流速；激光器13发出激发光使细胞中荧光染料激发出发射光，发射光由集光器16收集，被分光器15分成红绿荧光，然后由光检测器14收集，收集得到的细胞信号由计算机24进行放大、模数转换处理后传送到液滴充电器21，被充电；带电液滴携带细胞通过正电荷偏转板17、负电荷偏转板18而发生偏转，有两种荧光的细胞落入收集器19中， 此时位于收集器19上端的补液口 26将细胞培养液补充到收集器19中，并同时落入收集器 19下方的96孔板22中，之后调整培养板定位装置23，使下一个孔对准细胞收集器19，进行下一个融合子的收集。所述细胞融合室2的宽度为30-60 μ m,高度为30-60 μ m,长度为2cm。所述多个平行细胞定位通道3定位于细胞融合室2两侧底部的间隔为80-100 μ m， 每个定位通道横截面为边长3-10 μ m的正方形，通道长100-200 μ m。所述细胞吸取通道4逐级连通放大至末端开口的直径为l_2mm。所述第一细胞加样孔6和第二细胞加样孔7的直径为l_2mm。所述补液口 26为一个15ml试管，与软管连接并通过蠕动泵，控制流速使每次开启可放出200 μ 1培养液到收集器19中。所述培养板定位装置23前后和左右可调距离分别为10-20mm。所述补液口 26、收集器19和96孔板22的孔应对准。本发明与现有技术相比的优点在于(1)本发明将细胞一对一电融合部分以及流式细胞仪巧妙的结合起来，可一次性连续完成细胞一对一电融合，融合后融合子可正确检出并将每个融合子分别培养。(2)本发明的细胞融合室两侧的细胞定位通道分别吸附不同细胞，细胞完全可以特异性 配对，且配对率高，每次严格允许两个异种细胞发生融合。(3)本发明对流式细胞仪进行改进，通过调节细胞液流速可完成单个细胞分析和收集工作。(4)本发明设置培养板定位装置，方便于每个细胞收集到96孔板的一个孔中，大大方便后续工作。
图1为本发明的实现流程图；图2为本发明的细胞一对一融合部分的结构图；图3为本发明的融合细胞检出分选部分和单细胞收集部分结构图。1-细胞一对一融合部分、2-细胞融合室、3-细胞定位通道、4-细胞吸取通道、5-第一细胞吸取口、6_第一细胞加样孔、7-第二细胞加样孔、8-第二细胞吸取口、9_样品管、 10-鞘液罐、11-流动室、12-喷嘴、13-激光器、14-荧光检测器、15-分光镜、16-集光器、 17-正电荷偏转板、18-负电荷偏转板、19-收集器、20-废液收集器、21-液滴充电器、22-96 孔板、23-培养板定位装置、24-计算机、25-流速调节泵、26-补液口。
具体实施例方式如图1、2、3所示，本发明包括细胞一对一融合部分1，细胞一对一融合部分1为整体芯片，在整体芯片中设有中空密闭的细胞融合室2。细胞融合室2宽度为30-60 μ m,高度为30-60 μ m,长度为2cm。细胞融合室2两端分别为第一细胞加样孔6和第二细胞加样孔 7。细胞融合室2两侧底部分布有多个平行的细胞定位通道3。多个平行细胞定位通道3定位于细胞融合室2两侧底部的间隔为80-100 μ m,每个定位通道横截面为边长3-10 μ m的正方形,通道长100-200 μ m。细胞定位通道3与细胞吸取通道4连通，细胞吸取通道4末端为边长3-10 μ m的正方形与相同大小横截面的细胞定位通道3连接，另一末端与相邻的细胞吸取通道末端共同与横截面积加倍的横向通道连接，为通道的第一次加粗放大；该横向通道由相同截面积的纵向通道相连，两个相邻的纵向通道又通过横截面积加倍的横向通道连接，为第二次加粗放大；以此类推，经过5次放大后，与直接约Imm的细胞吸取口相连。细胞吸取通道4逐级连通放大至末端开口的直径为l_2mm。第一细胞加样孔6和第二细胞加样孔7的直径为l_2mm。第一细胞加样孔6和第二细胞加样孔7以及第一细胞吸取口 5和第二细胞吸取口 8分别与直径l_2mm软管连接。 第一细胞加样孔6和第二细胞加样孔7的软管与两种不同的细胞液连接。第一细胞吸取口 5和第二细胞吸取口 8与注射泵连接，也可连接电极。电融合后静置30min，第一细胞加样孔 6和第二细胞加样孔7分别吸出，进入流式细胞分析部分的样品管9与鞘液室10中的鞘液混合后进入流动室11，从喷嘴12处喷出，在流动室11和喷嘴12之间装有流速调节泵25， 目的是使喷嘴喷出的细胞速度可控。激光器13发出激发光使细胞中荧光染料激发出发射光，发射光由集光器16收集，被分光器15分成红绿荧光，然后由荧光检测器14收集。收集得到的细胞信号由计算机24处理，即首先对收集到的细胞信号进行放大，再经模-数转换器，再将模-数转换器后的细胞信号传送到液滴充电器21中进行细胞液滴充电。带电液滴携带细胞通过正电荷偏转板17、负电荷偏转板18而发生偏转，有两种荧光的细胞落入收集器19中，未被收集的细胞则落入于收集器19相邻的废液收集器20。此时，位于收集器19上端的补液口 26将200 μ 1细胞培养液补充到收集器19中，补液口 26为一个15ml试管， 与软管连接并通过蠕动泵，控制流速使每次开启可放出200 μ 1培养液到收集器19中。补液口 26将200 μ 1细胞培养液补充到收集器19中的同时落入收集器下方的96孔板22中， 之后调整培养板定位装置23，进行下一个融合子的收集。培养板定位装置23前后和左右可调距离分别为10-20mm。补液口 26、收集器19和96孔板22的孔应对准。 本发明的原理及使用方法如下(以K562细胞和CHO细胞配对和融合为例)(1)将整体芯片正置于试验台上，将第一细胞加样孔6连接的直接Imm软管放入 K562细胞悬液中。将第二细胞加样孔7和第二细胞吸取口 8连接的小软管封死。第一细胞吸取口 5的软管连接注射泵，开启注射泵将K562细胞(红色荧光)吸入细胞融合室2，持续一段时间后大量细胞吸附在与第一细胞吸取口 5连接的细胞定位通道3末端并保持较大的流速使细胞达到稳定吸附。(2)将第一细胞加样孔6的软管放入无细胞电融合液中，第二细胞加样孔7软管连接注射泵，以较小的流速将细胞融合室2中未吸附的细胞洗出。停止。(3)将第二细胞加样孔7连接的直接Imm软管放入CHO细胞(绿色荧光)悬液中。 将第一细胞加样孔6连接的小软管封死。第二细胞吸取口 8的软管连接注射泵，开启注射泵将CHO细胞吸入细胞融合室2，持续一段时间后大量细胞吸附在与第二细胞吸取口 8连接的细胞定位通道3末端并保持较大的流速使细胞达到稳定吸附。(4)将第二细胞加样孔7的软管放入无细胞电融合液中，第一细胞加样孔6软管连接注射泵，以较小的流速将细胞融合室2中未吸附的细胞洗出。停止后将第一细胞加样孔 6封死。 (5)将第一细胞吸取口 5和第二细胞吸取口 8连接的电极与电源接通，在交流电的作用下使两侧细胞定位通道上吸附的不同细胞更加靠近，在直流电作用下使两个细胞发生融合。(6)融合后细胞在细胞融合室3中静置30min后从两侧的第一细胞加样孔6或第二细胞加样孔7吸出，进行下一步的筛选和分析。(7)融合后的混合细胞液被泵入流式细胞分析部分的样品管9，然后与鞘液室10 中的鞘液混合后进入流动室11，从喷嘴12处喷出.。(8)激光器13发出激发光使K562细胞和CHO细胞中荧光染料激发出发射光，发射光由集光器16收集，被分光器15分成红绿荧光，然后由光电倍增管检测器14收集。(9)收集得到的细胞信号由计算机24进行放大、模数转换处理后传送到液滴充电器21，被充电。带电液滴携带细胞通过正、负偏转电极板17和18而发生偏转，有两种荧光的细胞落入收集器19中。(10)位于收集器19上端的补液口 26将200 μ 1细胞培养液补充到收集器19中， 并同时落入收集器下方的96孔板22中。(11)调整培养板定位装置23，使下一个孔对准细胞收集器19，进行下一个融合子的收集。本发明不仅限于上述两种细胞，可以通过修改细胞定位通道和细胞融合室的大小适用于不同大小的细胞之间的融合。本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。
权利要求
1.一种流式细胞电融合仪，其特征在于包括细胞一对一融合部分、融合细胞检出分选部分和单细胞收集部分；所述细胞一对一融合部分(1)包括细胞融合室(2)、多对平行的细胞定位通道(3)和细胞吸取通道(4)，在细胞电融合芯片(1)中间设有中空密闭的细胞融合室(2)，细胞融合室(2)两端分别为第一细胞加样孔(6)和第二细胞加样孔(7)；细胞融合室(2)两侧底部分布有多对平行的细胞定位通道(3)，每个细胞定位通道(3)与细胞吸取通道(4)连通，细胞吸取通道(4)逐级连通放大至末端开口延至上下两端的第一细胞吸取口(5)和第二细胞吸取口(8)；第一细胞加样孔(6)和第二细胞加样孔(7)及第一细胞吸取口(5)和第二细胞吸取口(8)分别通过软管与两种不同的细胞液连接，第一细胞吸取口(5)和第二细胞吸取口(8)分别与注射泵或电极连接；在注射泵的吸取作用下从第一细胞加样孔(6)和第二细胞加样孔(7)进入的细胞液向细胞融合室(2)流入，在一侧每个细胞定位通道(3)处吸取一个细胞；另一侧的细胞定位通道(3)吸取另一种细胞，细胞吸取完毕后，分别在细胞吸取通道(4)末端的第一细胞吸取口(5)和第二细胞吸取口(8)的电极加电，使细胞发生一对一的电融合，细胞融合后的混合细胞液被直接泵入流式细胞分选部分；所述融合细胞检出分选部分包括样品管(9)、鞘液罐(10)、喷嘴(12)、激光器(13)、荧光检测器(14)、分光器(15)、集光器(16)、正电荷偏转板(17)、负电荷偏转板(18)、收集器 (19)、补液口(26)、计算机(24)、流速调节泵(25)和液滴充电器(21)；所述单细胞收集部分由培养板定位装置(23)和位于培养板定位装置(23)上的96孔板(22)组成；融合后的混合细胞液被泵入样品管(9)中，与鞘液罐(10)中的鞘液混合后进入照射室(11)，照射后从喷嘴(12)处喷出，由流速调节泵(25)调节流速；激光器(13)发出激发光使细胞中荧光染料激发出发射光，发射光由集光器(16)收集，被分光器(15)分成红绿荧光，然后由光检测器(14)收集，收集得到的细胞信号由计算机(24)进行放大、模数转换处理后传送到液滴充电器(21)中被充电；带电液滴携带细胞通过正电荷偏转板(17)、负电荷偏转板(18)而发生偏转，有两种荧光的细胞落入收集器(19)中，此时位于收集器(19)上端的补液口(26) 将细胞培养液补充到收集器(19)中，并同时落入收集器(19)下方的96孔板(22)中，之后调整培养板定位装置(23)，使下一个孔对准细胞收集器(19)，进行下一个融合子的收集。
2.根据权利要求1所述的流式细胞电融合仪，其特征在于所述细胞融合室(2)的宽度为30-60 μ m,高度为30-60 μ m,长度为2cm。
3.根据权利要求1所述的流式细胞电融合仪，其特征在于所述多个平行细胞定位通道(3)定位于细胞融合室(2)两侧底部的间隔为80-100 μ m，每个定位通道横截面为边长 3-10 μ m的正方形，通道长100-200 μ m。
4.根据权利要求1所述的流式细胞电融合仪，其特征在于所述细胞吸取通道(4)逐级连通放大至末端开口的直径为l_2mm。
5.根据权利要求1所述的流式细胞电融合仪，其特征在于所述第一细胞加样孔(6) 和第二细胞加样孔(7)的直径为l_2mm。
6.根据权利要求1所述的流式细胞电融合仪，其特征在于所述补液口(26)为一个 15ml试管，与软管连接并通过蠕动泵，控制流速使每次开启可放出200 μ 1培养液到收集器 (19)中。
7.根据权利要求1所述的流式细胞电融合仪，其特征在于所述培养板定位装置(23) 前后和左右可调距离分别为10-20mm。
8.根据权利要求1所述的流式细胞电融合仪，其特征在于所述补液口(26)、收集器 (19)和96孔板(22)的孔应对准。
全文摘要
一种流式细胞电融合仪包括细胞一对一融合部分、融合细胞检出分选部分和单细胞收集部分；细胞一对一融合部分上设有多对平行的细胞定位通道，通道末端可吸附不同的细胞，在电流作用下两种细胞可靠近并发生融合。融合后细胞经放置质膜完全融合后，进入融合细胞检出分选部分，融合细胞检出分选部分主要由激光光源、荧光检测器和偏转板构成，发生融合的细胞既红绿荧光双染的细胞被收集到收集管，每收集一个细胞，检测器液滴将停止流动，安装于收集管上部的细胞培养液贮存器向收集管加入200μl细胞培养液，200μl细胞培养液使收集管末端打开，液体进入下方96孔板的一个孔中。此时，流动室液体继续开启，将下一个融合细胞放入96孔板下一孔中。本发明可一次性连续完成细胞一对一电融合，融合后融合子可正确检出并将每个融合子分别培养。
文档编号C12M1/42GK102206580SQ20111007496
公开日2011年10月5日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者刘姚萍, 孙艳, 崔绍艳, 樊瑜波, 王玮 申请人:北京大学, 北京航空航天大学