专利名称：一种抗白细胞介素-8抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗白细胞介素-8抗体。
背景技术：
抗体(antibody)是机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、 可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。如图1所示，抗体结构根据功能可分解成几种形式全抗体(IgG)、抗原结合片段 (antigen-binding fragment, Fab)和单链抗体(scFv)，每种抗体均包括重链(H链)和轻链(L链)。重链和轻链上有可变区，可变区由相互交替的4个框架区(FRs)和3个高变区 (CDRs)组成。框架区的氨基酸序列相对保守，高变区的氨基酸组成和排列顺序更易发生变化，决定了抗体结合抗原的特异性。IgG和Fab上还有恒定区，在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。抗体-抗原反应是一种独特的蛋白质-蛋白质相互作用。研究蛋白质-蛋白质相互作用最常用的方法之一是由Fields及其同事发明的酵母双杂交技术(Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, McCafferty J, Griffiths AD, Winter G. (1991) J Mol Biol. 222 :581-597. ) (Fields，S and Song, 0. (1989)Nature 340:245-247·)， 这项技术只需要DNA序列而非蛋白质就能确定结合的部分(Bartel PL, Fields S(ed.) (1997) "The Yeast Two-Hybrid System(Advances in Molecular Biology)" Oxford University Press. ) (Zhu L and Hannon (ed. ) (2000)"Yeast Hybrid Technologies^aton Publishing，Natick，MA.) (Fields S, Sternglanz R. (1994) Trends Genet. 10:286-292·)。 酵母双杂交技术的原理是利用相互作用的二个蛋白质组分使与该二组分融合的转录因子结合并激活核报告基因的转录，使该技术广泛应用于研究蛋白质-蛋白质相互作用 (De Jaeger G, et al (1997)FEBS Lett. 403 :116-122. ) (Tavladoraki P, Benvenuto Ε, Trinca S, De Martinis D, Cattaneo A, Galeffi P. (2000)Nature. 366 :469-472.), ^clfi
(intrabodies)白勺(Visintin Μ, Tse Ε, Axelson H, Rabbitts ΤΗ, Cattaneo Α. (1999)Proc Natl Acad Sci USA. 96 :11723-11728.)(De Jaeger G, Fiers Ε, Eeckhout D,Depicker Α. (2000)FEBS Lett. 467 :316-320.) (Portner-Taliana A,Russell Μ,Froning KJ,Budworth PR,Comiskey JD,Hoeffler JP. (2000) J Immunol Methods. 238 :161—172.)。白细胞介素-8 (Interleukin-8,或称IL-8)是CXC趋化因子(Chemokine)家族中一员。已知IL-8是一种嗜中性粒细胞(Neutrophil)的强烈趋化及激活因子Gchroder JM,Mrowietz U,Morita E,Christophers Ε. (1987)JImmunol. 139 :3474-3483.) (Peveri P, Walz A, Dewald B, Baggiolini Μ. (1988) J Exp Med. 167 :1547-1559.)。目前认为 IL-8 能强力地汇集并激活嗜中性粒细胞，在许多生理和病理过程中都有广泛的生物活性Gchall TJ,Bacon KB. (1994) Curr Opin Immunol. 6 :865-873.)。过量的 IL-8 能造成炎症等自身免疫疾病(Baggiolini M, Clark-Lewis I. (1992)FEBS Lett. 307 :97-101)。IL-8 可由多种参与炎症反应的细胞分泌而产生，如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、内皮细胞、角质化细胞等等，继而作用于内皮细胞、嗜中性粒细胞和T淋巴细胞等多种炎症相关的细胞，从而形成炎症反应。很多人类疾病与体内IL-8表达和分泌的异常或过量、失衡有关。中国专利200410089202. 4公开了一种具有中和白细胞介素-8 (IL-8)生物活性的单克隆抗体以及该单克隆抗体的可变区序列。该专利以IL-8为免疫源，以小鼠为免疫对象，通过免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾脏制备悬液，并使之与骨髓瘤细胞进行细胞融合获得可表达抗IL-8单克隆抗体的杂交瘤细胞株以制备抗IL-8单克隆抗体。中国专利申请01813639. 7公开了一种在酵母中生产抗体文库以及筛选抗体的方法，在酵母细胞中表达试验蛋白质文库，该试验融合蛋白质包含在文库内序列变异的第一多肽亚基，在文库内其序列独立于第一多肽亚基变异的第二多肽亚基，和一个连接第一和第二多肽亚基的接头肽；在表达试验蛋白质的酵母细胞中表达一种或多种靶融合蛋白质， 每种靶融合蛋白质包含一个靶肽或蛋白质；和筛选那些表达报道基因的酵母细胞，该报道基因的表达被试验融合蛋白质结合到靶融合蛋白质上所激活。
发明内容
本发明提供了一种特异性高的抗白细胞介素-8抗体。一种抗白细胞介素-8抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区中的3 个高变区 CDRHl、CDRH2、CDRH3 的氨基酸序列分别为 GFSFSSFEM、YISKSGFTIYYADSVKG, SSffAQDFDffLLPFDff ；其轻链可变区中3个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为 RASQGIRNYLA、AASTLQS、QKYNSVPF。一种抗白细胞介素-8抗体，其重链可变区具有SEQ ID NO. 5所述的氨基酸序列； 所述的轻链可变区具有SEQ ID NO. 6所述的氨基酸序列。上述抗体可以是全抗体、抗体片段或单链抗体。本发明还提供了一种编码上述人白细胞介素-8抗体的基因，编码重链可变区和轻链可变区的DNA序列分别如SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示。上述抗体可应用于制备用于治疗与人白细胞介素-8表达和分泌异常、过量或失控相关的疾病的药物。本发明抗白细胞介素-8抗体特异性高，制备过程相对简单，成本低廉。
图1为抗体3种类型的结构示意图；图2为本发明单链抗体的结构示意图；图3为本发明#IL-8_31抗体特异性测试抗体浓度与OD450关系曲线图；图4为本发明#IL-8_21抗体特异性测试抗体浓度与OD450关系曲线图；图5为本发明#IL-8_31抗体浓度与IL8趋向抑制率的关系曲线图；图6为本发明#IL-8_21抗体浓度与IL8趋向抑制率的关系曲线图。
具体实施例方式本发明采用专利申请01813639. 7公开的方法构建人单链抗体文库，并在人单链抗体文库中筛选IL-8抗体，具体实施过程如下实施例1逆转录和扩增得到人抗体重链和轻链DNA以来自人骨髓、人胎肝、人脾和人外周血白细胞的polyA+RNA(购自Clontech)为模板，并使用从Clontech购得的逆向转录酶试剂盒，以oligo(dT)和随机引物(random primers)为引物，根据Clontech试剂盒所提供的方法指南，将polyA+RNA逆向转录成 cDNA。以上述cDNA为模板，使用一系列识别人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的引物，应用PCR法扩增人抗体中所有的重链和轻链的可变区。一系列识别人抗体重链和轻链可变区基因的引物序列如下第1组人抗体重链可变区(VH)基因的5’ -端引物
C(C/T)
GG
GGVHlb:5，-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC (C/G)G
VH2b:5，-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA
VH3b:5，-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTACAGCAGTGG G
VH4b :5，-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GAG GTG CAG CTG(G/T)TG GAG(A/T)
VH5b :5，-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTC CAGCT(G/T)GT(A/G)CAG TCT
VH6b VH7b
-CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG (A/G)TC ACCTTG AAG GAG TCT G -CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC CAG GTG CAG CTGGTG(C/G)A(A/G) TCT第2组人抗体重链可变区(VH)基因的3’ -端引物
VHlf:5，-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA GGAGAC(A/G)GT GAC CAG GGT G
VH2f:5，-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA GGAGACGGTGAC CAG GGT T
VH3f:5，-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA AGAGACGGTGAC CAT TGT
VH4f:5，-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC TGA GGAGACGGTGAC CGT GGT CC
VH5f:5，-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC GGT TGGGGCGGATGC ACT CC
VH6f:5，-GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC (C/G)GATGGGCCCTT GGT GGA(A/G)GC
第3组人抗体λ-轻链可变区(V λ)基因的5’ -端引物
VLlb:5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG TCT GT(C/G)(C/G/T)TG ACG CAGCCG CC
VL2b:5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TAT G(A/T)GCTG AC(A/T)CAG CCA
C
T)A CC GAG CC CC (A/C)CCVL7b
VL3b :5’-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TAT GAG CTGA(C/T)(A/G)CAG C(C/
VL4b VL5b
:5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG CCT GTG CTGACT CA(A/G) (C/T)C :5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG (A/G/T) CT GTGGTG AC (C/T) CAG
VL6b 5 -GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG CC(A/T)G(G/T)G CTG ACT CAG
:5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT TCC TCT GAG CTGA(C/G)T CAG GA(C/CN 102199209 A
说明书
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G) CC CCT TCT CC TCT CC T)CT CC
VL8b 5' -GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT CAG TCT G(C/T) (C/T)CTGA(C/T)T CAG
VL9b :5， -GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT AAT TTT ATG CTGACT CAG CCC C 第4组人抗体λ-轻链可变区(V λ)基因的3’ -端引物
VLlf 5' -GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TAG GAC GGT(C/G)A(C/G)CTT GGT CC VL2f :5，-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA GAG GAC GGT CAGCTG GGT GC 第5组人抗体κ-轻链可变区(VK)基因的5’ -端引物
VKlb :5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAC ATC C(A/G)G(A/G/T)TG ACC CAG
VK2b :5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAA ATT GT(A/G) (A/T)TG AC(A/G)CAG
VK3b 5，-GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAT ATT GTG(A/C)TG AC (C/G/T)CAG(A/
VK4b :5， -GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT GAAACG ACA CTCACG CAG TCT C
第6组人抗体κ-轻链可变区(VK)基因的3’ -端引物
VKlf 5' -GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT TTC CACCTT GGT CC
VK2f 5' -GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT CTCCA(C/G)CTT GGT CC
VK3f :5，-GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT GAT ATC CACTTT GGT CC
VK4f :5’ -GGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA TTT AAT CTC CAGTCG TGT CC
PCR法扩增人抗体中的重链可变区(VH)时应用上述第1组引物与第2组引物的组
合，即有42个PCR反应；类似地，扩增人抗体中的λ轻链可变区(V λ)时应用上述第3组引物与第4组引物的组合，即有18个PCR反应；扩增人抗体中的κ轻链可变区(Vk)时应用上述第5组引物与第6组引物的组合，即有16个PCR反应。第1组引物中包含有酵母双杂交载体pACT2 (Hua SB, Luo Y，Qiu Μ, Chan Ε, Zhou H, Zhu L. (1998)Gene. 215 :143-152.)(Hua SB, Qiu M, Chan E, Zhu L, Luo Y. (1997) Plasmid. 38 :91-96.)多克隆位点上游的同源序列(下划线部分)；第4组和第6组引物中包含有与酵母双杂交载体PACT2多克隆位点下游的同源序列(下划线部分)；而第2组、第 3组和第5组引物中包含有连接肽(linker)的序列(下划线部分)。连接肽用于连接抗体的重链和轻链的可变区。PCR法扩增人抗体中所有的重链和轻链可变区的反应条件如下5. 0 μ 1 PCR 缓冲液(IOx)1. 0μ 1 3，-端引物(ΙΟμΜ)1· 0μ 1 5，-端引物(ΙΟμΜ)5· 0 μ 1 cDNA 底物1. 0μ 1 dNTP(IOmM)36 μ 1 7jC1. 0 单位 Taq 聚合酶(Clontech 生产)将上述各组分混合均勻后置于PCR仪(Applied BioSystems公司)中进行反应。
6PCR反应的参数为解链94°C，1分钟、退火50°C，1分钟、延伸72°C，2. 5分钟、循环30次。实施例2连接载体多克隆位点的同源序列和连接肽序列以实施例1中所述PCR所得的人抗体重链可变区DNA为模板，以引物7和引物8分别为上游引物和下游引物，采用PCR法进行扩增，反应条件同上。引物7序列为载体pACT2 多克隆位点的上游同源序列，引物8序列为连接肽反链序列。弓丨物7(pACT2多克隆位点上游同源序列)5' -ACC CCA CCA AAC CCA AAA AAA GAG ATC TGT ATG GCTTAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC引物8(连接肽反链序列)5' -ACT GCC TCC ACC ACC GCT GCC ACC TCC GCC AGA TCCTCC GCC GCC TGA TCC ACC ACC GCC以实施例1中所述PCR所得的人抗体轻链可变区DNA为模板，以引物9和引物10 分别为下游引物和上游引物，采用PCR法进行扩增，反应条件同上。引物9为载体pACT2多克隆位点的下游同源序列，引物10为连接肽顺链序列。引物9(pACT2多克隆位点下游同源序列)5' -GAG ATG GTG CAC GAT GCA CAG TTG AAG TGA ACT TGCGGG GTT TTT CAG TAT CTA CGA弓丨物10(连接肽顺链序列)5' -GGC GGT GGT GGA TCA GGC GGC GGA GGA TCT GGC GGAGGT GGC AGC GGT GGT GGA GGC AGT实施例3将人抗体重链和轻链DNA通过连接肽序列连接成单链抗体将实施例2中PCR扩增得到的含载体pACT2多克隆位点的同源序列和连接肽序列的人抗体重链可变区DNA和轻链可变区DNA混合。以该混合DNA为模板，以引物7和引物 9分别为上游引物和下游引物，进行PCR扩增，得到包括人抗体重链DNA序列、轻链DNA序列、载体PACT2多克隆位点同源序列以及连接肽DNA序列的单链抗体(scFv)DNA，反应条件同实施例1实施例4构建人单链抗体(scFv)基因文库上述实施例3所述的单链抗体(scFv)DNA两侧接有酵母双杂交载体 pACT2 (Clontech公司生产)多克隆位点两侧的同源序列。将上述实施例3所述的单链抗体(scFv)DNA与经限制性内切酶(Bam HI和Eco RI)处理后的酵母双杂交载体pACT2按照 Clontech公司提供的方法(Yeast Protocol Handbook，PT3024-1)将其共同转化进入酵母菌株丫187(基因型獻丁0 ura3-52,his3-200,ade2-101,lys2-801,trpl-901,leu2-3,112， gal4，gal80, URA3: GALlUAS-GALlTATA-IacZ)内，经细胞内同源重组后将单链抗体(scFv) DNA整合到pACT2载体上，从而得到酵母双杂交单链抗体(scFv)文库。单链抗体(scFv)DNA 片段与pACT2载体上的激活区域(Activation Domain, AD)融合在一起。为检查这个人单链抗体(scFv)文库的质量，随机挑出了 30个克隆。对插入片段测序分析表明所有克隆都包括与融合在一起的单链抗体(scFv)DNA片段(数据未显示)，而且所有单链抗体(scFv)DNA序列都是独特的。上述经同源重组而得到酵母双杂交单链抗体(scFv)基因文库中抗体DNA拷贝数大约有1 X IO8个，可应用于酵母双杂交技术筛选特定的抗体。实施例5筛选抗体将编码人IL-8的DNA克隆进入载体pGBKT7 (Clontech公司)构建出pGBK_IL_8。 pGBK-IL-8 编码 Gal4DNA 结合区域(Binding Domain, BD)并融合在人 IL-8 的 N 端。在编码人IL-8的DNA序列得到验证后，pGBK_IL_8质粒DNA转化进酵母菌株 AH109(基因型 MATa， ura3-52， his3-200， ade2-101， trpl-901， leu2-3， 112， gal4, gal80, LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2， URA3: :MELlUAS-MELlTATA-lacZ) (Clontech 公司)。带有 pGBK_IL_8 质粒的 AH109 酵母可在不含色氨酸的合成培养基(SD/-W)上生长。将等量的含有pGBK-IL-8的MAI1a型酵母细胞(AH109菌株)与包含单链抗体 (scFv)基因文库的ΜΑΤ α型酵母细胞(Υ187菌株)进行共同培养时，此二型细胞即可交配
社a
？口口。载有单链抗体(scFv)文库的pACT2载体含有LEU2基因，pGBK_IL_8包含TRPl 基因。包含上述两种质粒的酵母细胞可以生长在不含亮氨酸和丝氨酸的酵母合成培养基 (SD/-LW)。存在scFv/IL-8相互作用的细胞会激活整合在菌株基因组中的报告基因ADE2 和HIS3，从而使得酵母细胞可以生长在缺乏腺嘌呤，组氨酸，亮氨酸和色氨酸的培养基 (SD/-AHLW)上，并在该平板培养基上形成菌落。在上述筛选培养基(SD/-AHLW)上总共挑选出20个菌落。然后对这些菌落作进一步的分析。首先，按Clontech公司的方法使用β半乳糖苷酶检测法检测IacZ表达。存在 scFv/IL-8相互作用的细胞也会激活整合在菌株基因组中的另一报告基因lacZ，从而能测得酵母细胞内表达的β半乳糖苷酶。检测酵母细胞β半乳糖苷酶的方法如下(1)上述酵母在筛选培养基(SD/-AHLW)平板上生长。(2)将存活的酵母菌落转移到Whatman五号滤纸上。(3)将带有酵母细胞菌落的滤纸浸入液氮之中，使细胞破裂。(4)将滤纸从液氮中取出，并置于30°C的烘箱内。(5)重复步骤3和4 二次。(6)将滤纸铺于适量的X-gal溶液中，并置于37°C的温箱内约15分钟。若带有菌落处显示蓝色，表明为β半乳糖苷酶阳性。X-gal溶液配方如下16. lg/L5. 50g/L0. 75g/L0. 246g/L
Na2HPO4 · 7H20 NaH2PO4 · H2O
KCl
MgSO4 · 7H2035mg/L X-gal (5_ 溴 _4_ 氯 _3_ 吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷)5mMβ-巯基乙醇ρΗ 7. 0检测结果上述挑选出的20个菌落中有12个是β半乳糖苷酶阳性的，表明在这些菌落的细胞内另一报告基因IacZ也被激活了。
其次，对上述12个β半乳糖苷酶阳性菌落的scFv进行特异性分析，以确定scFv 是否特异性地与IL-8部分结合，而不是与其它部分。将含有scFv基因的pACT2质粒DNA 从上述12个β半乳糖苷酶阳性的酵母中提取出来。并分别与pGBKT空载体，或与含有编码融合&114-DNA结合区(BD)和人核纤层蛋白C编码序列的质粒pGBKT-Lam (Clontech公司)，共同转化到AH109酵母细胞内。转化后的酵母细胞先铺于平板培养基(SD/-LW)上生长，然后转移到平板培养基(SD/-AHLW)上，并进一步使用β半乳糖苷酶分析。经上述方法对scFv进行特异性分析后，得到3个对人IL-8具有特异性的单链抗体(scFv)ο最后，对上述3个对人IL-8具有特异性的单链抗体(scFv)进行测序分析，使用 ABI自动测序仪测定scFv的DNA序列。分析这些单链抗体(scFv)克隆的DNA序列发现有二个不同的抗人白细胞介素_8 的单链抗体(scFv)。其中与克隆号#IL-8-31相同的有2个，另一个为克隆号#IL-8-21。克隆号#IL-8_31的单链抗体重链(VH)可变区的氨基酸序列如SEQ IDN0. 1所示， 单链抗体重链(VL)可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；编码克隆号#IL_8_31的单链抗体重链(VH)可变区的DNA序列如SEQ IDN0. 3所示，编码克隆号#IL_8_31的单链抗体轻链(VL)可变区的DNA序列如SEQ ID NO. 4所示。#IL-8-31的单链抗体重链(VH)可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO. 1)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYffSfflRQPPGKGLEfflGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTI SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHDYYDFffSGYYDAFDIffGQGTMVTVSS下划线部分依次为重链可变区中的三个高变区⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3的氨基酸序列。#IL-8-31的单链抗体轻链(VL)可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)QSALIQPASVSGPPGQSITISCTGSSSDVGDYYYVSffYQQHPGKAPKLLIYDVNYRPSGVSSRFSGSKS
GNTASLTIsglqaedeadyycssyrdtqilgvfgggtkltvl下划线部分依次为轻链可变区中的三个高变区⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3的氨基酸序列。克隆号#IL-8_21的单链抗体重链(VH)可变区的氨基酸序列如SEQ IDN0. 5所示， 单链抗体重链(VL)可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示；编码克隆号#IL_8_21的单链抗体重链(VH)可变区的DNA序列如SEQ IDN0. 7所示，编码单链抗体轻链(VL)可变区的 DNA序列如SEQ ID N0. 8所示。#IL-8-21的单链抗体重链(VH)可变区的氨基酸序列(SEQ ID N0. 5)EVQLLETGGGLVQPGGSLRLSCSASGFSFSSFEMNffVRQAPGKGLEffLSYISKSGFTIYYADSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSSffAQDFDffLLPFDffffGQGTLVTVSS下划线部分依次为重链可变区中的三个高变区⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3的氨基酸序列。#IL-8-21的单链抗体轻链(VL)可变区的氨基酸序列(SEQ ID N0. 6)ETTLTQSPSSVSAYVGDRVTITCRASQGIRNYLAffYQQKPGKVPNLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSET DFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSVPFTFGPGTKVDIK下划线部分依次为轻链可变区中的三个高变区⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3的氨基酸序列。 实施例6抗体表达与纯化将实施例5中筛选得到的抗人IL-8的单链抗体(scFv)DNA克隆到蛋白质表达载体中 pET27b (+) (Novagen 公司)而得到 pET27b_aIL_8。克隆后的 pET27b_aIL_8 在 scFv 的 N 端是PelB序列(可将表达后的scFv蛋白质分泌到表达细菌E. coli的周质腔(periplasmic space)中)，而C端含有一段编码HSV标记物和一个6x His (组氨酸)标记物(可用于蛋白质的纯化)的序列。将pET27b-aIL-8转化入蛋白质表达细菌E. coli菌株BL21DE3 (Novagen 公司)。并按照该公司提供的方法用IPTG(浓度0. 5mM)诱导表达和分离抗人IL-8的单链抗体scFv蛋白质。因为scFv蛋白质的C端含有一个6x His标记物，我们可以应用Qiagen公司所提供的方法方便地用Ni-NTA柱Oliagen公司)来纯化scFv蛋白质。纯化前后蛋白质用 SDS-PAGE凝胶电泳分析。实施例7酶标免疫法(ELISA)测试抗IL_8的scFv特性我们测试了纯化后的抗IL-8单链抗体的特性。第一个特性是用酶标免疫法 (ELISA)测定抗体与IL-8的免疫亲和。重组人IL-8的蛋白质购自Pierce公司。用于酶标免疫法(ELISA)的96-孔板 (MaxiSorp板，购自Nunc公司)。方法如下(1)上述96-孔板首先用IL-8包被。(2)包被后的96-孔板再用SuperBlock(购自Pierce公司)作封闭处理。(3)纯化了的抗IL-8单链抗体在0. 02% BSA中作系列稀释后加入已包被有IL_8 的96-孔中，与IL-8结合。(4)将96-孔板清洗后，在96-孔中再加入稀释了 5000倍的鼠抗HSV标记物的抗体(购自Novagen公司)用来检测结合了的单链抗体(在scFv的C端含有一个HSV标记物)。(5)将96-孔板清洗后，在96-孔中再加入稀释了 10000倍的山羊抗鼠IgG抗体并偶联有HRP (辣根过氧化物酶)的偶联物(购自Sigma公司)。(6)将96-孔板最终清洗后，应用购自Sigma公司的HRP底物TMB试剂作显色处理。(7)最后，反应用0. 5M的硫酸终止，并检测450nm的吸收光谱。结果如图3和图4所示，结果说明克隆号#IL-8_31与克隆号#IL_8_21的二个单链抗体都能有效地结合IL-8。实施例8测试IL-8单链抗体对IL-8的趋化性采用微孔小室(改进型的Boyden Chamber)趋化实验测试纯化后的抗IL_8单链抗体的对IL-8趋化性的抑制作用，实验步骤如下(1)重组人IL-8的蛋白质(浓度为lOng/ml)与纯化后的抗IL-8单链抗体或鼠抗人IL-8抗体(购自Wiarmingen公司)或与IL-8不相关的抗p_53单链抗体混合在培养基中(此三种抗体的浓度为1微克/毫升或10微克/毫升)，并置于改进型的Boyden Chamber(购自New Probe公司)的底室。(2)分离后的嗜中性粒细胞QX IO5细胞)加于改进型的Boyden Chamber的上室。上、下室之间有孔径3. 0 μ m的聚碳膜相隔。(3)加置细胞后的Boyden Chamber在37°C的(X)2培养箱内保温一小时。(4)移动到下室的嗜中性粒细胞在显微镜下作观测。趋化实验测试结果如图5和图6所示，结果说明克隆号#IL-8_31与克隆号 #IL-8-21的二个单链抗体都能有效地抑制IL-8对细胞的趋化性。
权利要求
1.一种抗白细胞介素-8抗体，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于，重链可变区中的3个高变区⑶RH1、⑶RH2、⑶RH3的氨基酸序列分别为GFSFSSFEM、 YISKSGFTIYYADSVKG、SSffAQDFDffLLPFDff ；其轻链可变区中 3 个高变区 CDRLl、CDRL2、CDRL3 的氨基酸序列分别为 RASQGIRNYLA、AASHQS、QKYNSVPF。
2.根据权利要求1所述的抗白细胞介素-8抗体，其特征在于所述的重链可变区具有 SEQ ID NO. 5所示的氨基酸序列；所述的轻链可变区具有SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的抗白细胞介素-8抗体，其特征在于所述的抗体为单链抗体。
4.一种编码权利要求1或2所述的抗白细胞介素-8抗体的基因。
5.根据权利要求1或2所述的抗白细胞介素-8抗体在制备用于治疗与人白细胞介素-8表达和分泌异常、过量或失控相关的疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明一种抗白细胞介素-8抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区中的3个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为GFSFSSFEM、YISKSGFTIYYADSVKG、SSWAQDFDWLLPFDW；其轻链可变区中3个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为RASQGIRNYLA、AASTLQS、QKYNSVPF。本发明抗白细胞介素-8抗体具有全人源化的特点，特异性高，制备过程相对简单，成本低廉。
文档编号C12N15/13GK102199209SQ20111007463
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者余乃绚, 华绍炳 申请人:余乃绚, 华绍炳