专利名称：一种特异性降低人Aurora-A基因表达的shRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子遗传学及生物医药技术领域，具体为ー种特异性降低人Aimm1-A基因表达的shRNA及其应用。
背景技术：
RNA干扰技术(RNAi )是指双链RNA特异性地诱发与其同源序列mRNA分子被降解，导致相应基因表达抑制的现象。人工化学合成或细胞内转录生成的小的双链RNA (smallinterfering RNA, siRNA)进入细胞后，能和与之互补的祀基因mRNA结合,从而介导特异性的切割酶将mRNA降解，达到降低目的基因表达的目的。
目前，体外化学合成的SiRNA虽然可以引起靶基因表达降低，但其作用相对短暂。为了对基因进行长效抑制，许多哺乳动物质粒表达载体已被作为研究工具，在细胞内指导合成siRNA。这些载体包含依赖RNA polymerase- III U6或Hl启动子，有一个明确的转录起始点和ー个由连续5个胸腺嘧啶组成的转录终止信号(T5)。其中，ー对特定的寡核苷酸来源于目标基因mRNA的一段长度为19 21个碱基的独特序列。当将正向和反向的DNA寡核苷酸退火，并克隆至载体的两个限制性内切酶位点之间时，正向DNA寡核苷酸将正确定位于U6启动子的下游。重组载体的转录产物即发夹型RNA(small hairpin RNA, shRNA)可以自身折叠配对形成茎长为19 21个碱基的茎环(Stem-loop)结构，这种茎环结构的前体在细胞内很快被切割形成有功能的siRNA。这种载体表达的shRNA经剪切形成的siRNA具有表达量稳定、持续时间长的特点，从而可引起目标基因表达的长效抑制。Aurora-A是ー种參与有丝分裂的丝氨酸/苏氨酸激酶，其生物学作用主要是通过调节中心体和微管的功能，确保中心体的正确分离和胞浆的完整分裂[BischofTj.R, Plowman GD. The Aurora/IplIp kinase family: regulators of chromosomesegregation and cytokinesis. Trends Cell Biol, 1999，9 (11):454-459.]。 近年来，Aimm1-A之所以倍受关注，是因为它与许多肿瘤的发生关系密切，是ー种潜在的癌基因。例如在乳腺癌[Zhou H, Kuang J, Zhong L, et al. Tumour amplified kinasebi'K15/BTAK induces centrosome amplification, aneuploidy and transformation.Nat Genet, 1998,20(2) : 189-193·]、肝癌[Jeng YM, Peng SY, Lin CY, et al.Overexpression and amplification of Aurora-A in hepatocellular carcinoma.Clin Cancer Res, 2004, 10 (6) : 2065-2071.]、结肠癌[Bischoff JR, Anderson L, ZhuY, et al. A homologue of Drosophila aurora kinase is oncogenic and amplifiedin human colorectal cancers. EMBO J, 1998, 17 (11) : 3052-3065.]、膀Jj光癌[Sen S,Zhou H, Zhang RD, et al. Amplincation/overexpression of a mitotic kinase genein human bladder cancer. J Natl Cancer Inst, 2002, 94 (17) : 1320-1329.]以及食管癌[Tong T, Zhong Y, Kong J, et al. Overexpression of Aurora-A contributesto malignant development of human esophageal squamous cell carcinoma. ClinCancer Res, 2004, 10(21): 7304-7310. Tanaka E, Hashimoto Y, Ito T, et al. Theclinical significance of Aurora-A/STKI5/BTAK expression in human esophagealsquamous cell carcinoma. Clin Cancer Res, 2005,11(5): 1827-1834.]等肿瘤中均发现有Aurora-A的过表达。Aurora-A表达异常不仅与肿瘤的发生密切相关，而且与肿瘤的侵袭和转移也存在很大程度的相关性。例如，在膀胱癌、肝癌[Jeng YM, Peng SY,Lin CY, et al. Overexpression and amplification οι Aurora-A in hepatocellularcarcinoma. Clin Cancer Res, 2004, 10 (6) : 2065-2071. Sen S, Zhou H, Zhang RD,et al. Amplification/overexpression of a mitotic kinase gene in human bladdercancer. J Natl Cancer Inst, 2002, 94(17) : 1320-1329.]中，Aurora-A 的表达水平与组织分级、侵袭和转移率呈正相关，并与病人的预后相关；在食管鳞癌中，Aimm1-A表达水平与肿瘤的组织学分级以及侵袭潜能呈正相关，并与远处淋巴结转移相关，而且还可作为判断病人预后的一个独立指标[Tong T, Zhong Y, Kong J, et al. Overexpression ofAurora-A contributes to m&ligriMit development of human esophageal squamous cel丄carcinoma. Clin Cancer Res, 2004,10 (21): 7304-7310. Tanaka E, Hashimoto Y, ItoT, et al. The clinical significance of Aurora-A/STKI5/BTAK expression in humanesophageal squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res, 2005,11(5): 1827-1834·]。 由此说明，Aimm1-A在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用。因此，Aurora-A基因有可 能成为治疗肿瘤发生发展的有效靶点之一。众所周知，我国食管癌的发病率目前居世界第一位，尤其以太行山周边的河北、河南及山西的部分地区为高发区。虽然手术切除以及术后放化疗使病人生存率得到了较大提高，但总体预后仍不乐观，导致病人死亡的主要原因是肿瘤的复发和转移。因此，研制治疗食管癌的新型药物具有重要的经济价值和社会效益，而采用RNA干扰技术将有可能成为治疗食管癌的有效途径之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性降低人AuiOra-A基因表达的shRNA及其应用。本发明是采用如下技术方案实现的一种特异性降低人Aimm1-A基因表达的shRNA，其碱基序列如SEQ ID NO. I所示，即
5，-GCACCACUUGGAACAGUUUAUUUCAAGAGAAUAAACUGUUCCAAGUGGUGC-3，。该shRNA可应用于治疗食管癌的药物中。本发明提供了一种可以特异性降低人Aimm1-A基因表达的发夹型干扰RNA(Aurora-A-shRNA),如 SEQ ID NO. I 所不，针对的革E序列为人 Aurora-A mRNA 的第 995 1015位，如SEQ ID NO. 2所示，该shRNA在体内或体外可剪切形成含如SEQ ID NO. 4和SEQID NO. 5所示的siRNA ;本发明还提供了编码该shRNA的DNA寡核苷酸链，如SEQ ID NO. 3所示，以及包含如SEQ ID NO. 3所示的DNA寡核苷酸链的质粒，利用该质粒可以直接在体内或者体外生成Aurora-A-shRNA。而且本发明还证明了利用含Aurora-A-shRNA干扰载体的药物瞬时转染人食管癌EC9706细胞后，细胞中Aurora-A基因的mRNA转录水平明显降低，蛋白表达水平明显降低，使食管癌细胞的侵袭能力显著降低，井能促进UV照射诱导的食管癌细胞凋亡。总之，本发明利用RNA干扰技术，成功获得针对人Aurora-A基因的shRNA ；以此序列为基础的真核表达载体在细胞中能稳定持续的抑制Aurora-A mRNA和蛋白表达水平，克服了体外化学合成的siRNA作用时间短暂的缺点；以此序列为基础的真核表达载体在细胞中能有效抑制食管癌细胞的侵袭以及促进UV照射诱导的食管癌细胞凋亡，因此，为新型抗肿瘤药物的开发提供了新途径。
图I为本发明RNA干扰载体的特征 图2为转染后普通显微镜下观察EC9706细胞图(X 100)；
图3为转染后荧光镜下观察EC9706细胞中绿色荧光蛋白表达图(X 100)；
图4为转染后EC9706细胞中Aurora-A mRNA表达的RT-PCR结果图；图5为转染后EC9706细胞中Aurora-A蛋白表达的Western blot结果 图6为转染后对照组Transwell侵袭实验结果图(X 100);
图7为转染后实验组Transwell侵袭实验结果图(X 100);
图8为转染后Transwell侵袭实验结果统计 图9为转染后UV照射诱导的对照组细胞DAPI染色图(X200)；
图10为转染后UV照射诱导的实验组细胞DAPI染色图(X200)。
具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或者按照生产厂商所建议的条件。实施例I :
可降低人Aurora-A基因表达的shRNA的设计
根据NCBI数据库中人Aurora-A基因(GeneBank编号NM_003600. 2)的mRNA喊基序列，借助siDirect公司在Internet上提供的siRNA工具软件(siDirect version 2. O)选择革巴点序列，靶点序列为人Aurora-A mRNA的第995 1015位，如SEQ ID NO. 2所示，即5’-GCACCACUUGGAACA⑶UUAU-3，，
根据靶点序列设计的相应shRNA序列为
SEQ ID NO. I :5’ -GCACCACUUGGAACAGUUUAUUUCAAGAGAAUAAACUGUUCCAAGUGGUGC-3’
编码shRNA的DNA序列为
SEQ ID N0.3 :5’ -GCACCACTTGGAACAGTTTATTTCAAGAGAATAAACTGTTCCAAGTGGTGC-3’
该shRNA序列在体内或体外可剪切形成含如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示的siRNA正义链和反义链
SEQ ID NO. 4 :正义链为 5’ -GCACCACUUGGAACAGUUUAU-3 ’，
SEQ ID NO. 5 :反义链为 5’ -AUAAACUGUUCCAAGUGGUGC-3 ’。实施例2
可降低人Aurora-A基因表达的shRNA干扰载体的构建
根据以上序列，由上海吉玛有限公司通过化学合成法合成SEQ ID N0:3所示的DNA，并在两端加上BamH I和Bbs I的酶切位点。将DNA寡核苷酸溶解在灭菌、无核酸酶的水中，终浓度为3mg/mL。退火反应是将各ImL的正向和反向DNA寡核苷酸与48ml的退火缓冲液(IOmM Tris, pH 7. 5-8. O, 5OmM NaCl，ImM EDTA)混合，在 90°C温育 4min，70°C温育IOmin,慢慢冷却退火的寡核苷酸至10°C。将退火产物与空的pGPU6/GFP/Neo质粒(上海吉玛有限公司提供)进行双酶切，采用DNA纯化试剂盒纯化酶切产物，各取2PL用T4 DNA连接酶连接。将重组的pGPU6/GFP/Neo载体转化含有氨苄青霉素的琼脂糖平板，挑取阳性克隆，通过测序来确定重组质粒中是否插入正确的序列。质粒特征如图I所示，其中shDNA代表编码本发明序列shRNA (SEQ ID NO. I)的DNA序列(SEQ ID NO. 3)。测序证实插入序列完全正确。实施例3:
含人Aurora-A-shRNA干扰载体药物的制备
将8Pg质粒稀释于500μ 无培养基中，轻轻混匀。取Lipofectamine 2 000 (脂质体介导法)8μ 稀释于500μ 无血清培养基，混匀，室温孵育5min。将稀释的脂质体与稀释的质粒DNA混合，室温孵育20min。实施例4:
利用含人Aurora-A-shRNA干扰载体的药物瞬时转染人食管癌EC9706细胞取生长状态良好的细胞，于转染前一天将细胞接种于培养皿中，转染时细胞密度达到70%左右。将实施例3所制备的药物加入培养皿内，加无血清培养基至2mL，轻轻混匀。6h后补加含20%的RPMI 1640培养基2mL，24h后，弃去原培养基，换含10%的RPMI 1640培养基。48h后收集细胞进行鉴定。实施例5:
转染后显微镜下观察EC9706细胞中绿色荧光蛋白的表达
载体上帯有GFP基因，表达绿色荧光蛋白，利于观察含重组载体的药物的转染效率。结果显示，随着转染时间的延长，緑色荧光逐渐增多增强。同一视野白光(图2)和荧光镜下(图3)对比观察细胞中绿色荧光蛋白的表达，经计算得出在48h时，含人Aurora-A-shRNA干扰载体的药物的转染效率约为50-60%。实施例6:
转染后半定量RT-PCR法检测对Aurora-A mRNA表达的干扰作用转染 48h 后，用 Trizol 试剂抽提细胞总 RNA,取 RNA 7. 5M-g, random hexamers(500μδ/πι 2μ , IOmM dNTP mix I μ 1，カ卩 DEPC 水至 10μ ，混匀后 65 °C 作用 5min ；置于冰上 3-5min，加入 10XRT buffer 2μ 1,25 mmol/L MgCl2 4μ 1,0. lmol/L DTT2 μ I,混勻后25 °C作用2min ;在姆管中加Superscriptll 逆转录酶I μ I,混勻，依次25°C作用10min，42°C作用90min，70 °C作用15min，逆转录成cDNA。再以cDNA为模板，PCR扩增Aurora-A基因，上游引物为5’ -AATGATTGAAGGTCGGATGC-3’ ；下游引物为5’ -TTCTCTGAGCATTGGCCTCT-3’。以看家基因GAPDH为内參照，上游引物为5，-GCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3’ ；下游5’ -GCCAGGGGTGCTAAGCAGTT-3’。引物由大连宝生物公司合成。PCR反应体系如下
权利要求
1.一种特异性降低人Aurora-A基因表达的ShRNA，其特征在于，其碱基序列如SEQ IDNO. I所示,即5， - GCACCACUUGGAACAGUUUAUUUCAAGAGAAUAAACUGUUCCAAGUGGUGC-3，。
2.根据权利要求I所述的ー种特异性降低人Aimm1-A基因表达的shRNA，其特征在于其针对的靶序列为人Aurora-A mRNA的第995 1015位，如SEQ ID NO. 2所示，即5， - GCACCACUUGGAACAGUUUAU-3，。
3.根据权利要求I所述的ー种特异性降低人Aurora-A基因表达的shRNA,其特征在于该shRNA通过如SEQ ID NO. 3所示的DNA寡核苷酸链转录生成，即5’ - GCACCACTTGGAACAGTTTATTTCAAGAGAATAAACTGTTCCAAGTGGTGC-3’。
4.根据权利要求I所述的ー种特异性降低人Aurora-A基因表达的shRNA,其特征在于该shRNA通过包含如SEQ ID NO. 3所示的DNA寡核苷酸链的质粒转录生成。
5.根据权利要求I所述的ー种特异性降低人Aurora-A基因表达的shRNA,其特征在于该shRNA可剪切形成含如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示的siRNA正义链和反义链，即SEQ ID NO. 4 :正义链为 5’ - GCACCACUUGGAACAGUUUAU-3 ’，SEQ ID NO. 5 :反义链为 5’ - AUAAACUGUUCCAAGUGGUGC-3 ’。
6.一种如权利要求I所述的特异性降低人Aurora-A基因表达的shRNA在治疗食管癌药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及分子遗传学及生物医药领域，具体为一种特异性降低人Aurora-A基因表达的shRNA及其应用，本发明提供了一种可以特异性降低人Aurora-A基因表达的发夹型干扰RNA，如SEQIDNO.1所示，针对的靶序列为人Aurora-AmRNA第995～1015位，如SEQIDNO.2所示，该shRNA在体内或体外可剪切形成含如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的siRNA；还提供了编码该shRNA的DNA寡核苷酸链，如SEQIDNO.3所示，以及包含如SEQIDNO.3所示的DNA寡核苷酸链的质粒。本发明还证明了利用Aurora-A-shRNA干扰载体的药物转染人食管癌EC9706细胞后，细胞中Aurora-A基因的mRNA转录水平、蛋白表达水平明显降低，使食管癌细胞的侵袭能力显著降低，并能促进UV照射诱导的食管癌细胞凋亡，克服了体外化学合成的siRNA作用时间短暂的缺点，为新型抗肿瘤药物的开发提供了新途径。
文档编号C12N15/113GK102690826SQ20121011500
公开日2012年9月26日 申请日期2012年4月19日 优先权日2012年4月19日
发明者李晓钟, 牛勃, 王晓霞, 裴毅, 路娜, 陈显久 申请人:山西医科大学