一种杂色蛤物种特异性检测引物及应用

一种杂色蛤物种特异性检测引物及应用
【技术领域】
[0002] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种杂色蛤物种特异性检测引物及应用。
【背景技术】
[0003] 杂色蛤是贝壳类海产品，隶属帘蛤科，学名菲律宾蛤仔，南方俗称花蛤，辽宁称蚬 子，山东称蛤蜊。杂色蛤广泛分布在我国南北海区，它生长迅速，养殖周期短，适应性强(广 温、广盐、广分布)，离水存活时间长，是一种适合于人工高密度养殖的优良贝类，是我国主 要海产经济贝类之一。通过形态学特征进行判断是对杂色蛤识别的传统方法，但是这些形 态学特征的可塑性强，受环境影响大，具有人为的主观倾向性，且存在丰富的近缘物种，近 缘种间的形态差异细微，所以传统的形态学特征识别方法存在识别困难与识别错误的问 题。
[0004] 采用DNA技术鉴定动物物种是物种识别方法中最为热门也是发展最快的分子技 术。快速进化并呈母系遗传的线粒体DNA是种群遗传学和进化遗传学的理想研究对象。杂 色蛤与其它近源物种的序列相似度在85-94%之间，而Cox I基因序列有较大差异，目前，贝 类动物的分子检测主要集中于这一序列。已发表的检测方法包括普通PCR方法和实时荧光 PCR方法等，这些方法或存在交叉反应，或对设备要求很高，目前尚没有一种简便的PCR方 法可以将杂色蛤的基因与其它贝类动物基因完全区分。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种杂色蛤物种特异性检测引物及应用 方法。本发明可以检测出来自动物样品的微量DNA，完全区分杂色蛤的基因与其它贝类动物 基因，检测灵敏度高，方法快速，易操作。
[0006] 本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种杂色蛤物种特异性检测引物， 其特征在于：其序列是： 上游引物：5' -ggttgaacagtctaccctcc-3' ； 下游引物：5> -gctaacatactactacgcaaaa_3,〇
[0007] -种所述杂色蛤物种特异性检测引物的应用，其特征在于：利用所述杂色蛤物种 特异性检测引物进行杂色蛤物种PCR特异性检测。
[0008] 进一步地，所述杂色蛤物种PCR特异性检测方法为：采用杂色蛤物种特异性检测 引物PCR扩增杂色蛤的Cox I基因，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳会产生一条187bp大小 的特异性电泳条带，从而将杂色蛤成分进行特异性鉴定。
[0009] 进一步地，所述PCR扩增杂色蛤的Cox I基因的25 y L反应体系如下表1 : 表1. PCR扩增杂色蛤的Cox I基因的反应体系
[0010] 进一步地，所述PCR扩增杂色蛤的CoxI基因的反应参数如下表2 : 表2. PCR扩增杂色蛤的Cox I基因的反应参数
[0011] 本发明特异性引物设计合理，用于杂色蛤物种检测，特异性好，检测灵敏度高。采 用本方法检测杂色蛤动物成分结果显示，采用杂色蛤物种特异性检测引物PCR扩增杂色蛤 的Cox I基因，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳会产生一条187bp大小的特异性电泳条带，即 可将杂色蛤成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。
【附图说明】
[0012] 图1为5种引物PCR结果图，图中：M. DL2000marker, 1. P1P2引物扩增结果，2. P3P4 引物扩增结果，3. P5P6引物扩增结果，4. P7P8引物扩增结果，5. P9P10引物扩增结果，6. 阴性对照，7.空白对照。
[0013] 图2为杂色蛤与其他海洋动物的PCR特异性检测结果图，图中：M. mark，1.杂色 蛤，2.杂色蛤，3.夏夷扇贝，4.紫海胆，5.太平洋牡蛎，6.魁蚶，7.阴性对照，8.空白对照。
[0014] 图3为灵敏度分析结果图，图中：M.DL2000marker，l. 10 ng/yL扩增结果，2. 5ng/iiL扩增结果，3. lng/yL扩增结果，4. 0.5ng/iiL扩增结果，5. (Xlng/yL扩增结 果，6.阴性对照，7.空白对照。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不局限于具体实施 例。
[0016] 本实施例中所利用的杂色蛤物种特异性检测引物，其序列是： 5' -ggttgaacagtctaccctcc-3'（上游）； 5' _gctaacatactactacgcaaaa_3,(下游）。
[0017] -种所述杂色蛤物种特异性检测引物的应用，即利用所述杂色蛤物种特异性检测 引物进行杂色蛤物种PCR特异性检测，具体步骤如下： 1.杂色蛤物种特异性检测引物合成：在宝生物公司合成杂色蛤物种特异性检测引物5 对，其序列（见表3): 表3. PCR扩增杂色蛤的Cox I基因的引物序列：
' 2.杂色蛤DNA的提取：采 用DNA提取试剂盒(购于宝生物公司）提取杂色蛤模板DNA，用微量分光光度计检测提取杂 色蛤模板DNA的浓度为lOOng。
[0018] 3. PCR扩增杂色蛤的Cox I基因：配制25 y L PCR反应体系如下表4 : 表4. PCR扩增杂色蛤的Cox I基因的反应体系
使用该杂色蛤物种特异性检测引物时设置PCR的反应参数如下表5 : 表5. PCR扩增杂色蛤的Cox I基因的反应参数
4.琼脂糖凝胶电泳检测：以P1P2，P3P4、P5P6、P7P8、P9P10等5对特异性引物PCR扩 增杂色蛤的Cox I基因后，以2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示(如图1所示)，经琼脂 糖凝胶电泳检测后会分别产生182bp、178bp、180bp、212bp、269bp大小的特异性电泳条带。 以P1P2作为上下游引物进行特异性PCR扩增，电泳效果最好，PCR扩增效率最高，因此选取 P1P2作为扩增体系的特异性扩增引物。
[0019] 利用所述杂色蛤物种特异性检测引物进行杂色蛤的物种成分实时检测时，采用本 方法检测杂色蛤动物成分结果显示，采用杂色蛤物种特异性检测引物PCR扩增检测杂色 蛤、夏夷扇贝、紫海胆、太平洋牡蛎、魁蚶等样品，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳，如图2所 示，杂色蛤样品产生一条187bp大小的特异性电泳条带，其他样品无电泳条带，即可将杂色 蛤成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。
[0020] 采用DNA提取试剂盒提取各待测样品的模板DNA，用微量分光光度计分别检测所 提取的模板DNA梯度稀释，制备成10 ng/iiL、5 ng/yLU ng/yL、0. 5 ng/yL、0. 1 ng/ y L5个浓度梯度样品，分别按照上述步骤3中所述反应体系及反应参数进行PCR扩增，后以 2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，以确定本标准方法的检测灵敏度，结果如图3所示，所产生的 大小为182bp的特异性电泳条带即为杂色蛤，当DNA浓度多lng/ y L时均可以特异扩增，即 该标准方法的检测灵敏度为lng/ y L。此方法可以准确的对杂色蛤的成分进行鉴定，具有很 好的灵敏度。
[0021] 以上内容是结合优选技术方案对本发明所做的进一步详细说明，不能认定发明的 具体实施仅限于这些说明。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明 的构思的前提下，还可以做出简单的推演及替换，都应当视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种杂色始物种特异性检测引物，其特征在于：其序列是： 上游引物：5' -ggttgaacagtctaccctcc-3' ； 下游引物：5> ^gctaacatactactacgcaaaa-Si02. -种根据权利要求1所述的杂色蛤物种特异性检测引物的应用，其特征在于：利用 所述杂色蛤物种特异性检测引物进行杂色蛤物种PCR特异性检测。3. 根据权利要求2所述的杂色蛤物种特异性检测引物的应用，其特征在于：所述杂色 蛤物种PCR特异性检测方法为：采用杂色蛤物种特异性检测引物PCR扩增杂色蛤的Cox I 基因，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳会产生一条187bp大小的特异性电泳条带，从而将杂色 蛤成分进行特异性鉴定。4. 根据权利要求3所述的杂色蛤物种特异性检测引物的应用，其特征在于：所述PCR 扩增杂色蛤的Cox I基因的反应体系如下表1 : 表1. PCR扩增杂色蛤的Cox I基因的反应体系5. 根据权利要求3或4任一所述的杂色蛤物种特异性检测引物的应用，其特征在于： 所述PCR扩增杂色蛤的Cox I基因的反应参数如下表2 : 表2. PCR扩增杂色蛤的Cox I基因的反应参数
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，特别涉及一种杂色蛤物种特异性检测引物及应用。一种杂色蛤物种特异性检测引物，其序列是：5’-ggttgaacagtctaccctcc-3’（上游）；5’-gctaacatactactacgcaaaa-3’（下游）。一种杂色蛤物种特异性检测引物的应用，采用杂色蛤物种特异性检测引物PCR扩增杂色蛤的CoxⅠ基因，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳会产生一条187bp大小的特异性电泳条带，从而将杂色蛤成分进行特异性鉴定。本发明特异性引物设计合理，用于杂色蛤物种检测，特异性好，检测灵敏度高，即经过PCR分析，即可将杂色蛤成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105063198
【申请号】CN201510473256
【发明人】刘淑艳, 万超, 蒋丹, 徐凤敏
【申请人】刘淑艳, 万超, 蒋丹, 徐凤敏
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月5日