专利名称：一种特异性多糖制备方法
技术领域：
本发明涉及一种革兰氏阴性细菌特异性多糖(也称o-特异性多糖)制备方法。本
发明特别涉及的特异性多糖可以作为原材料或终产品用于疾病诊断、预防、治疗等，也可制 备特异性多糖的标准品或参比品，尤其可用于制备偶联疫苗。
背景技术：
革兰氏阴性细菌的特异性多糖是脂多糖的一部分。脂多糖是革兰氏阴性细菌外膜 外侧的最主要成分，由3部分组成，分别是特异性多糖、核心多糖和脂类A。其中特异性多糖 是位于细菌最外侧的结构，是细菌逃避宿主免疫攻击的保护层，也是宿主免疫细胞俘获细 菌的靶点，它决定了细菌的抗原特性，反映了细菌的血清型别；核心多糖是连接特异性多糖 和脂类A的部分；脂类A是脂多糖的致热源部分。由于特异性多糖部分决定着细菌的血清 型别，在结构上具有型特异性，因此，是细菌诊断、病原菌预防和传染病治疗的重要目标。
由于特异性多糖是脂多糖中的一部分，因此，文献记载的特异性多糖制备方法都 是在纯化获得脂多糖的基础上，通过对脂多糖的水解，进而纯化获得特异性多糖。谢贵林 (福氏2a痢疾杆菌0-特异性多糖与破伤风类毒素结合疫苗的制备及其免疫学特性，《微 生物学免疫学进展》，2001年第29巻第1期)、王燕(宋内氏痢疾杆菌0-SP-TT结合疫苗 的制备及其免疫学特性的研究，《微生物学免疫学进展》，2002年第30巻第2期)等以特 异性多糖制备细菌性痢疾结合疫苗时，就是先纯化出细菌脂多糖，经过弱酸水解、超速离 心、层析纯化后，制备出特异性多糖。国外制备特异性多糖的方法也都是采用先提取脂多 糖，再通过对脂多糖的水解、纯化，制备出特异性多糖。AnnaTurska-Szewczuk (Alteration ofO—specific polysaccharide structure of symbiotically defective Mesorhizobium loti mutant2213.1 derived from train NZP2213, Acta.Biochimica Polonica， 2008， Vol. 55， No. 1) 、Maciej ewska A (Structural analysis of the 0_specific polysaccharide isolated from Plesiomonasshigelloides 051 lipopolysaccharide， Carbohydr Res. 2009 12 ;344)禾口Per印elov AV， (Structure ofthe 0_polysaccharide of Escherichia coli 0112ab containing L_iduronic acid， Carbohydr Res. 200825 ;343) 等研究特异性多糖结构时，就是在纯化获得脂多糖的基础上，进一步水解、纯化制备出特异 性多糖部分。 以脂多糖为基础制备特异性多糖是目前的通用方法。脂多糖的制备有多种方式， 包括最常用的热酚抽提法、PCP法(酚_氯仿_石油醚法)、三氯醋酸法等。但通过提取脂 多糖后再纯化特异性多糖存在有制备工艺复杂、使用苯酚等对人体和环境有危害的有机试 剂、产率低等众多不利因素，需要更简洁、有效的制备方法。
发明内容
本发明创造了一种从菌体直接分离、纯化制备特异性多糖的方法。 本发明的方法通过对菌体的直接水解，得到特异性多糖粗品，再经纯化获得特异性多糖。
因此，本发明的特异性多糖的制备方法，包括以下步骤 1)菌体处理， 2)菌体水解， 3)从水解液中分离特异性多糖， 4)纯化特异性多糖。
本发明所述的菌体是革兰氏阴性细菌经过培养收获的活菌体或灭活菌体。
本发明所述菌体处理包括超声、微波、重离子轰击、冻融、机械搅磨等物理方式处 理，也可以采用Tween、Triton、胆酸类(如脱氧胆酸钠)等表面活性剂等化学方式，还可以 采用溶菌酶、脂酶等生物处理方式。这些处理方式可单一采用、也可以混合使用。处理的目 的是使菌体容易水解。 本发明所述菌体水解是将菌体用酸或酶进行水解，步骤包括将菌体充分悬浮于 水、盐水或缓冲液中，悬浮浓度(W/V)为100-0. 01 %，较佳浓度为50-0. 1%，良好浓度为 20-1%，最佳浓度为10-5%。菌悬液用酸或酶水解，最佳采用酸水解。酸可采用硫酸、盐酸、 硝酸、磷酸等强酸，也可采用醋酸、三氯醋酸、柠檬酸、丁二酸、石炭酸等弱酸，最佳为醋酸。 酸水解的浓度为10-0. 01 % ，较佳浓度为5-0. 1 % ，最佳浓度为2-1 % 。水解可以在静止或搅 拌条件下进行，温度为0-20(TC，较佳温度为50-15(TC，最佳温度为90-100°C。水解时间根 据水解条件从数天到数分钟不等，其中，1%醋酸IO(TC搅拌水解的时间为10-360分钟，较 佳时间为30-180分钟，最佳时间为60-120分钟。
水解后得到的水解产物中含有特异性多糖。 本发明所述从水解液中分离包括通过适当手段去除菌体及碎片，常用方法有离 心、中空纤维过滤、超滤、深层过滤等。 还包括在水解完成后或去除菌体碎片后调整pH值至中性。 本发明所述纯化特异性多糖，包括在用以下方法进行纯化，有机溶剂分离、超滤分
离、层析分离，这些方法可以单一使用，也可以相互搭配使用。 熟悉生化分离的实验人员均可以按现有技术中的方法进行上述操作。 本发明的方法，其优点在于 1)简化了流程，减少了操作环节，节省了时间。 2)去除了苯酚等高危害有机溶剂的使用，减少了对操作人员和环境的损害。
3)特异性多糖产量较常规方法提高数倍。
图1为制备流程图。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明。本实施例只是一种举例，是本发明的解决方
案之一，并非将本发明局限于实施例。 实施例一细菌发酵培养 大肠杆菌菌种开启后，接种至5ml LB培养基中，35t:震荡培养6小时，转种于500ml LB培养基中，摇床35t:震荡培养6-8小时，转种至10L菌种罐中，培养6_8小时 后，接种IOOL发酵罐，培养至对数生长末期，甲醛灭活后，离心收集菌体。50L培养液可获得 1. 2Kg左右的湿菌体。
实施例二特异性多糖提取 200g菌体溶解至4000ml注射用水中，充分搅拌，升高温度至IO(TC，加入冰醋酸至 终浓度1 % ，搅拌90分钟，降温至4°C ，调整pH值至中性，离心去除菌体，加入乙醇至浓度 25%，放置3小时以上，离心收集上清，加入乙醇至终浓度70-80%，放置过夜，离心收集沉 淀。沉淀用无水乙醇和丙酮各洗涤2遍，抽干获得特异性多糖粗品，可使用到对纯度要求较 低的领域。200g菌体可获得特异性多糖粗品4g左右。
实施例三特异性多糖纯化 通过实施例二制备的特异性多糖，可控制蛋白质3 %以内，核酸5 %以内，若需要 更高纯度，可按本实施例进一步纯化。 溶解特异性多糖至5-20mg/ml，离心收集上清，10K超滤膜循环洗涤，收集滤过液， 3K超滤膜浓縮、洗涤，收取截留液，乙醇沉淀或冻干收集纯化多糖。可控制蛋白质1%以内， 核酸1%以内。 实施例四特异性多糖纯化 特异性多糖粗品也可以通过本实施例的方法进一步纯化。 溶解特异性多糖至5-20mg/ml，离心收集上清。上清液经羟基磷灰石层析，收集流 穿液，3K超滤膜浓縮、洗涤，乙醇沉淀或冻干收集纯化多糖。
权利要求
一种特异性多糖的制备方法，其特征在于，以菌体为原料，对菌体直接水解，得到特异性多糖粗品，再经纯化获得特异性多糖。
2. 权利要求1的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1) 菌体处理，2) 菌体水解，3) 从水解液中分离特异性多糖，4) 纯化特异性多糖。
3. 权利要求l的制备方法，其特征在于，所述菌体指经过培养收获的活菌体或灭活菌体。
4. 权利要求l的制备方法，其特征在于，所述处理包括超声、微波、重离子轰击、冻融、 机械搅磨等物理方式处理，也可以采用Tween、 Triton、胆酸类(如脱氧胆酸钠)等表面活 性剂等化学方式，还可以采用溶菌酶、脂酶等生物处理方式，这些处理方式可单一采用、也 可以混合使用。
5. 权利要求l的制备方法，其特征在于，所述水解包括酸解和酶解，可与处理同时进 行，所述酸解可采用硫酸、盐酸、硝酸、磷酸等强酸，也可采用醋酸、三氯醋酸、柠檬酸、丁二 酸、石炭酸等弱酸，最佳为醋酸。
6. 权利要求1的制备方法，其特征在于，所述酸水解浓度为10-0.01%，最佳浓度为 2-1% ;水解温度为0-20(TC，最佳温度为90-10(TC，水解时间为数分钟到数天，最佳时间为 60-120分钟。
7. 权利要求l的制备方法，其特征在于，所述从水解液中分离包括通过适当手段去除 菌体及碎片，常用方法有离心、中空纤维过滤、超滤、深层过滤等。
8. 权利要求l的制备方法，其特征在于，还包括在水解完成后或去除菌体碎片后调整 pH值至中性。
9. 权利要求1的制备方法，其特征在于，所述纯化特异性多糖，包括用以下方法进行纯 化，有机溶剂分离、超滤分离、层析分离，这些方法可以单一使用，也可以相互搭配使用。
10. 权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤如下200g菌体溶解至4000ml注射用水 中，充分搅拌，升高温度至IO(TC ，加入冰醋酸至终浓度1 % ，搅拌90分钟，降温至4°C ，调整 pH值至中性，离心去除菌体，加入乙醇至浓度25X，放置3小时以上，离心收集上清，加入乙 醇至终浓度70-80%，放置过夜，离心收集沉淀，沉淀用无水乙醇和丙酮各洗涤2遍，抽干获 得特异性多糖粗品，纯化过程包括，溶解特异性多糖至5-20mg/ml，离心收集上清，10K超滤 膜循环洗涤，收集滤过液，3K超滤膜浓縮、洗涤，收取截留液，乙醇沉淀或冻干收集纯化多糖 或溶解特异性多糖至5-20mg/ml，离心收集上清。上清液经羟基磷灰石层析，收集流穿液，3K 超滤膜浓縮、洗涤，乙醇沉淀或冻干收集纯化多糖。
全文摘要
特异性多糖(也称O-特异性多糖)是脂多糖的一个组成部分，本发明涉及一种特异性多糖制备方法，该方法利用水解手段，以完整菌体为出发材料，通过对菌体的直接水解制备特异性多糖，制备出的特异性多糖可以作为原材料或终产品用于疾病诊断、预防、治疗等，也可制备特异性多糖的标准品或参比品，尤其可用于制备偶联疫苗。
文档编号A61K39/02GK101693747SQ20091023640
公开日2010年4月14日 申请日期2009年10月28日 优先权日2009年10月28日
发明者朱卫华, 杜琳 申请人:北京绿竹生物制药有限公司;