专利名称：用于中国南瓜‘广蜜1号’杂交种子纯度鉴定的引物及方法
技术领域：
本发明属于分子检测领域，具体涉及一种用于中国南瓜‘广蜜I号’杂交种子纯度鉴定的引物及方法。
背景技术：
种子纯度是种子质量检验的最主要的质量指标之一。植物新品种特异性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和稳定性(Stability)的测试(简称 DUS 测试)是农业部植物新品种保护办公室对申请品种授予新品种权进行实质审查最重要的工作内容。“广蜜I号”是一个杂交一代南瓜品种。制种的时候，母本和父本分别种在不同的地块，雌花开花前，把母本上所有的雄花花蕾摘掉。开花期用父本的花粉授到母本的雌花柱头上，从而产生杂交种子。如果母本雄花摘得不彻底，母本的花粉就有可能落到母本的雌花柱头上产生自交种子，出现假杂种，这是制种过程导致种子不纯的最主要原因。因此杂交种子在销售前必须要做纯度鉴定，符合国家对杂交种子的纯度要求才能出售给客户。一直以来，人们把制种的种子种到地里，根据植株的形态特征对南瓜品种种子纯度进行识别，但是由于形态学鉴定一般需要30-60天时间，周期长，受环境影响大，准确性较低。20世纪后期，分子生物学技术得到迅猛发展，使从DNA分子的角度准确可靠地对品种纯度进行基因鉴定和分析成为可能。采用分子标记技术鉴别杂交种子是一种快速、便捷、准确、有效的方法。目前现有技术中仍未建立对中国南瓜‘广蜜I号’杂交种子纯度鉴定方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于快速、准确鉴定中国南瓜‘广蜜I号’杂交种子纯度的引物及方法。本发明所采用的技术方案是:
一种用于中国南瓜‘广蜜I号’杂交种子纯度鉴定的SSR引物VRISSRPMK8，序列如下所
示:
VRISSRPMK8-F:5’ -TAATTAAGGCGTGAAATTGG-3’ (SEQ ID N0:1),
VRISSRPMK8-R: 5’ -GAAAAGAAACATAAACAGGGC-3’ (SEQ ID NO:2)。—种用于中国南瓜‘广蜜I号’杂交种子纯度鉴定的方法，包括如下步骤:
(1)提取南瓜幼苗基因组DNA；
(2)以南瓜基因组DNA为模板，使用权利要求1的SSR引物VRISSRPMK8进行PCR扩增；
(3)对扩增的产物进行凝胶电泳；
(4)对电泳结果进行分析 ，只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度，其中，SSR引物VRISSRPMK8产生193bp的母本特异性标记VRISSRPMK193，产生187bp的父本特异性标记VRISSRPMK187。PCR 扩增的 20 μ I 反应体系为:基因组 DNA 5ng, Mg2+0.15mmol. Λ dNTP0.2mmol. Λ SSR 引物 0.25 mmol. Λ Taq 酶 0.2U, IOXPCR buffer: 2.0 μ 1，ddH20 补足
M 20 μ 1PCR扩增的程序为:94 V预变性5min后，94 °C变性30s，55 V退火30s，72 V延伸40s, 35个循环后，72°C保持7min，然后置于4°C保存待检测。所述凝胶电泳为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。本发明的有益效果在于:
本发明的方法可将‘广蜜一号’杂交种子与其母本、父本种子区分开来，快速检测出杂交种子的纯度。本方法具有快速、准确、低成本，操作简单等优点，能够替代传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。
图1为南瓜‘广蜜I号’种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱(M:DL2000分子量标准；1:母本早选I号；2:父本长青2号；3:商品种‘广蜜I号’；圆圈内的条带为SEQ ID N0:3，长方形内的条带为SEQ ID N0:4)；
图2为白云基地‘广蜜I号’种子纯度抽样的部分结果(M:DL2000分子量标准；1:母本早选I号；2:父本长青2号；3-26:抽样商品种‘广蜜I号’)；` 图3为蔬菜所基地‘广蜜I号’种子纯度抽样鉴定的部分结果(M:DL2000分子量标准；1:母本早选I号；2:父本长青2号；3、4、6-18:抽样商品种‘广蜜I号’ ；5:假杂种)。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1
杂交南瓜‘广蜜I号’种子纯度检测方法的建立。1、筛选纯度鉴定的SSR引物。从所公布的南瓜EST-SSR引物在亲本(父本长青2号，母本早选I号)间、进行筛选，选出共显性差异标记条带的引物VRISSRPMK8，序列如下所示:
VRISSRPMK8-F:5’-TAATTAAGGCGTGAAATTGG-3’ (SEQ ID NO:1)
VRISSRPMK8-R: 5’ -GAAAAGAAACATAAACAGGGC-3’ (SEQ ID NO:2)
该标记带型清晰、重复性好。引物VRISSRPMK8能产生193bp的母本特异性标记VRISSRPMK8193 和 187bp 的父本特异性标记 VRISSRPMK8187。2、利用上述特异性引物对杂交南瓜‘广蜜I号’种子进行纯度鉴定。(I)南瓜DNA的提取
实验材料为南瓜‘广蜜I号’商品种及其父本(长青2号)、母本(早选I号)子叶DNA。步骤如下:
①用液氮在2ml的离心管内用研杵研磨，在液氮快蒸发干时迅速加入1000 μ I 2%CTAB提取缓冲液，混匀后置于65°C水浴中温浴50min (每隔5min摇动一次)。②静置至室温后在4V下12000rpm离心lOmin，将上清(约800 μ I)转移到新的2ml离心管。③加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，静置3-5分钟，在4°C下12000rpm离心lOmin,将上清液转入新的1.5ml离心管中。④加2/3体积340 μ I预冷的异丙醇，缓慢混匀(缓慢颠倒20次)，置于一 20°C下培养 30min。⑤在4°C下13000rpm离心lOmin，弃上清，加入200-300 μ I预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀(两次)，微干。⑥加入100 μ I无菌水溶解。(2) SSR-PCR 扩增:
PCR 体系(20 μ I)
DNA 模板:5ng
VRISSRPMK8-F: 0.25 mmol.Γ1VRISSRPMK8-R:0.25 mmol.L—1dNTP:0.2mmol.L—1Mg2+:0.15mmol.L-110XPCR buffe:2.0μ ITaq 酶:0.2UddH20补足至20 μ IPCR扩增程序
94°C预变性5min后，94°C变性30s，55°C退火30s，72 °C延伸40s，35个循环后，72 °C保持7min，然后置于4°C保存待检测。(3)凝胶电泳
扩增产物在双垂直非变性浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，120V稳压1.5个小时，电泳结束后进行0.l%AgN03银染15min ;银染后用2%Na0H、0.4%甲醛、0.04%Na2C03显色，显色后在灯箱上拍照分析。(4)扩增结果
南瓜‘广蜜I号’商品种扩增出187bp和193bp两条带；父本长青2号扩增出187bp的条带；母本早选I号扩增出193bp的条带(见图1)。回收特异条带，送英俊公司测序。193bp条带的序列如SEQ ID NO:3所示,杂交种子中187bp条带的序列如SEQ ID NO: 4所示，与父本、母本扩增产物的序列相符。实施例2
采用实施例1的方法对从白云基地的种子纯度鉴定田取的100株‘广蜜I号’，对其单株编号，提取单株DNA进行检测(见图2)，检测结果全部为真杂种，种子纯度为100%，与田间调查结果一致，准确率为100%。实施例3
采用实施例1的方法对从蔬菜所基地的种子纯度鉴定田取的100株‘广蜜I号’，对其单株编号，提取单株DNA进行检测(见图3)，结果表明，100株样品中，杂交种子97株，母本3株，种子纯度为97%，与田间调查结果一致。以上实施例表明，本发明的方法可将‘广蜜I号’杂交种子与其母本(早选I号)种子进行有效区分，快速、准确检测出种子纯度。
权利要求
1.一种用于中国南瓜‘广蜜I号’杂交种子纯度鉴定的SSR引物VRISSRPMK8，序列如下所示:VRISSRPMK8-F:5’ -TAATTAAGGCGTGAAATTGG-3’ (SEQ ID N0:1),VRISSRPMK8-R: 5’ -GAAAAGAAACATAAACAGGGC-3’ (SEQ ID NO:2)。
2.一种用于中国南瓜‘广蜜I号’杂交种子纯度鉴定的方法，包括如下步骤: 1)提取南瓜幼苗基因组DNA； 2)以南瓜基因组DNA为模板，使用权利要求1的SSR引物VRISSRPMK8进行PCR扩增； 3)对扩增的产物进行凝胶电泳； 4)对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，计算种子纯度，其中，SSR引物VRISSRPMK8产生193bp的母本特异性标记VRISSRPMK193，产生187bp的父本特异性标记VRISSRPMK187。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR扩增的20μ I反应体系为:基因组DNA5ng,Mg2+0.15mmol.L'dNTP 0.2mmol. Λ SSR 引物 0.25 mmol. Λ Taq 酶 0.2U，10XPCRbuffer: 2.0 μ I, ddH20 补足至 20 μ I。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR扩增的程序为:94°C预变性5min后，94°C变性30s，55°C退火30s， 72°C延伸40s，35个循环后，72°C保持7min，然后置于4°C保存待检测。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述凝胶电泳为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
全文摘要
本发明公开了用于鉴定中国南瓜‘广蜜1号’杂交种子纯度的引物及方法。所用引物为VRISSRPMK8-F5’-TAATTAAGGCGTGAAATTGG-3’和VRISSRPMK8-R:5’-GAAAAGAAACATAAACAGGGC-3’。鉴定方法如下1)提取南瓜幼苗基因组DNA；2)以南瓜基因组DNA为模板，使用SSR引物VRISSRPMK8进行PCR扩增；3)对扩增的产物进行凝胶电泳；4)对电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种。本发明的引物和方法可对‘广蜜1号’杂交种子和其母本、父本种子进行有效区分，快速、准确检测出杂交种子纯度。本方法具有快速、准确、低成本、操作简单等优点。
文档编号C12N15/11GK103088127SQ20131000306
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月5日 优先权日2013年1月5日
发明者黄河勋, 吴廷全, 王瑞, 黄智文, 林毓娥, 梁肇均 申请人:广东省农业科学院蔬菜研究所, 广东科农蔬菜种业有限公司