专利名称：与黄瓜果实光泽基因d紧密连锁的分子标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域的分子标记，特别涉及两个与黄瓜果实光泽基因d紧密连锁的分子标记。
背景技术：
黄瓜(Cucumissativus L.)是葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属(Cucurnis) —年蔓生的草本植物。黄瓜作为世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我国主栽蔬菜作物之一。果实是黄瓜经济性状最重要的部分，黄瓜果实属于瓠果，由子房和花托共同发育而成。在黄瓜果实表皮上有一个重要的性状是鲜亮程度，可以根据这一特征将黄瓜果实分为有光泽和无光泽两类。黄瓜果实表皮光泽性状不仅受自身基因的控制，同时还受到外在环境条件，比如蜡粉、嫁接和硅吸收的影响。蜡粉覆盖在黄瓜表皮会间接影响到果皮的光泽亮度。但我们在试验中发现，有些果实表皮覆有蜡粉层，即使将蜡粉层擦掉，果皮仍然表现为有光泽性状。光泽与蜡粉层没有必然的联系。黄瓜果实光泽基因的研究始于1931年，光泽性状是由d(glossy fruit skin)基因调控,无光泽(dull fruit skin) (D)为显性,有光泽(d)为隐性。2011年苗晗等利用148个重组自交系(RIL)群体将光泽基因初步定位于第五染色体SSR标记SSR15818和SSR06003之间，遗传距离分别为7.7cM和6.0cM，详细结果可以参看=Miao H等在《Euphytica》(荷兰植物育种杂志)2011年第182卷167-176页发表的题为《A linkage map of cultivated cucumber (Cucumis sativus L.) with248microsatellite marker loci and seven genes for horticulturalIy importanttraits》(使用248个多态标记位点和7个重要的农艺性状基因构建黄瓜遗传图谱)一文，但上述研究还存在分析群体相对较小，与光泽基因d遗传距离相对较远等问题。黄瓜育种中发现黄瓜有光泽的果实很多都是无瘤类型，但也有少数具有果瘤性状的果实也有的具有光泽性状，所以果实光泽和无瘤性状是两个独立的性状，但两性状间存在紧密的连锁关系。还有研究指出光泽性状与果实果皮颜色一致基因(U)和小刺基因
(SS)存在紧密连锁关系,详细结果可以参看:Yuan XJ等在《Euphytica》(荷兰植物育种杂志)2008年第 164卷473-491 页发表的题为《Genetic mapping and QTL analysis of fruitand flower related traits in cucumber(Cucumis sativus L.)using recombinantinbred lines))(使用重组自交系对黄瓜果实和花相关性状进行QTL分析和遗传作图)一文，因此，光泽基因d的研究将有助于促进第五染色体其它重要农艺性状的基因的研究，为黄瓜遗传和育种工作奠定基础。随着生物技术水平的不断发展，克隆目的基因的方法也层出不穷，图位克隆方法利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因定位到染色体的一个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因。SSR(Simple Sequence Repeats)标记具有稳定性好、多态性高和广泛适用的优点，找到与光泽基因d紧密连锁的分子标记，可为进一步克隆光泽基因d打下坚实的基础。
随着人们生活水平的提高，品质育种已提到重要位置。黄瓜果实光泽性状属于感观品质范畴。欧洲类型的具有光泽性状的黄瓜由于具有鲜艳和光亮的外表，同时能长时间保存和运输等优点，一直深受广大消费者的喜爱，其市场价格为普通黄瓜的2-3倍。黄瓜光泽基因d控制光泽性状的形成，它的研究将会推动品质育种进程。用与目的性状紧密连锁的分子标记进行标记辅助选择在黄瓜遗传育种中是十分有效的方法，分子标记是在DNA水平上对目标性状进行选择，具有高效、快速、不受环境条件限制等优点，可在苗期进行选择，加快黄瓜育种的进程。
发明内容
本发明的目的，在于克 服现有技术的不足，提供两个与黄瓜果实光泽基因d紧密连锁的分子标记。本发明是通过以下技术方案实现的:一个与黄瓜果实光泽基因d紧密连锁的分子标记，命名为Y L37，由SEQ ID N0.1所示的DNA片段和SEQ ID N0.2所示的DNA片段组成；其中SEQ ID N0.1所示的DNA片段与光泽基因d连锁，SEQ ID N0.2所示的DNA片段与无光泽基因D连锁。上述与黄瓜果实光泽基因d紧密连锁的分子标记，由SEQ ID N0.5所示的上游引物和SEQ IDN0.6所示的下游引物扩增得到。该引物由上海生工合成。一个与黄瓜果实光泽基因d紧密连锁的分子标记，命名为YL112，由SEQ ID N0.3所示的DNA片段和SEQ ID N0.4所示的DNA片段组成；其中SEQ ID N0.3所示的DNA片段与光泽基因d连锁，SEQ ID N0.4所示的DNA片段与无光泽基因D连锁。上述与黄瓜果实光泽基因d紧密连锁的分子标记，由SEQ ID N0.7所示的上游引物和SEQ ID N0.8所示的下游引物扩增得到。该引物由上海生工合成。本发明利用分子标记和染色体步移法，提供两个与黄瓜果实光泽基因d更紧密连锁的稳定的SSR分子标记，光泽基因d在提供的两个分子标记之间，遗传距离在0.9cM之内，物理距离仅244.9Kb ;由于所有分子标记的开发均与已知的黄瓜基因组序列相关，由此而获得的两个分子标记之间的物理图谱将有利于d基因的最终克隆，便于分子标记辅助育种体系的建立。本发明的分子标记可简便、快速、高通量地应用于育种实践。
:图1为黄瓜果实光泽基因d的遗传图谱:左边数值代表遗传距离(单位:cM)，右边标示代表已经公开发表的引物，均位于第五染色体，光泽基因d位于2个侧翼标记SCZ69和SSR16203 之间。图2为标记YL37PCR扩增结果:S94为无光泽亲本；S06为有光泽亲本R代表两亲本杂交后代；F2随机扩增代表在F2群体中随机挑选的17有光泽或无光泽植株PCR扩增结果。下面的条带代表与果实光泽基因d连锁，上面的条带代表与无光泽基因D连锁。图3为标记YL112PCR扩增结果:S94为无光泽亲本；S06为有光泽亲本R代表两亲本杂交后代；F2随机扩增代表在F2群体中随机挑选的17有光泽或无光泽植株PCR扩增结果。下面的条带代表与果实无光泽基因D连锁，上面的条带代表与光泽基因d连锁。图4为黄瓜果实光泽基因d的染色体步移示意图:YL37与YL112代表与d基因紧密连锁的分子标记，这两个标记之间的物理距离为244.9kb。SCZ69与SSR16203代表已经公布的标记。拼接所用的是已经公布的2个黄瓜品种基因组序列(http://cucumber,vcru.wise, edu/wenglab/gyl4-9930/index, html):分别使用的黄瓜品种 GY 14 的Scaffold000789、Scaffold02633 和黄瓜品种 9930 的 Scaffold000083 中的序列。X 代表F2群体剩余的交换株。
具体实施例方式一、遗传分离群体的构建与交换单株的鉴定UF2群体的构建欧洲温室类型自交系S06 (母本)，果实表皮有光泽且表面光滑、无果瘤。华南类型自交系S94(父本)，果实表皮无光泽且具有果瘤性状，S06自交系和S52自交系已在YuanXJ等在《Euphytica》(荷兰植物育种杂志)2008年第164卷473-491页发表的题为《Geneticmapping and QTL analysis of fruit and flower related traits in cucumber(Cucumissativus L.)using recombinant inbred lines》(使用重组自交系对黄瓜果实和花相关性状进行QTL分析和遗传作图)一文中公开。本实施例利用这两个亲本配制了杂交组合，F1果实为无光泽、有果瘤，F1代自交产生F2代群体。在842株F2个体中，鉴定有/无光泽表型，卡方分析法进行验证，最后确定黄瓜果实光泽性状是单基因控制的隐性性状。二、光泽基因d的初步定位1、黄瓜基因组DNA的提取按常规方法一CTAB法提取亲本及全部F2分离群体的叶片总DNA。2、有光泽(dd)和无 光泽(D_)基因池建立利用群体分离法(BSA)从F2分离群体中分别随机选取有光泽株和无光泽株个体各10株，建立有光泽(dd)和无光泽(D_)黄瓜的基因池。3、遗传图谱的构建利用66对已经公布的SSR04812和SSR04644之间的高密度饱和图谱第五染色体上的分子标记，这些均是位于光泽基因d两侧的分子标记，然后对两亲本和两个基因池进行多态性引物筛选，利用得到的11对多态性引物扫描214株随机群体，统计单株得到的带型使用MAPMAKER/EXP3.0软件进行分析，利用Mapchart2.0软件构建遗传图谱。最后获得了光泽基因d两翼最近的分子标记SCZ69和SSR16203，两个标记之间的遗传距离分别为0.3cM 和 0.6cM(参见图1)。三、黄瓜基因组序列的兼并拼接与标记开发1、黄瓜基因组序列的兼并拼接利用已经公布的黄瓜品种9930和GY14黄瓜基因组序列(http://cucumber,vcru.wise, edu/wenglab/gyl4_9930/index, html),将 SSR 分子标记 16203 序列扫描黄瓜基因组数据库中得到黄瓜品种9930的Scaffold000083，黄瓜品种gyl4的Scaffold02633，将Scaffold000083的末端序列扫描黄瓜基因组GY14数据库得到Scaffold000083。Scaffold000083序列中含有SCAR标记SCZ69序列，用DNAMAN软件对这3个Scaffold序列比对，兼并拼接得到SCAR标记SCZ69和SSR标记16203之间总长度422.8kb的序列。2、遗传分子标记的开发
通过SSR分析软件对获得的422.8kb序列进行扫面分析，对获得的155个SSR位点用引物设计软件Primer Premier5.0对设计引物,在两亲本间进行PCR扩增并使用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最后鉴定出8个具有多态性的标记。四、光泽基因d的精细定位利用新开发的8个多态性SSR位点再次扫描F2群体的842株个体。寻找标记基因型(通过分析显隐亲本获得)与性状表现型(有光泽/无光泽)的差别单株，获得标记与光泽基因d基因的交换单株。位于基因两侧的多态性标记向交换株逐渐减少的方向步移，最后距离光泽基因d两侧最近的2个SSR位点在两亲本间产生差异(参见图2和图3)，随后对其进行测序并获得SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2及SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4中的序列信息，这两个标记分别命名为YL37和YLl 12，标记YL37和YLl 12在842株大群体中剩余的交换株分别剩余3株和4株(本研究中的其他新开发的6个标记未公开)。所有SSR标记 PCR 反应体系均为:黄瓜 DNA20ng，双向引物各 0.2ymol/L，200ymol/L dNTPs, 2mmol/LMgCl2,1 X Taq缓冲液，0.5U TaqDNA聚合酶，总反应体系为10 μ 1，其中TaqDNA聚合酶购于Promega 公司。扩增程序为:94°C 3min ；35cycles, 94°C 20s, 55°C 30s, 72°C 30s ；72°C 5min。上述标记YL37和YL112的PCR产物检测方法均使用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液为1XTBE，50W恒功率，电泳lh。电泳后进行银染。银染方法为:将带胶的玻璃板放入固定液中，在摇床上轻轻摇动至指示剂颜色褪去，其中固定液的组成为:冰醋酸、无水乙醇和蒸馏水，其体积比为1: 10: 100;用超纯水洗Imin 3min ;将冲洗后的胶板放入染色液中摇动半小时，其中染色液的组分为2g/L硝酸银；将染色后的胶板放入超纯水中漂洗5s后放入装有显影液的塑料盒中，轻轻摇动至条带清晰，放入自来水中冲洗3min ;室温下干燥，干燥后拍照，其中显影液是在IL蒸馏水中加入15gNa0H和3ml甲醛混匀得到的。五、多态性片段的回收、克隆和测序
将多态性片段从聚丙烯酰胺凝胶上切下，置于离心管中，用枪头捣碎，加入超纯水冲洗三遍，然后加入IOul超纯水95°C水浴15min，快速离心取上清液，用相对应的SSR引物进行PCR扩增，PCR反应体系为:目标条带DNA 5ul，引物0.5umol/L, 200umol/L dNTPs,IXTaq Buffer, 1.5mmol/L MgCl2, 2U Taq DNA 聚合酶，总反应体系为 50ul，其中 TaqDNA聚合酶购于Promega公司。目标条带PCR扩增程序为:94°C 5min ；35cycles,94°C 30s ；50°C 30s ；72°C Imin ；72°C 5min。将 PCR 产物中加入 goldview 荧光染料 3ul，4°C 下放置IOmin让染料同DNA结合，然后加入上样缓冲液2ul，混匀后通过I %琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切下目标片段放入1.5ml的离心管中，用DNA回收试剂盒回收，其中DNA回收试剂盒为上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，产品号为Cat.N0.SK1132。将回收产物与载体连接采用上海申能博彩公司的PUCm-T vector系统。用电击法将连有目标片段的T-vector转化进入E.coli DH5 α感受态细胞，将菌液均匀涂布于LB固体培养基的平板上，涂好的平板倒置于37°C培养箱培养过夜，挑菌、摇菌及PCR菌液检测，进行相关序列的测定。以上两个新开发的分子标记经过分离群体验证，均与光泽基因d基因位点紧密连锁(参见图4，图中X表示剩余的交换株)。由于都是特异性PCR扩增，故这些标记具有高稳定。利用这些标记构建的高密度遗传和物理图谱，将有助于黄瓜光泽基因d的最终克隆。
本发明利用有光泽亲本S06和无光泽亲本S94杂交获得F1, F1再自交获得842株F2分离群体。使用已经公布的第五染色体的66对引物对两亲本和2个基因池进行筛选，利用获得的11个多态性标记对214株随机F2个体带型分析，然后使用MAPMAKER/EXP3.0分析软件和Mapchart2.0软件构建了遗传图谱，获得了与光泽基因d两翼最近的分子标记SCZ69和SSR16203。利用已经公布的黄瓜品种9930和gyl4黄瓜基因组序列(http://cucumber,vcru.wise, edu/wenglab/gyl4-9930/index, html),能够将 SCAR 标记 SCZ69 和 SSR 标记SSR16203之间的序列兼并拼接。拼接所用的gyl4黄瓜基因组序列有:Scaffold0789、Scaffold02633，拼接所用的9930黄瓜基因组序列有:Scaffold000083，拼接后的序列总长度为422.8kb。然后再用SSR分析软件找出SSR位点，设计引物软件，对422.8kb序列分析设计了 155个引物对，鉴定出8个亲本间有多态性的引物，然后分别筛选出F2群体842个单株的交换株。位于基因两侧的多态性标记向交换株逐渐减少的方向步移，最后确定最近的两侧标记在光泽基因d位点间分别还有3和4个交换单株。上述黄瓜染色体步移的详细情况如图4所示。本发明中图1涉及的分子标记已全部公开。详细参看Zhang Wff等在《Theoreticaland Applied Genetics))(理论应用遗传学)2012年第124卷第2期249-259页发表的题为〈〈Construction of a high density integrated genetic map forcucumber (Cucumissativus L.》(黄瓜高密度遗传整合图谱的构建)一文。本发明中PCR产物克隆测序中所使用的E.coli DH5a菌株已在文献《李欣，等。电转化法制备高转化效率的E.coli感受态细胞研究。食品与生物技术学报，2007，26 (6) 48 51》中公开；本发明中涉及的E.coli DH5a菌株可通过公开市售的商业渠道取得，购于宝生物工程(大连)有限公司，公司地址:大连经济技术开发区东北二街19号。序列表〈110〉上海交通大学〈120〉与黄瓜果实光泽基因d紧密连锁的分子标记<160>8〈210〉I<211>170<212>DNA〈213〉黄瓜(Cucumis sativus L.)〈400〉Itcctcatcat tgccactctt gcttggtctt ctctcttcgt cttgcaggta tatatatata60tatatatata tatatgttta tgcatgtgtg gtaaaatcaa tagttttgtt tgaagtgatt120ctaactgctt caaaatcact tccaaaccct tgcagaatca ggcgttgaag170<210>2<211>172<2 12>DNA〈213〉黄瓜(Cucumis sativus L.)<400>2tcctcatcat tgccactctt gcttggtctt ctctcttcgt cttgcaggta tatatatata60
权利要求
1.一个与黄瓜果实光泽基因d紧密连锁的分子标记，命名为YL37，由SEQ IDN0.1所示的DNA片段和SEQ ID N0.2所示的DNA片段组成；其中SEQ ID N0.1所示的DNA片段与光泽基因d连锁，SEQ ID N0.2所示的DNA片段与无光泽基因D连锁。
2.根据权利要求1所述的与黄瓜果实光泽基因d紧密连锁的分子标记，其特征在于:由SEQ ID N0.5所示的上游引物和SEQ ID N0.6所示的下游引物扩增得到，其PCR扩增程序为:94°C 5min ；35cycles,94°C 20s ；55°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。
3.一个与黄瓜果实光泽基因d紧密连锁的分子标记，命名为YLl 12，由SEQ ID N0.3所示的DNA片段和SEQ ID N0.4所示的DNA片段组成；其中SEQ ID N0.3所示的DNA片段与光泽基因d连锁，SEQ ID N0.4所示的DNA片段与无光泽基因D连锁。
4.根据权利要求3所述的与黄瓜果实光泽基因d紧密连锁的分子标记，其特征在于:由SEQ ID N0.7所示的上游引物和SEQ ID N0.8所示的下游引物扩增得到，PCR扩增程序为:94°C 5min ；35cyc les,94°C 20s ；55°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。
全文摘要
本发明提供了两个与黄瓜果实光泽基因d紧密连锁的分子标记，第一个命名为ＹL-37，由SEQ ID NO.1所示的DNA片段和SEQ ID NO.2所示的DNA片段组成；其中SEQ ID NO.1所示的DNA片段与光泽基因d连锁，SEQ ID NO.2所示的DNA片段与无光泽基因D连锁。第二个命名为ＹL112，由SEQ ID NO.3所示的DNA片段和SEQ ID NO.4所示的DNA片段组成；其中SEQ ID NO.3所示的DNA片段与光泽基因d连锁，SEQ ID NO.4所示的DNA片段与无光泽基因D连锁。本发明的两个分子标记与已经公开的SCAR标记SCZ69和SSR标记SSR16203标记相比，与光泽基因d位点的连锁更加紧密；本发明已经将光泽基因d定位在244.9Kb区间，对关于有光泽/无光泽果实的黄瓜分子标记辅助育种体系的建立更有帮助。
文档编号C12N15/11GK103184219SQ20131000256
公开日2013年7月3日 申请日期2013年1月5日 优先权日2013年1月5日
发明者潘俊松, 杨绪勤, 李月, 蔡润, 何欢乐 申请人:上海交通大学