专利名称：一种重组猪釉原蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白，尤其涉及一种重组猪釉原蛋白及其制备方法。
背景技术：
釉基质蛋白(enamel matrix proteins, EMPs)是牙齿发育到钟状期，由内釉上皮细胞分化而来的成釉细胞合成和分泌一系列细胞外基质蛋白。自1975年首次提出来自赫特威氏上皮根鞘的釉质相关蛋白可以诱导牙根部无细胞性牙骨质形成以后，体外实验和临床治疗广泛证实EMPs能有效促进牙周韧带、牙骨质、牙槽骨再生，形成类似正常的牙周组
织的排列，达到真正的牙周再生。发育中EMPs最主要的成分-釉原蛋白(amelogenin,
Am)，也是EMPs中促进牙周再生的主要活性成分。但Am的组成不是单一的，至少有9种成分，分子量范围5 27kD。目前广泛应用于牙周再生的基础研究和临床应用的EMPs基本为提取的猪釉基质蛋白，其主要的成分是分子量为20kD、13kD、llkD的Am。提取的猪釉基质蛋白主要是几种釉原蛋白的混合成分，其提取效率及组分稳定性影响到蛋白的功能。其次提取的猪EMPs是异源性蛋白，可能存在免疫原性的问题。目前唯一的轴基质蛋白市售商品 Emdogaiη 的有效成分也是从猪牙胚组织中提取的轴原蛋白的衍生物。其完全依赖进口，售价昂贵，用于基础研究和临床治疗所需成本较高。目前国内尚未见有人工合成的单一组分的猪釉原蛋白(pAm)。Am是成釉细胞中Am基因的表达产物。猪有两个Am基因，分别定位于X染色体和Y染色体上。逆转录PCR证实主要的转录本来自于X染色体，Y染色体上的釉原蛋白基因也可转录，约占总转录本的10%。猪Am基因至少包括7个外显子，存在至少有9种选择剪切的方式，编码的九种不同Am在组织中的含量并不相等。剪切去掉外显子4是最常见的一种剪切方式，由它编码的Am在发育的釉质中最多见。研究证实成熟的猪Am的主要成分是X染色体上Am基因的翻译产物——由175个氨基酸残基组成的Mrl. 96X IO4蛋白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组猪釉原蛋白及其制备方法，以及含有全长猪釉原蛋白基因的重组原核表达载体和由该重组原核表达载体转化的大肠杆菌菌株。本发明提供了一种重组猪釉原蛋白的制备方法，包括以下步骤步骤I，合成全长猪轴原蛋白基因；步骤2，构建含有上述基因的重组原核表达质粒PGEX4Tl_pAm ；步骤3，将步骤2获得的重组原核表达质粒PGEX4Tl-pAm转化菌株E. col1. BL21 ；步骤4，诱导步骤3获得的重组菌株表达融合蛋白GST-pAm ；步骤5，切除步骤4获得的融合蛋白GST-pAm的GST标签蛋白，获得重组猪釉原蛋 白 pAm。其中，步骤I中所述全长猪轴原蛋白基因的喊基序列如SEQ ID NO.1所不。优选地，在步骤2中，构建重组原核表达质粒PGEX4Tl_pAm采用内切酶ECoR I和Sal I，酶切引物分别为5’ -CCGGAATTCATGCCTCTACCACCTCATCCTG-3’ 和5， -ACGCGTCGACTTAATCCACTTCCTCCCG CTTG-3，。优选地，步骤4中，通过异丙基硫代-D半乳糖苷(IPTG)诱导步骤3获得的重组菌株表达融合蛋白GST-pAm。优选地，步骤5为纯化步骤4获得的融合蛋白GST-pAm，切除GST标签蛋白，获得纯化的重组猪釉原蛋白pAm。其中，步骤4获得的融合蛋白GST-pAm通过GST亲和层析纯化。 优选地，步骤5中切除GST标签蛋白采用凝血酶。本发明提供了一种上述方法制备的重组猪釉原蛋白。所述重组猪釉原蛋白由全长猪釉原蛋白基因(pAm基因)编码，其中，所述全长猪釉原蛋白基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供了一种含有全长猪釉原蛋白基因的重组原核表达载体，其中，在原核表达质粒PGEX4T1中包含有SEQ ID NO.1核苷酸序列。本发明还提供了一种上述含有全长猪釉原蛋白基因的重组原核表达载体转化的大肠杆菌菌株。使用PGEX4T系列质粒所表达的融合蛋白带有谷胱甘肽S转移酶(GST)标记，GST本身是解毒过程中重要的转移酶，由于其高度可溶可利用它来增加外源蛋白的可溶性，且其在大肠杆菌中可以大量表达起到一种促进表达量提高的作用。同时在GST与多克隆位点之间存在可以将GST切除的蛋白酶识别位点，可以将GST切除。E. Co I1. BL21是专门设计用于在大肠杆菌中表达异源性蛋白的宿主菌，它可以通过改变IPTG诱导浓度精确控制表达水平的优点，并具有Ion和ompT缺陷型特点，能增加蛋白稳定性。根据研究目的的需要，首次合成全长猪釉原蛋白的编码序列，并通过原核表达质粒在大肠杆菌中成功表达了融合蛋白。该发明所得的克隆表达菌株可长期保存，并随时大量复制，能够较为方便快捷的大量人工合成重组猪釉原蛋白(pAm)，也为将来釉原蛋白的批量化生产以及商品化提供了可能。
图1为原核表达载体质粒PGEX4T1的结构示意图。图2为全长猪釉原蛋白基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图M为DNA模板，I为全长猪釉原蛋白基因扩增产物，2为阴性对照。图3为重组质粒酶切鉴定电泳图M为DNA模板；1为目的基因片段pAm, 2为质粒PGEX4T1经EcoR I和Sal I双酶切样品，3为重组质粒经EcoR I和Sal I双酶切样品。图4为重组猪釉原蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图M为低分子量标准蛋白；(为转化了空白质粒PGEX4T1的对照菌株诱导后的样品；1飞分别为I飞号表达克隆诱导后的样品，M为低分子量标准蛋白。图5为重组猪釉原蛋白的纯化结果图A为SDS-PAGE电泳图，B为Western-blot鉴定图。其中Marker为低分子量标准蛋白，rPAm为纯化后的重组猪釉原蛋白，EMD为实验室提取的轴基质蛋白样品。图6为重组猪釉原蛋白rPAm质谱分析结果图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的描述，以更好地理解本发明。1、克隆全长猪轴蛋白基因(pAm基因)一、主要实验材料1.主要试剂及溶液(I)小量胶回收试剂盒(天根公司)(2) PCR 试剂Taq DNA 聚合酶、IOX 扩增缓冲液、MgCL2、10mmol/L 4XdNTP(Promeg 公司)
(3) DNA marker (天根公司)(4) 6X琼脂糖电泳上样液(Takara)。(5) 50XTAE 缓冲液242g Tris 碱、57.1ml 冰乙酸、IOOml O. 5mol/L EDTAPH=8.0，加双蒸水定容至1L。2.实验仪器(I)台式离心机GB7676-87 (上海离心机械厂)(2) U-3000 分光光度计(Hitachi 公司)(3) 9600 — PCR 仪(PE 公司)(4)稳流稳压电泳仪DY-501 (Pharmacia公司)二、实验方法1.引物设计(I) pAm基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示,具有特点如下1 59位包含有5’帽结构，5’非翻译区及启动子等结构，6(Tl07位编码信号肽，108飞29位编码全长蛋白，63(Γ778位为3’非翻译区，包括PolyA尾，因此靶基因的扩增范围为108飞29位。选取pAm基因序列中不存在酶切位点而在质粒中存在克隆位点的两个内切酶作为将目的基因克隆入载体中内切酶。设计带有酶切位点的引物，确保PCR产物在包含完整的PAm基因序列的同时引入酶切位点。以DNA Star软件对pAm基因序列进行分析，此序列108 629位间不存在酶切位点的内切酶如下AatII AccI AclI AfeI AflII AflIII AgeI AhdI ApaI ApaLI ApoI AscI AseIAvail AvrII BaeI Bael’ BanII BbeI BbsI BbvCI BcgI Bcgl’ BciVI BclI BfaI BglIBglII BlpI BplI BplI’ BpmI BpulOI BsaAI BsaBI BsaHI BsaI BsaffI BsaXI BsaXI'BseMII BseRI BsiEI BsiHKAI BsiffI BsmBI BsmFI BsmI BspEI BspHI BsrBI BsrDI BsrFIBsrGI BssHII BssSI BstBI BstEII BstUI BstXI BstZ17I Bsu36I BtrIBtsI ClaIDdeI DraI DraIII DrdI EagI EarI EciI EcoICRI EcoNI Eco0109I EcoRI EcoRV FseIFspI HaeII HgaI HhaI HinPlI HincII HpaI Hpy99I HpyCH4III HpyCH4IV KasI MboIIMfeI MluI MspAlI NaeI NarI NdeI NgoMIV NheI NotI NruI NsiI NspI PacI PciI PmeIPmlI PpulOI PpuMI PshAI PsiI PspOMI PvuI PvuII RsrII SacI SacII Sail SanDI SapISau96I SbfI Seal SexAI SfiI SfoI SgfI SgrAI SmlI SnaBI SpeI SphI SrfI SspI StuISwaI TaqI TatI TfiI TscI Tsp509I TspRI TthlllI XbaI XcmI XhoI XmnI
(2)载体质粒PGEX4T1的结构示意图见图1。比较pAm基因序列中不存在的酶切位点和质粒中存在的克隆位点后，选取EcoR I和Sal I作为将目的基因克隆入载体中内切酶。按照上述引物设计要求设计引物如下Am-EcoR I 5’ CCG GAA TTC ATG CCT CTA CCA CCT CAT CCT G 3’；Am_Sal I 5’ACGC GTCGAC TTA ATC CAC TTC CTC CCG CTT G 3’。2.含有酶切位点的pAm基因的人工合成和扩增(I)由上海旭冠生物科技发展有限公司人工合成含有酶切位点的pAm基因。(2) PCR 扩增 pAm 基因以人工合成的pAm基因为模板，扩增全长猪釉原蛋白基因。以无菌水代替DNA模板，作为阴性对照。产物上样进行琼脂糖凝胶电泳检验。反应体系如下ddH20 9.8μ1 ； IOXBuffer 2 μ I ；MgC121. 2μ I ；4dNTPs 2μ1;模板 cDNA 2 μ I ;引物 Am-EcoR I I μ I ；Am-Sal I lyl;Taq 酶 Ιμ 。反应参数94°C，5 分钟；(94°C，30 秒；56°C，30 秒；72°C，45秒)X 30循环；72°C，5分钟，反应结束。3.琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(I)配置1. 5%琼脂糖凝胶，凝固后放入含有TAE的电泳槽中。(2)取O. 5 μ I 6Χ点样液在点样板上，加入2 μ I样品混匀。(3)上样，80V，30min。(8)紫外灯下观测电泳结果并拍照。4. PCR产物回收(割胶回收试剂盒)对PCR扩增产物进行回收(I)将PCR产物电泳条带在紫外灯下割下含DNA的琼脂糖块，使其尽可能小。放入1.5ml尚心管内，秤重(胶重=总重量一空管重量)。(2)按每IOOmg琼脂糖加入300 μ I Buffer SI的比例加入SI液，50°C水浴10分钟，每2分钟摇匀一次，直至胶完全溶解。(3)加入1/3 Buffer SI体积的异丙醇，50°C水浴I分钟，混匀。(4)将溶解的胶液转移到吸附柱内，15000 rpm，离心I分钟。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管。如胶液体积大于柱容量，则离心完后，再次移液于同一柱内，再次离心。(5)在柱内加入500 μ I Bufferffl, 10000 rpm,离心15秒。弃去离心液,柱子重新
置于同一回收管内。(6)在柱内加入500 μ I BufferWl，静置I分钟，10000 rpm离心I分钟。弃去离心液，柱子重新置于同一回收管内。(7)将柱子以10000 rpm再次离心I分钟。(8)将柱子置于一个新的1. 5ml离心管内，柱模中央加30 μ I无菌水，50°C水浴或室温放置2分钟。(9) 15000rpm，离心I分钟，收集离心液。(10)取2 μ I离心液，琼脂糖凝胶电泳检测，电泳步骤同前。5.测序鉴定目的基因对割胶回收的PCR产物送上海生物工程公司测序，并用DNA Star软件将测序结果与Gene Bank公布的标准序列比对。
三、结果1.目的基因的鉴定琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示，PCR扩增后样品组特异性扩增产物大小约540bp，与预期所得的pAm mRNA编码区碱基长度一致。而阴性对照无特异性产物。测序证实PCR的扩增产物与Gene Bank公布的猪釉原蛋白标准序列完全一致。I1、构建含有pAm基因的重组原核表达质粒PGEX4Tl_pAm一、主要实验材料 1.原料(I) PGEX4T1 载体质粒(GE healthcare 公司)(2)大肠杆菌DH5a感受态细菌(上海生物工程公司)2.主要试剂(I)限制性内切酶 EcoR I，Sal I，IOXK Buffer (TakaRa 公司，大连)(2) T4 DNA Ligase (TakaRa 公司，大连)( 3 )氨苄青霉素(Roche公司)(4)氯霉素(5)小量质粒抽提试剂盒(天根公司，北京)使用前将试剂盒中提供的RnaseA全部加入溶液P1，混匀后2 8°C保存。使用前漂洗液PW中加入4倍体积无水乙醇。(6)小量凝胶回收试剂盒(天根公司，北京)(7)液体LB培养基细菌培养用胰化蛋白胨10g，细菌培养用酵母提取物5g，NaClIOgo上述成分配制后，加入适量双蒸水，磁力加热搅拌器上充分溶解，5M NaOH调节pH至7.0，补双蒸水至1000ml。121°C高压蒸汽灭菌20分钟，冷却后4°C冰箱保存。(8)固体LB培养基细菌培养用胰化蛋白胨10g，细菌培养用酵母提取物5g，NaClIOg,琼脂(agarose) 15g。上述成分配制后,加入适量双蒸水,磁力加热搅拌器上充分溶解，5M NaOH调节pH至7.0，补双蒸水至1000ml。121 °C高压蒸汽灭菌20分钟，取出后在超净工作台中加入氨苄青霉素至终浓度为100 μ g/ml，浇制平皿，冷却后4°C冰箱保存。3.主要仪器( I) YJ-1FB医用净化工作台(吴江市净化设备总厂)(2)台式离心机GB7676-87 (上海离心机械厂)(3)U-3000 分光光度计(Hitachi 公司)(4) 9600 — PCR 仪(PE 公司)(5) Molecular Imager Fx 和 Quantity One 软件(Bio-Rad 公司)(6)恒温摇床(YHZ-22江苏太仓王秀试验设备厂)二、实验方法1.载体的制备PGEX4T1质粒抽提(I)将购买的含有质粒PGEX4T1的E.Col1.DH5a菌株用划线法接种于含氨苄青霉素100 μ g/ml的LB固体培养基平皿上，37°C温箱孵育过夜，活化菌种。(2)次日下午挑取4个单菌落接种于4支含5ml LB液体培养基(氨苄青霉素100 μ g/ml)的烧瓶内，摇床内37°C，200rpm过夜。(3)将以上菌液转入4个1. 5ml离心管，lOOOOrpm，离心I分钟，弃上清，吸干残液。
(4)在离心管内加入250 μ I溶液Ρ1，振荡混匀。(5)加入250 μ I溶液Ρ2，温和地上下翻转4 一 6次充分裂解菌体。(6)加入350μ I溶液Ρ3，立即温和地上下翻转6 — 8次，充分混匀，见白色絮状沉淀后12000rpm,离心10分钟。(7)柱平衡将吸附柱083放入收集管中，加入50(^1平衡液此，12000印111，离心
I分钟。倒掉收集管中废液。(8)小心的将步骤6中的上清吸取至吸附柱CB3中，室温放置I 一 2分钟，12000rpm
离心I分钟。倒掉收集管中废液。(9)向吸附柱CB3中加入700 μ I漂洗液PW，12000rpm离心I分钟。倒掉收集管中废液。(10)向吸附柱CB3中加入500 μ I漂洗液PW，12000rpm离心I分钟。倒掉收集管
中废液。(11)将吸附柱CB3重新放回收集管中，12000rpm离心2分钟，除尽残液。(12)将吸附柱CB3放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央加50 μ I洗脱缓冲液EB,室温放置2分钟。12000rpm离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管中。2.重组质粒的构建(I)目的基因pAm及质粒PGEX4T1的双酶切目的基因pAm与质粒PGEX4T1分别用ECoR I和Sal I在37°C H型通用缓冲液中进行双酶切4h，。反应体系见下表1、2。表I目的基因酶切反应体系(μ I)
权利要求
1.一种重组猪釉原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1，合成全长猪釉原蛋白基因；步骤2，构建含有上述基因的重组原核表达质粒PGEX4Tl-pAm ；步骤3，将步骤2获得的重组原核表达质粒PGEX4Tl-pAm转化菌株E. col1. BL21 ；步骤4，诱导步骤3获得的重组菌株表达融合蛋白GST-pAm ；步骤5，切除步骤4获得的融合蛋白GST-pAm的GST标签蛋白，获得重组猪釉原蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组猪釉原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤I中所述全长猪轴原蛋白基因的喊基序列如SEQ ID NO.1所不。
3.根据权利要求1所述的重组猪釉原蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤2中，构建重组原核表达质粒PGEX4Tl-pAm采用内切酶ECoR I和Sal I，酶切引物分别为5’_CCGGAA TTCATGCCTCTACCACCTCATCCTG-3，和 5， -ACGCG TCGACTTAATCCACTTCCTCCCGCTTG-3，。
4.根据权利要求1所述的重组猪釉原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤4中，通过异丙基硫代-β -D半乳糖苷诱导步骤3获得的重组菌株表达融合蛋白GST-pAm。
5.根据权利要求1所述的重组猪釉原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤5为纯化步骤4获得的融合蛋白GST-pAm，切除GST标签蛋白，获得纯化的重组猪釉原蛋白pAm。
6.根据权利要求5所述的重组猪釉原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤4获得的融合蛋白GST-pAm通过GST亲和层析纯化。
7.根据权利要求1或5所述的重组猪釉原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤5中切除 GST标签蛋白采用凝血酶。
8.—种如权利要求1所述方法制备的重组猪釉原蛋白。
9.一种含有全长猪釉原蛋白基因的重组原核表达载体，其特征在于，在原核表达质粒 PGEX4T1中包含有SEQ ID NO.1核苷酸序列。
10.一种由权利要求9所述重组原核表达载体转化的大肠杆菌菌株。
全文摘要
本发明提供了一种重组猪釉原蛋白，由全长猪釉原蛋白基因编码，制备方法为合成全长猪釉原蛋白基因；构建含有上述基因的重组原核表达质粒PGEX4T1-pAm；将获得的重组原核表达质粒PGEX4T1-pAm转化菌株E.coli. BL21；诱导获得的重组菌株表达融合蛋白GST-pAm；切除获得的融合蛋白GST-pAm的GST标签蛋白，获得重组猪釉原蛋白pAm。首次合成全长猪釉原蛋白的编码序列，并通过原核表达质粒在大肠杆菌中成功表达了融合蛋白。该发明所得的克隆表达菌株可长期保存，并随时大量复制，能够较为方便快捷的大量人工合成重组猪釉原蛋白，也为将来釉原蛋白的批量化生产以及商品化提供了可能。
文档编号C12N15/70GK103014050SQ20131000260
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月5日 优先权日2013年1月5日
发明者束蓉, 程岚, 李希庭, 林智恺, 宋忠臣 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院