专利名称：用于确定柳枝稷生态型的srap特异性分子标记引物及柳枝稷生态型检测方法
技术领域：
本发明涉及植物遗传育种技术领域，尤其涉及用于确定柳枝稷生态型的SRAP特异性分子标记引物及柳枝稷生态型检测方法。
背景技术：
随着人类社会的发展，能源需求逐年增加。同时，消费矿物燃料所导致的大气污染、全球气候变暖等一系列的环境问题日益严重，所以人类迫切需求可再生清洁能源。生物质能源是可再生能源，具有可贮藏性及连续转化的特征，成为最有前景的替代能源。
柳枝稷(Panicumvirgatum)为禾本科(Gramineae)黍属(Panicum)多年生暖季型丛生禾草，具有适应性强，较高的产量潜力和较强的耐旱耐脊能力等特点，对环境友好。 柳枝稷是一种C4植物，生产力高，根系发达，耐瘠薄、洪涝和干旱，能够抵抗多种病虫害，易于收割贮存。柳枝稷作为能源草，其细胞壁可被消化为糖类并随之发酵生产燃料乙醇，成本低。此外，利用柳枝稷生产清洁能源可获得显著能量回报，大幅减少排放到大气中的碳，研究者普遍认为柳枝稷是目前最理想的生物燃料作物之一。
但是，柳枝稷在长期的进化过程中，形 成了许多生态型和变种，主要的两种生态型为高地生态型，主要分布在美国中部和北部地区，适应干旱环境，茎杆较细，分枝多，在半干旱环境中生长良好；低地生态型，主要分布于潮湿地带，诸如漫滩、平原，植株高大，茎杆粗壮，成束生长。据报道低地生态型品种都是四倍体，高地生态型品种多为四倍体或八倍体。低地型柳枝稷比高地型柳枝稷更高大，两种生态型在光合作用、抗旱性及对水分和氮的有效利用率方面存在差异。
从性状上看，低地型柳枝稷更适合被开发为生物燃料乙醇的能源植物；而高地型在抗寒性方面表现好于低地型。因此，柳枝稷生态型类别的鉴定工作极为重要。
然而，对于柳枝稷的生态型类别的鉴定通常采用的方法是等待植株成熟之后进行形态观察，但这种方法须观察植株外形，如植物的根、茎及分枝情况等，且必须等到植株长至一定大小。其鉴定周期长，种植成本高；再者，植株的许多形态学特征往往随着生长条件的不同而发生变化；而且许多鉴别特征不具有较强的特殊性，导致分类困难，且存在较大的人为操作误差，所需要的周期较长，且存在较大的系统误差。
随着分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记和基因标记技术的建立和成熟，为发展简便、快速、准确的种质鉴定技术提供了有效手段。SRAP即相关序列扩增多态性 (Sequence related amplified polymorphism),是一种新型的基于 PCR 的分子标记方法， 也称基于序列扩增多态性(Sequence based amplif iedpolymorphism, SBAP)。该标记方法通过独特的双引物设计对基因的ORFs (Open reading frames)的特定区域进行扩增上游引物长17bp，对外显子区域进行特异扩增，下游引物长18bp，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。因不同个体以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态性。该标记具有简便、高效、产率高、重复性好、易测序、便于克隆目标片段等特点，目前已成功地应用于作物遗传多样性分析、遗传图谱的构建、重要性状的标记以及相关基因的克隆等方面。 但是，目前尚无关于柳枝稷的SRAP标记研究的报道。发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种用于确定柳枝稷生态型的SRAP 特异性分子标记引物及柳枝稷生态型检测方法，利用高地型柳枝稷中所特有的特异性标记实现柳枝稷生态型的早期鉴定。
本发明提供了一种SRAP引物组，由具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物组成。
本发明还提供了具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的下游引物组成的引物组在鉴定柳枝稷生态型中的应用。本发明还提供了由具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物组成的SRAP引物组在鉴定柳枝稷生态型中的应用。
本发明提供的引物在进行柳枝稷生态型鉴定中具有良好的准确性。SRAP技术最早在芸薹属作物中开发出来，目前尚无关于柳枝稷的SRAP标记研究的报道。本发明采用SRAP 技术对柳枝稷的生态型进行鉴定，可实现柳枝稷生态型的早期鉴定，提高检测效率，排除传统鉴定方法中不确定的人为因素对鉴定结果的影响。
另外，本发明提供了一种柳枝稷生 态型检测试剂盒，其包括Taq酶和用于柳枝稷生态型鉴定的SRAP引物组；
其中，用于柳枝稷生态型鉴定的SRAP引物组包括具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物。
优选地，柳枝稷生态型检测试剂盒中的Taq酶采用GoTaq酶。
优选地，柳枝稷生态型检测试剂盒中还包括303bp的分子量标记。
本发明还提供了一种鉴定柳枝稷生态型的特异性分子标记，具有如SEQ ID N03 所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种柳枝稷生态型的检测方法，该方法包括以下步骤
步骤1:用具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO :2所示核苷酸序列的下游引物对柳枝稷基因组DNA进行扩增，获得扩增产物；
步骤2 :取扩增产物电泳，根据电泳的结果鉴定柳枝稷的生态型；若扩增产物的电泳结果中呈现303bp的特异性条带，则所测柳枝稷为高地型；若扩增产物的电泳结果中未呈现303bp的特异性条带，则所测柳枝稷为低地型。
其中，303bp的特异性条带的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
该序列即为柳枝稷生态型的特异性标记，该特异性分子标记在所有高地型材料中出现而不在低地型材料中出现，对该序列进行序列分析结果表明，该序列不能翻译成氨基酸序列。
优选地，柳枝稷生态型的检测方法中的扩增所采用的程序为
94°C 预变性 5min ；
94°C变性 Imin，35O 复性 lmin，72°C延伸 lmin，共 5 个循环；
94°C 变性 Imin，50 O 复性 lmin，72°C 延伸 Imin，共 35 个循环；
72O延伸 IOmin。
优选地，柳枝稷生态型的检测方法中的扩增所采用的体系包括柳枝稷基因组 DNA、Taq酶、具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物、dNTPs、MgCl2、灭菌水。
更优选地，Taq酶采用GoTaq酶；最优选地，Taq酶采用购自Promega公司的2XGoTaq Green Master Mix 预混 Taq 酶。
更优选地，取灭菌水将具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物溶解为溶液， 使其终浓度以摩尔浓度计为 ο μ mol/L ;取灭菌水将具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的下游引物溶解为溶液，使其终浓度以摩尔浓度计为10 μ mol/L。
更优选地，柳枝稷基因组DNA溶解于灭菌水中，质量-体积浓度为20ng/ μ L。
最优选地，柳枝稷生态型的检测方法中的扩增所采用的体系包括
柳枝稷基因组DNA溶液2 μ L ;
2 X GoTaq Green Master Mix10 μ L ；
具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物溶液 IyL;
具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的下游引物溶液 IyL;
灭菌水6 μ L ;
另外，在本发明的一些实施例中，对扩增产物电泳的介质采用琼脂糖凝胶。
优选地，琼脂糖凝胶中的琼脂糖的含量以质量分数计为2%。
本发明提供了用于确定柳枝稷生态型的SRAP特异性分子标记引物及柳枝稷生态型检测方法，本发明提供的SRAP引物组由具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物组成。采用本发明提供的引物及利用SRAP 技术，则可以利用植物组织准确的对柳枝稷的生态型进行鉴定，从而实现柳枝稷生态型的早期鉴定。而且，这种鉴定方法操作简单，周期短，对柳枝稷生态型的鉴定非常快捷准确，提高了检测效率，且避免了传统方法中不确定的人为因素对鉴定结果的影响。实验表明，本发明提供的引物用于柳枝稷生态型鉴定的准确度可达到100%。
图1示SRAP特异性分子标记鉴定结果，其中泳道f 12为低地型柳枝稷的SRAP特异性分子标记鉴定结果，泳道13 24为高地型柳枝稷的SRAP特异性分子标记鉴定结果，泳道25为DNA分子量标记。
具体实施方式
本发明提供了一种用于确定柳枝稷生态型的SRAP特异性分子标记引物及柳枝稷生态型检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种SRAP引物组，由具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物组成。
本发明还提供了具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的下游引物组成的引物组在鉴定柳枝稷生态型中的应用。本发明还提供了由具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物组成的SRAP引物组在鉴定柳枝稷生态型中的应用。
本发明提供的引物组中，上游引物长17bp，下游引物长18bp，在对柳枝稷的生态型进行鉴定时，能够表现出良好的准确性。从而达到在柳枝稷生长发育早期对其生态型进行鉴定的目的。
另外，本发明提供了一种柳枝稷生态型检测试剂盒，其包括Taq酶和用于柳枝稷生态型鉴定的SRAP引物组；
其中，用于柳枝稷生态型鉴定的SRAP引物组包括具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物。
为了达到更好的扩增效果，柳枝稷生态型检测试剂盒中的Taq酶采用GoTaq酶。
为方便使用，柳枝稷生态型检测试剂盒中还包括303bp的分子量标记。
本发明还提供了一种鉴定柳枝稷生态型的特异性分子标记，具有如SEQ ID NO 3 所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种柳枝稷生态型的检测方法，该方法包括以下步骤首先，用具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物对柳枝稷基因组DNA进行扩增，获得扩增产物；然后，取扩增产物电泳，根据电泳的结果鉴定柳枝稷的生态型；扩增产物的电泳结果中若呈现303bp的特异性条带，则柳枝稷为高地型；若扩增产物的电泳结果中未呈现303bp的特异性条带，则柳枝稷为低地型。
其中，303bp的特异性条带的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
该序列即为柳枝稷生态型的特异性标记，该特异性分子标记在所有高地型材料中出现而不在低地型材料出现，对该序列进行序列分析表明，该序列不能翻译成氨基酸序列。
为使扩增效果更佳，柳枝稷生态型的检测方法中的扩增所采用的程序为
94°C 预变性 5min ；
94°C变性 Imin，35O 复性 lmin，72°C延伸 lmin，共 5 个循环；
94°C变性 lmin,50°C复性 lmin, 72。。延伸 lmin,共 35 个循环；
72O延伸 IOmin。
为达到更好的扩增效果，柳枝稷生态型的检测方法中的扩增所采用的体系包括 柳枝稷基因组DNA、Taq酶、具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物、具有SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的下游引物、dNTPs、MgCl2、灭菌水。
为提高扩增效率，Taq酶采用GoTaq酶；为进一步提高扩增效率，Taq酶采用购自 Promega 公司的 2XGoTaq Green Master Mix 预混 Taq 酶。
为方便使用，取灭菌水将具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物溶解为溶液，使其终浓度以摩尔浓度计为 ο μ mol/L ;取灭菌水将具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物溶解为溶液，使其终浓度以摩尔浓度计为IO μ mo I /L。
为方便使用，柳枝稷基因组DNA溶解于灭 菌水中，质量-体积浓度为20ng/yL。
为达到最佳的扩增效果，柳枝稷生态型的检测方法中的扩增所采用的体系包括
柳枝稷基因组DNA溶液2 μ L ;
2 X GoTaq Green Master Mix10 μ L ；
具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物溶液IyL;
具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的下游引物溶液IyL;
灭菌水6 μ L ;
在本发明的实施例中，柳枝稷基因组DNA溶液的中柳枝稷基因组DNA的质量-体积浓度为20ι^/μ ;具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物溶液和具有SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的下游引物溶液的浓度皆为10 μ mol/L。
另外，在本发明的实施例中，对扩增产物电泳的介质采用琼脂糖凝胶。
琼脂糖凝胶电泳中采用的琼脂糖凝胶中的琼脂糖的含量以质量分数计为2%。
琼脂糖凝胶电泳中采用的染料为溴乙锭。
琼脂糖凝胶电泳中采用的电泳缓冲液为Tris-硼酸缓冲液。
本发明提供了用于确定柳枝稷生态型的SRAP特异性分子标记引物及柳枝稷生态型检测方法，本发明提供的SRAP引物组由具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物组成。采用本发明提供的引物及利用SRAP 技术 ，则可以利用植物组织准确的对柳枝稷的生态型进行鉴定，从而实现柳枝稷生态型的早期鉴定。而且，这种鉴定方法操作简单、周期短，对柳枝稷生态型的鉴定非常快捷准确。提高了检测效率，且避免了传统方法中不确定人为因素对鉴定结果的影响，实践表明，本发明提供的引物用于柳枝稷生态型鉴定的准确度可达到100%。
本发明采用的药品、试剂皆为市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明
实施例1柳枝稷生态型的SRAP特异性分子标记鉴定
收集柳枝稷种质资源共计24份，并种植大田，待到成熟期根据柳枝稷植株成熟时的形态学特征，对柳枝稷的生态型进行鉴定。鉴定结果表明，收集到的种质资源中，高地形资源12份，低地型资源12份。
对待鉴定的植株，每份种质随机选取12个单株的幼嫩叶片剪碎，用于柳枝稷生态型的鉴定。
首先，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取柳枝稷基因组DNA。提取的DNA用O. 8% 的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计进行纯度和浓度的检测，并根据检测结果将样品稀释成20ng/y L，在4°C下保存备用。
将SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的下游引物分别稀释，至浓度为IOpmol/μ L。具体操作方法为取2(^1^浓度为20(^11101/^1^的引物原液，加入新的1.5mL离心管内；再加入380 μ L无菌水，充分混匀。
然后，分别配制24份种质资源的SRAP-PCR的反应体系，每个种质资源的反应体系中各组分的量为
该种质资源柳枝稷基因组DNA溶液2 μ L ;
2 X GoTaq Green Master Mix10 μ L ；
具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的上游引物溶液I μ L ;
具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的下游引物溶液I μ L ;
灭菌水6 μ L ；
每个SRAP-PCR反应体系为20 μ L，共计24个反应体系。
将配制好的24个反应体系依次加入96孔PCR板上，每孔20 μ L体系，振荡PCR板，使各组分充分混匀，然后低速短暂离心^fPCR板放到PCR仪器中，设定程序进行扩增；
SRAP-PCR反应程序为
94°C预变性5min ；
94°C变性lmin ；
35°C复性lmin ；
72°C延伸lmin ；
共5个循环；
94°C变性lmin ；
50°C复性lmin ；
72°C延伸lmin ；
共35个循环；
最后72°C延伸IOmin0
将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，具体为采用2. 0%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，用终浓度为O. lmg/mL的溴化乙锭(EB)对扩增产物进行染色，120V电压(5V/cm)在 O. 5XTBE缓冲液中电泳约1. 5h，电泳结束后凝胶在凝胶成像系统(Bio-rad)中照相并保存。
电泳结果如图1所示，对电泳结果进行分析。如果出现303bp的特异性条带则为高地型，如果不出现此条带则为低地型。分析结果表明，24份种质资源中，12份高地形种质中皆出现303bp的特异性条带，12份低地型种质中皆不出现303bp的特异性条带。SRAP特异性分子标记鉴定结果与传统方法鉴定结果完全吻合，准确率可达到100%。
实施例2柳枝稷生态型鉴定试剂盒用于鉴定柳枝稷生态型
采用本发明提供的柳枝稷生态型检测试剂盒鉴定柳枝稷生态型，试剂盒中包括 2XGoTaq Green Master Mix预混Taq酶、用于柳枝稷生态型鉴定的SRAP引物组和303bp 的分子量标记。其中，303bp的分子量标记具有SEQ ID NO: 3所不核苷酸序列，引物组由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的下游引物组成，将上下游引物分别稀释至浓度为IOpmol/ μ L，依次命名为A液、B液，_20°C保存备用。
采用植物基因组DNA提取试剂盒提取待鉴定柳枝稷的基因组DNA。将提取的DNA 用O. 8%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计进行纯度和浓度的检测，并根据检测结果将样品稀释成20ng/ μ L,在4 C下保存备用。
取试剂盒中的Taq酶，配制反应体系，体系中各组分的量为
待测柳枝稷基因组DNA溶液 2 μ L ;
试剂盒中的Taq酶IOyL;
A 液IyL;
B 液IyL;
灭菌水6yL;
反应体系为20 μ L0
将配制好的反应体系加入PCR板上，每孔20 μ L体系，振荡PCR板，使各组分充分混匀，然后低速短暂离心^fPCR板放到PCR仪器中，设定程序进行扩增；
反应程序为
94°C预变性5min ；
94°C变性lmin ；
35°C复性lmin ；
72°C延伸lmin ；
共5个循环；
94°C变性lmin ；
50°C复性lmin ；
72°C延伸lmin ；
共35个循环；
最后72°C延伸10min。
将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，具体为采用2. 0%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，用终浓度为O. lmg/mL的溴化乙锭(EB)对扩增产物进行染色，将扩增产物上样于琼脂糖凝胶，在一个新的点样孔加入试剂盒中提供的303bp的分子标记，120V电压(5V/cm)在 O. 5XTBE缓冲液中电泳约1. 5h，电泳结束后凝胶在凝胶成像系统(Bio-rad)中照相并保存。
对电泳结果进行分析，如果待鉴定 柳枝稷的基因组扩增产物泳道出现具有SEQ ID 勵:3所示核苷酸序列的3036 的特异性条带则为高地型；如果待鉴定柳枝稷的基因组扩增产物泳道不出现具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的303bp的特异性条带则为低地型。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种SRAP引物组，其特征在于，由具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物组成。
2.如权利要求1所述的SRAP引物组在鉴定柳枝稷生态型中的应用。
3.一种柳枝稷生态型检测试剂盒，其特征在于，其包括Taq酶和用于柳枝稷生态型鉴定的SRAP引物组；其中，所述用于柳枝稷生态型鉴定的SRAP引物组包括具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列的下游引物。
4.根据权利要求3所述的柳枝稷生态型检测试剂盒，其特征在于，所述Taq酶为GoTaq酶。
5.一种鉴定柳枝稷生态型的特异性分子标记，其特征在于，具有如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。
6.一种柳枝稷生态型的检测方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1:用具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的下游引物对柳枝稷基因组DNA进行扩增，获得扩增产物；步骤2 :取所述扩增产物电泳，根据所述电泳的结果鉴定所述柳枝稷的生态型；所述扩增产物的电泳结果中呈现303bp的特异性条带，所述柳枝稷为高地型；所述扩增产物的电泳结果中不呈现303bp的特异性条带，所述柳枝稷为低地型；其中，所述303bp的特异性条带的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤I中所述扩增的程序为94°C预变性5min ；94°C变性Imin，35O复性lmin，72°C延伸lmin，共5个循环；94°C变性Imin，50 O复性lmin，72°C延伸Imin，共35个循环；72°C延伸 lOmin。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤I中所述扩增的体系包括所述柳枝稷基因组DNA、Taq酶、所述具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的上游引物、所述具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列的下游引物、dNTPs、MgCl2、灭菌水。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述电泳的介质采用琼脂糖凝胶。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶中的琼脂糖的含量以质量分数计为2%。
全文摘要
本发明涉及植物遗传育种技术领域，尤其涉及用于确定柳枝稷生态型的SRAP特异性分子标记引物及柳枝稷生态型检测方法。本发明提供了一种SRAP引物组，该引物组由具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的下游引物组成，并提供了一种柳枝稷生态型检测方法用具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQID NO2所示核苷酸序列的下游引物对柳枝稷基因组DNA进行扩增，获得扩增产物；取扩增产物电泳，根据电泳的结果鉴定柳枝稷的生态型。本发明提供的鉴定方法操作简单，周期短，提高了检测效率，且避免了传统方法中不确定的人为因素对鉴定结果的影响。
文档编号C12Q1/68GK102994499SQ20131000242
公开日2013年3月27日 申请日期2013年1月5日 优先权日2013年1月5日
发明者黄琳凯, 张新全, 杨盛婷, 张瑜, 曾兵, 蒋晓梅, 季杨 申请人:四川农业大学