专利名称：海藻酸裂解酶生物合成基因簇的制作方法
海藻酸裂解酶生物合成基因簇技术领域
本发明属于微生物基因工程领域，具体地说，是关于海藻酸裂解酶的生物合成基因簇。
背景技术：
海藻酸(Alginate)，又称褐藻胶，是褐藻细胞壁的主要成分之一。某些细菌家族如固氮菌属(Azotobacter)和假单胞菌属(Pseudomonas)等也产海藻酸,作为细菌的荚膜多糖(Gregory L, Larry HK. Characterization of theexocellular polysaccharides from Azotobacter chroococcum[J]. CarbohydrateResearch, 1988, 181 (1):143-152 ； Alferd L, Russell SJ. A polysaccharide resemblingalginic acid from a Pseudomonas microorganism [J]. Nature, 1964, 204 (10) : 187-188)0 海藻酸分子是由 α _L_ 古洛糖醛酸(G)和β-D-甘露糖醛酸(M)两种残基以1，4-键连接而成，研究发现海藻酸分子由3种模块构成，即均聚古洛糖醛酸片段(Poly-gulutonate，PG)、均聚甘露糖醛酸片段 (Poly-mannuronate, PM)和甘露糖醒酸_古洛糖醒酸混合嵌合片段(MG-block) (Gacesa P. Alginates[J]. Carbohydr Polymers, 1988, 8(3):161-182)。
海藻酸裂解酶，又名解藻酸裂解酶，存在于多种生物体中，如海藻、软体动物、真菌、细菌、噬菌体、病毒等。根据不同的底物特异性，海藻酸裂解酶可分为特异性降解古洛糖醒酸片段的聚古洛糖醒酸裂解酶poly ( a -L-guluronate) lyase和特异性降解甘露糖醒酸偏酸的聚甘露糖醒酸裂解酶poly ( β -D-mannuronate) lyase (Wong TY, Preston LA, Schiller NL. ALGINATELYASE:Review of Major Sources and Enzyme Characteris tics, Structure-FunctionAnalysis,Biological Roles, and Applications[J]. Annual Review of Microbiology, 2000，54 (I) : 289-340)。海藻酸裂解酶通过β-消除反应将海藻酸降解为一系列不饱和的海藻寡糖，分布于多糖裂解酶(polysaccharide lyase, PL)第5,6,7,14,15,17,18 家族中(http://www. cazy. org/Polysaccharide-Lyases. html)。海藻酸裂解酶及其降解海藻酸所产生的海藻寡糖在医药、食品和生物研究领域都具有重要作用。
解藻酸弧菌(Vibrio alginolyticus)是一类革兰氏阴性的海洋细菌，按照伯杰氏细菌手册记载，是一类不产海藻酸裂解酶的细菌。但Kitamikado等人研究发现 V. alginolyticus ATCC17749 株可产胞外海藻酸裂解酶(Tseng C-H. , Yamaguchi K.,Nishimura M. ,Kitamikado M.Alginate Lyase from Vibrioalginolyticus ATCC17749[J], Nippon Suisan Gakkaishi, 1992, 58(11) :2063-2067)，并且分离纯化到一种分子量为47kDa的专一性降解聚甘露糖醛酸片段的海藻酸裂解酶，并且发现该菌株中存在不止一种海藻酸裂解酶(Kitamikado M, TsengCH, Yamaguchi K, Nakamura T. Two types of alginate lyases [J]. Appl EnvironMicrobiol, 1992 ，58 (8) : 2474-2478),但此后关于 V. alginolyticus ATCC17749海藻酸裂解酶的研究一直未有报道。发明内容
本申请的发明人在对V. alginolyticus ATCC17749的研究过程中，从该菌株中克隆得到五个海藻酸裂解酶编码基因，生物信息学分析显示五个基因在染色体上成簇排列。
因此，本发明的目的在于提供海藻酸裂解酶生物合成基因簇。
本发明的海藻酸裂解酶生物合成基因簇包括五个海藻酸裂解酶编码基因，分别为 algVl、algV2、algV3、algV4、algV5，所述基因族来源于 Vibrio alginoIyticusATCCl7749
根据本发明，所述algVl基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第 11909-12952个碱基处，长度为1044个碱基对，编码347个氨基酸。
根据本发明，所述algV2基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第 6948-8513个碱基处，长度为1566个碱基对，编码521个氨基酸。
根据本发明，所述algV3基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第 4747-6498个碱基处，长度为1752个碱基对，编码583个氨基酸。
根据本发明，所述algV4基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第 2259-4424个碱基处，长度为2166个碱基对，编码721个氨基酸。
根据本发明，所述algV5基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第1-2256 个碱基处，长度为2256个碱基对，编码751个氨基酸。
根据本发明，所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO 23所示。
本发明具有如下有益效果
本发明所提供的包含海藻酸裂解酶生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解海藻酸裂解酶的生物合成机制，为海藻酸裂解酶的大规模应用提供丰富的物质和遗传信息。
图1为algVl-algV5基因的PCR扩增产物的电泳鉴定图。其中，M为DNAMarker ；1为 algVl ；2 为 algV2 ；3 为 algV3 ；4 为 algV4 ；5 为 algV5。
图2为PCR所用引物在海藻酸裂解酶生物合成基因簇上的分布位置图。
图3 为 AlgVl-AlgV5 重组蛋白的 SDS-PAGE 检测图。其中，M 为 ProteinMarker ；C 为阴性对照；1 为 AlgVl ；2 为 AlgV2 ；3 为 AlgV3 ；4 为 AlgV4 ；5 为 AlgV5。
图4为AlgVl_AlgV5重组蛋白活性的定性测定结果图。其中，a为阴性对照；b为 AlgVl ；c 为 AlgV2 ；d 为 AlgV3 ；e 为 AlgV4 ；f 为 AlgV5。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本发明中的菌株和质粒信息如下
Vibrio alginolyticus ATCC17749购自北京微生物菌株保藏中心,菌种保藏编号1. 1833。pMD18-T载体购自Takara公司。
本发明中的培养基和培养条件信息如下
V. alginolyticus ATCC17749 的培养基配方如下
液体培养基蛋白胨1%、酵母提取物0. 5%、氯化钠3%、海藻酸钠0. 5% ；
固体培养基蛋白胨1%、酵母提取物O. 5%、氯化钠3%、海藻酸钠O. 5%、琼脂1. 8% ；
培养条件为37 °C培养24 36h。
本发明中的主要试剂信息如下
限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶和Protein Marker均购自TaKaRa公司。 细菌基因组抽提试剂盒、质粒抽提试剂盒和凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。氯化十六烷基吡啶(CPC)和海藻酸钠购自生工生物工程(上海)有限公司。DNAMarker 的片段大小依次为 O. 5,1. 1、1·6、2·6、3· 1、4· 1、5·4、7· 1、9·3 和 17kb。
本发明中所涉及的一般操作方法，包括大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、质粒 DNA的抽提、聚丙烯酰胺凝胶电泳等相关的分子生物学操作参见文献(萨姆布鲁克J，弗里奇EF.分子克隆手册(第2版)[M].北京科学出版社，1998. 1595-1595)。
实施例1、海藻酸裂解酶基因簇的克隆
1.1海藻酸裂解酶基因的克隆
设计并合成一系列引物用于从V. alginolyticus ATCC17749的基因组上扩增海藻酸裂解酶基因algVl、algV2、algV3、algV4和algV5，引物序列及特征如表I所示。
表1、用于PCR扩增algVl_algV5基因的引物特征
权利要求
1.海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇包括五个海藻酸裂解酶编码基因，分别为algVl、algV2、algV3、algV4、algV5，所述基因簇来源于Vibrio alginolyticus ATCC17749。
2.如权利要求1所述的海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述algVl基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第11909-12952个碱基处，长度为1044个碱基对，编码347个氨基酸。
3.如权利要求1所述的海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述algV2基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第6948-8513个碱基处，长度为1566个碱基对，编码 521个氨基酸。
4.如权利要求1所述的海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述algV3基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第4747-6498个碱基处，长度为1752个碱基对，编码 583个氨基酸。
5.如权利要求1所述的海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述algV4基因位于SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列的第2259-4424个碱基处，长度为2166个碱基对，编码 721个氨基酸。
6.如权利要求1所述的海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述algV5基因位于SEQ ID NO 23所示的核苷酸序列的第1-2256个碱基处，长度为2256个碱基对，编码 751个氨基酸。
7.如权利要求1所述的海藻酸裂解酶生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO 23所示。
全文摘要
本发明公开了一种海藻酸裂解酶生物合成基因簇，所述基因簇包括五个海藻酸裂解酶编码基因，分别为algV1、algV2、algV3、algV4、algV5，所述基因簇来源于解藻酸弧菌(Vibrio alginolyticus)ATCC17749。本发明所提供的包含海藻酸裂解酶生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解海藻酸裂解酶的生物合成机制，为海藻酸裂解酶的大规模应用提供丰富的物质和遗传信息。
文档编号C12R1/63GK103060353SQ20131000296
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月5日 优先权日2013年1月5日
发明者叶江, 胥晴晴, 张惠展 申请人:华东理工大学