果胶酸裂解酶变体的制作方法

专利名称：果胶酸裂解酶变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及果胶酸裂解酶变体，该变体相对于显示出果胶酸裂解酶活性作为其主要酶促活性的亲本酶表现出变化；涉及生产这种酶的方法；涉及这种酶在纺织品、洗涤剂和纤维素纤维加工工业中的应用方法。与亲本酶相比，本发明的果胶酸裂解酶变体可以在洗涤剂中显示出提高的稳定性。
背景技术：
果胶聚合物是植物细胞壁的重要组成成分。果胶是一种主链由交替的同聚半乳糖醛酸聚糖(平滑区)和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(毛状区)组成的杂多糖，所述平滑区是1，4连接的α-D-半乳糖醛酸的直链聚合物。半乳糖醛酸残基可以通常以非随机方式在羧基基团上被不同程度地甲酯化，其中，多个聚半乳糖醛酸嵌段被完全甲酯化。
可以将果胶裂解酶(果胶酶)根据其优选底物(高度甲酯化的果胶或低甲酯化的果胶和聚半乳糖醛酸(果胶酸))以及反应机制(β-消除或水解)进行分类。果胶酶可以主要是内切作用，即在链内随机位置切割聚合物产生寡聚物混合物，或者它们可以是外切作用，从聚合物的一端进行攻击并产生单体或二聚体。酶命名法(1992)给出的酶分类中包括了几种作用于果胶平滑区的果胶酶活性，例如果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)、果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)、多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、外切多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)、外切多聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)和外切多聚α-半乳糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.82)。
已经从不同的细菌属如欧文氏菌属(Erwinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和黄单孢菌属(Xanthomonas)克隆了果胶酸裂解酶。还描述了从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Nasser等(1993)FEBS 335319-326)和芽孢杆菌属种YA-14(Kim等(1994)Biosci.Biotech.Biochem.58947-949)克隆果胶酸裂解酶。
果胶酸裂解酶的通常特征是碱性最适pH和对二价阳离子的绝对需要，其中Ca2+最有刺激性。
本发明的一个目的是提供细胞壁降解酶变体，特别是果胶酸裂解酶变体，当应用于例如洗涤剂或纺织品工业过程中时所述变体显示出比其亲本果胶酸裂解酶改进的性能。
发明概述本发明人现在已经发现在具有包括β-螺旋的结构的细胞壁降解酶(特别是果胶酸裂解酶)中某些氨基酸置换可以导致与亲本酶相比在中性或碱性pH范围内具有改善的性能的酶变体。本发明的果胶酸裂解酶变体，当用于洗涤剂组合物中时，具有提高的贮藏稳定性，即对洗涤剂的更低敏感性。
从而，一方面本发明涉及果胶酸裂解酶变体，该变体在一个或多个选自如下位置编号的位置处包含改变5，9，11，26，28，30，31，37，40，45，46，47，48，49，50，51，52，54，61，64，68，69，70，71，74，75，76，79，86，87，91，99，105，106，107，111，115，116，118，122，123，134，136，139，140，141，146，148，156，158，170，182，185，186，189，193，194，196，199，201，202，204，213，215，218，224，228，229，234，235，237，251，256，257，258，272，277，286，295，298，301，302，303，305，307，308，314，316，323，324，326，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，349，356，357，363，366，378，381，384，386，387，389，390，391，393，397，其中这些改变独立地为(i)在占据该位置的氨基酸的下游的氨基酸插入，(ii)占据该位置的氨基酸的缺失，或(iii)占据该位置的氨基酸被不同的氨基酸置换，其中，每个位置都对应于具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的果胶酸裂解酶的氨基酸序列位置，并且其中亲本酶为SEQ ID NO2所示的果胶酸裂解酶或者与SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少65％同一性的果胶酸裂解酶。
在本发明的另一方面，涉及编码果胶酸裂解酶变体的核酸序列。
在本发明的第三方面，提供了表达载体。
在本发明的第四方面提供了用上面提到的表达载体转化的微生物宿主细胞。
在本发明的第五方面提供了提高果胶酸裂解酶的洗涤剂稳定性的方法，该方法包括改变一个或多个氨基酸。
在本发明的第六方面提供了生产根据本发明的果胶酸裂解酶变体的方法，该方法包括培养已经导入了如上所述的表达载体的细胞，由此使所述细胞表达该核酸序列编码的变体，并回收果胶酸裂解酶变体。
本发明的果胶酸裂解酶变体可以用于处理纤维素材料，尤其是含纤维素的纤维，纱线，机织织物或无纺织物；处理机械造纸纸浆或回收利用的废纸；以及用于浸解纤维。此处理可以在把纤维素材料加工成可用于服装制造或织物生产的材料的过程中进行，如在退浆或煮练(scouring)步骤中进行；或在工业或家庭洗涤此类织物或者衣物的过程中进行。
因此，本发明的另一方面涉及含有具有实质上的细胞壁降解活性的果胶酸裂解酶变体的洗涤剂组合物；还涉及本发明的果胶酸裂解酶变体的用途，用于处理例如清洁含有纤维素的纤维、纱线、机织织物或无纺织物。
此外，本发明的其它方面涉及含有本发明的果胶酸裂解酶变体和其它酶的组合的酶组合物，还涉及含有本发明的果胶酸裂解酶变体的清洁或洗涤剂组合物，优选洗衣或洗盘组合物。
本发明的果胶酸裂解酶变体可以非常有效地用于纤维素材料处理时的酶促煮练过程中，例如，以便在随后的染色操作中得到适当反应。
本发明的另一方面涉及酒和汁的加工。本发明的酶或酶制品可用于处理水果和蔬菜的捣碎物以提高捣碎物的可提取性或可降解性。
此外，本发明的一个方面是作为动物饲料添加剂的应用。当加入到含有来自大豆、油菜籽、羽扇豆等的植物材料的饲料中时，该果胶酸裂解酶变体显著提高植物细胞壁物质的体内分解，从而实现了动物对植物营养物的更好利用。
定义在更详细地讨论本发明之前，将首先定义下面的术语和习语。
术语“野生型酶”表示一种酶，该酶是天然存在的微生物，如在自然界发现的真菌或细菌的内源酶。
本文使用的术语“亲本酶”表示一种经修饰后可以产生本发明的酶变体的酶。亲本酶可以是一种分离自天然来源的酶，或是一种已被预先修饰但仍保持了所讨论的酶的特征活性的酶。本发明的亲本果胶酸裂解酶可以是野生型的果胶酸裂解酶。
术语“酶变体”表示氨基酸序列与亲本酶的氨基酸序列相比包含着差异的酶。与亲本酶相比，该差异包括置换、缺失和/或插入。
术语“直向同系物”(或者“物种同系物”)表示从一种物种得到的多肽或蛋白质，其与从不同物种得到的类似多肽或蛋白质同源。
术语“共生同系物”表示从给定物种得到的多肽或蛋白质，其与从该相同物种得到的不同多肽或蛋白质同源。
术语“表达载体”表示线性或环状DNA分子，其包含编码目的多肽的片段及与该片段可操作地连接在一起用于该片段转录的附加片段。所述附加片段可包括启动子和终止子序列，还可任选包括一或多个复制起点，一或多个选择标记，增强子，多聚腺苷酸化信号等。表达载体通常来源于质粒或病毒DNA，或可含有这两者的元件。本发明的表达载体可以是能方便地进行重组DNA操作的任何表达载体，载体的选择通常取决于该载体将要导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，如质粒。可选择地，载体可以是这样一种载体，当其被导入宿主细胞中时，其能整合到宿主细胞的基因组中并与所整合的染色体一起复制。
用于本文中与多肽或蛋白质的表达相关的术语“重组表达”或“重组表达的”是根据本领域的标准定义来限定的。蛋白质的重组表达通常使用上面刚刚描述的表达载体来进行。
术语“分离的”，用于多核苷酸分子时，表示该多核苷酸分子已被移离其天然遗传环境，因此不含其它外源或不需要的编码序列，并且该分子以一种适合用于基因工程化蛋白质生产系统的形式存在。这种分离的分子是与它们的天然环境相分离的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子不含在通常情况下与之相关联的其它基因，但是可包括天然存在的5′和3′非翻译区，如启动子和终止子。相关联区域的鉴定对本领域技术人员是显而易见的(参见例如，Dynan和Tijan，自然316774-78，1985)。术语“分离的多核苷酸”也可以称为“克隆的多核苷酸”。
当用于蛋白质/多肽时，术语“分离的”表示该蛋白质存在于非其天然环境的情况下。在优选形式下，分离的蛋白质实质上不含其它蛋白质，尤其是其它同源蛋白质(即“同源的杂质”，见下文)。优选以纯度在40％以上的形式，更优选纯度在60％以上的形式提供蛋白质。甚至更优选的是以高度纯化形式提供所述的蛋白质，即通过SDS-PAGE测定该蛋白质的纯度在80％以上，更优选95％以上，甚至更优选99％以上。
术语“分离的蛋白质/多肽”也可以称为“纯化的蛋白质/多肽”。
术语“同源杂质”意味着任何来源于与本发明多肽的最初来源细胞同源的细胞的杂质(如非本发明多肽的其它多肽)。
本文所用与特定的微生物源相关的术语“获得自”意指该多核苷酸和/或多肽是由此特定来源或由如下细胞产生，其中所述细胞中已插入来自于该来源的基因。
当涉及DNA片段时，术语“可操作地连接”表示这些片段被排列成能协同地发挥其预期目的的形式，例如，转录在启动子内开始并前进通过编码片段到达终止子。
术语“多核苷酸”表示脱氧核糖核酸或核糖核酸碱基的从5′向3′阅读的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并可从天然来源分离得到或体外合成得到、或由天然和合成分子的组合来制备。
术语“多核苷酸分子的互补物”表示与参照序列相比，具有互补碱基序列并取向相反的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG3′与序列5′CCCGTGCAT3′互补。
术语“简并核苷酸序列”表示包括一或多个简并密码子(与编码多肽的多核苷酸参照序列相比而言)的核苷酸序列。简并密码子包含不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(即GAU和GAC三联体都编码Asp)。
术语“启动子”表示基因的一部分，所述的部分含有可用于RNA聚合酶结合和起始转录的DNA序列。启动子序列通常，但并不总是，位于基因的5非编码区。
术语“分泌信号序列”表示编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列，其中所述多肽作为一更大多肽的一个组成成分将引导所述更大多肽通过细胞——合成此多肽的细胞——的分泌途径。通常此更大的多肽在通过此分泌途径转运的过程中被切割以去除分泌肽。
术语“果胶”表示可被或高或低程度地酯化的果胶酸、聚半乳糖醛酸和果胶。
术语“果胶酶”表示根据现有技术定义的果胶酶，该果胶酶是一组切割果胶物质，主要是聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸酐)及其衍生物的糖苷键的酶(见参考文献Sakai等，果胶、果胶酶和原果胶酶生产、性质和应用，pp213-294Advances in Applied Microbiology vol39，1993)。
优选的本发明果胶酶是通过反式消除作用催化果胶酸(也称聚半乳糖醛酸)中的α-1，4-糖苷键随机断裂的果胶酶，如酶类聚半乳糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.2)(PGL)，也称聚(1，4-α-D-半乳糖醛酸酐)裂解酶，也称果胶酸裂解酶。
术语“耐热性”或“热稳定性”旨在指就热影响而言的蛋白质的稳定性。所有的酶蛋白质在温度上升时都会丧失稳定性并最终降解，每一种酶蛋白质都有一个特定的温度范围，在此范围内该蛋白质是稳定的并保持其酶促活性。热稳定性增加是指酶蛋白质在温度提高时可以保持其酶促活性和/或表现出更高的相对活性。
术语“洗涤剂稳定性”或“贮藏稳定性”意指蛋白在包含洗涤剂(如阴离子表面活性剂)的制品中的稳定性。阴离子表面活性剂的特征是阴离子基团和疏水尾部的组合。因此，当与蛋白结合时，带正电荷的氨基酸残基(如赖氨酸或精氨酸)和疏水区域可能成为与之相互作用的点。相似地，特别柔性的区域将按动力学方式打开以使通常埋在蛋白内部的氨基酸可被接近。这些所述的氨基酸残基典型地是疏水的，因此对该表面活性剂的尾部具吸引力。酶和表面活性剂之间的化学相互作用极为肯定地将使酶失活。因此提高洗涤剂或贮藏稳定性意味着在某个洗涤剂浓度和温度下，经过某一段时间后将保留较高的酶活性(较高的残留活性)。
因此，热稳定性和洗涤剂稳定性是蛋白或酶的两个相互独立的特征。
具有提高的洗涤剂稳定性的本发明果胶酸裂解酶变体，当置于实施例1中描述的分析方法中时，可显示出与亲本果胶酸裂解酶相比至少120％(优选至少140％，更优选至少160％，甚至更优选至少180％，甚至更优选至少200％，最优选至少250％和尤其是至少300％)的剩余活力。
蛋白质编号在本发明的上下文中，采用细胞壁降解酶，特别是果胶酸裂解酶中的特定氨基酸残基位置编号。例如，通过比对已知的果胶酸裂解酶的氨基酸序列，可以明确地将氨基酸位置编号分配给任何果胶酸裂解酶中的任何氨基酸残基，只要该果胶酸裂解酶的氨基酸序列是已知的。
使用起源于枯草芽孢杆菌菌株DSM 14218的质粒中存在的多核苷酸序列编码的果胶酸裂解酶氨基酸序列(公开于SEQ ID NO2)的编码系统，通过比对多种其它的果胶酸裂解酶的氨基酸序列，可明确地揭示一个氨基酸残基在一个果胶酸裂解酶中的位置。
在描述本发明产生或考虑的各种细胞壁降解酶变体时，采用以下的命名法以易于参照
替换[原始的氨基酸；位置；替换的氨基酸]相应地，符号S72I意指72位的丝氨酸被异亮氨酸替换。
多重突变通过加号标记(“+”)来分隔，如M169I+F198V，代表在169和198位分别用异亮氨酸(I)替换甲硫氨酸(M)及用缬氨酸(V)替换苯丙氨酸(F)的突变。
缺失195位的甘氨酸的缺失表示为Gly195*或G195*相应地，一个以上氨基酸残基的缺失，如195和196位甘氨酸和亮氨酸的缺失表示为Gly195*+Leu196*或G195*+L196*插入额外的氨基酸残基的插入，如在G195后插入赖氨酸表示为Gly195GlyLys或G195GK；或者，当插入一个以上的氨基酸残基，如在G195后插入Lys和Ala时，这种插入表示为Gly195GlyLysAla或G195GKA在这种情况下，通过将小写字母加到插入的氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置号中来对插入氨基酸残基进行编号。在以上的实例中，序列194-196因此将从194 195 196A-G-L变化到194 195 195a 195b 196A-G-K-A-L当插入与所存在的氨基酸残基相同的氨基酸残基时，显然在命名法中出现了简并性。例如，如果在以上的实例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，则这将表示为G195GG。对从194 195 196A-G-L到194 195 195a 196A-G-G-L或194 194a 195 196的事实上同样的变化恰恰也可以表示为A194AG。
这些例子对本领域技术人员来说是显而易见的，因此表示法G195GG和用于此类插入的相应表示法意在包括这些等价的简并表示法。
除非另有规定，通过果胶酸裂解酶编号在本文中提及的所有位置均指上述编号，其可以相对于枯草芽孢杆菌DSM 14218的质粒中存在的多核苷酸序列编码的果胶酸裂解酶之氨基酸序列(公开于SEQ ID NO2)而确定。
发明详述本发明涉及亲本果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)的变体。该变体与亲本酶相比具有改进的性质，特别是在洗涤剂组合物中的洗涤剂稳定性或贮藏稳定性得以提高。
在改进亲本果胶酸裂解酶的性质的过程中，本发明人发现亲本多肽主链中特定氨基酸的改变将显著改变该酶的洗涤剂稳定性。
多核苷酸在本发明优选实施方案中，预期编码本发明果胶酸裂解酶变体的亲本酶的多核苷酸将在至少中度严格条件下，优选高度严格条件下与SEQID NO1中相似大小的相应多核苷酸区域或其互补序列杂交。
具体地说，本发明的多核苷酸将在至少中度严格条件下，优选高度严格条件(见下述)下与变性双链DNA探针杂交——所述探针包含相应于SEQ ID NO1的1-1200位并具有相应于实际的氨基酸置换的适当序列改变的全长变体序列，或者可以与含有其至少长大约100个碱基对的变体子序列的任何探针杂交。用于在中度或高度严格条件下确定核苷酸探针和同源DNA或RNA序列之间的杂交的合适实验条件包括将含有需杂交的DNA片段或RNA的滤膜预浸泡于5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠，Sambrook等，1989)中10分钟，并于具有5×SSC、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml变性的超声处理的鲑鱼精子DNA(Sambrook等，1989)的溶液中预杂交该滤膜，然后在含10ng/ml随机引发的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)分析生物化学(Anal.Biochem.)1326-13)、32P-dCTP标记的(比活性高于1×109cpm/μg)探针的同样溶液中约45℃杂交12小时。滤膜随后在2×SSC、0.5％SDS中洗两次，30分钟，洗涤温度至少60℃(中度严格条件)，更优选至少65℃(中度/高度严格条件)，甚至更优选至少70℃(高度严格条件)，甚至更优选至少75℃(极高严格条件)。
用X-射线胶片检测在这些条件下与寡核苷酸探针杂交上的分子。
如前面所提到的，编码本发明的果胶酸裂解酶变体的多核苷酸包括DNA和RNA。分离DNA和RNA的方法在本领域是众所周知的。可用本领域已知的方法从Gene Bank或DNA文库中克隆编码目的基因的DNA和RNA。
随后用例如杂交或PCR方法鉴定和分离编码具有本发明果胶酸裂解酶活性的多肽的多核苷酸。
将本发明提供的信息和组合物与常规克隆技术相结合可克隆在本发明的果胶酸裂解酶变体的制备中使用的亲本果胶酸裂解酶的物种同系物。例如，DNA可用来自表达该蛋白质的细胞类型的染色体DNA进行克隆。可用按此处公开的序列设计的探针通过探测RNA印迹鉴别DNA的合适来源。随后从阳性细胞系的染色体DNA制备文库。编码具有本发明的果胶酸裂解酶活性的多肽的DNA可随后用各种方法分离，诸如用完全或部分DNA进行探测，或用基于公开序列的一或多套简并探针进行探测。DNA也可采用聚合酶链式反应或PCR(Mullis，美国专利号4,683,202)，用基于本文公开序列设计的引物进行克隆。在另外的方法中，可用DNA文库转化或转染宿主细胞，并用针对果胶酸裂解酶(所述酶克隆自枯草芽孢杆菌菌株IFO 3134)的抗体(单克隆或多克隆抗体)检测目的DNA的表达；或者可通过与具有果胶酸裂解酶活性的多肽有关的活性测定法检测目的DNA的表达。类似技术也可应用于基因组克隆的分离。
可从产生具有果胶降解活性的酶的细菌菌种枯草芽孢杆菌的菌株，优选保藏为IFO 3134的菌株，或者如此处描述的其它或相关生物体克隆枯草芽孢杆菌DSM 14218之质粒上克隆的DNA序列的多肽编码部分和/或本发明的类似DNA序列。
备选地，可以基于可从枯草芽孢杆菌DSM 14218的质粒获得的DNA序列构建类似序列，例如，该类似序列可以是该DNA序列的子序列，和/或可以通过导入不改变该DNA序列编码的果胶酸裂解酶的氨基酸序列但是符合于旨在产生该酶的宿主生物体的密码子用法的核苷酸置换，或者通过导入可以导致不同氨基酸序列的核苷酸置换(即，本发明的果胶降解酶变体)来构建。
多肽SEQ ID NO2中氨基酸第1-399位的序列是相应于来自保藏为IFO3134(发酵研究所，Osaka，17-85，Jusohonmachi 2-chome，Yodagawa-ku，Osaka 532-8686，日本)的枯草芽孢杆菌的野生型果胶酸裂解酶的成熟果胶酸裂解酶序列。
本发明还提供与SEQ ID NO2的多肽及其物种同系物(直向同系物或共生同系物)基本同源的多肽的果胶酸裂解酶变体。此处所用的术语“基本同源”表示多肽与SEQ ID NO2中序列或它的直向同系物或共生同系物具有70％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％的序列同一性。此多肽更优选与SEQ ID NO2中所示的序列或其直向同系物或共生同系物具有至少95％的同一性，最优选98％或更高的同一性。序列同一性百分率是通过常规方法，通过本领域中公知的计算机程序，如在Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of MolecularBiology，48，443-453中公开的GCG程序包(Program Manual for theWisconsin Package，版本8，1994年8月，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)中提供的GAP(此此将其完整引入作为参考)确定的。对于多肽序列的比较而言，GAP使用下面的参数设置GAP创建罚分3.0，GAP延伸罚分0.1。
以类似的方法，使用用于DNA序列比较的下面参数设置，通过GAP可以确定多核苷酸分子的序列同一性GAP创建罚分5.0，GAP延伸罚分0.3。
亲本果胶酸裂解酶优选来自微生物，优选来自细菌、古细菌或真菌，特别来自细菌如属于芽孢杆菌，优选属于嗜碱芽孢杆菌菌株的细菌，该嗜碱芽孢杆菌可选自枯草芽孢杆菌和高度相关的芽孢杆菌菌种(其中所有菌种基于比对的16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌优选至少95％，甚至更优选至少98％同源)。本发明的亲本果胶酸裂解酶与SEQ ID NO2的多肽及其物种同系物(直向同系物或共生同系物)基本同源。术语“基本同源”在此处用于表示多肽与SEQ ID NO2中显示的序列或其共生同系物或直向同系物具有70％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％的序列同一性。更优选，这些多肽与SEQ ID NO2中显示的序列或其共生同系物或直向同系物具有至少95％同一性，最优选98％或以上的同一性。
对于基本同源的亲本蛋白质和多肽，其特征在于具有一或多个氨基酸替换、缺失或插入。这些改变优选为性质较小的那种，即保守氨基酸替换(见表1)和其它不会显著影响蛋白质或多肽的折叠或活性的替换；小的缺失，通常是1至约30个氨基酸的小缺失；及小的氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基、长度不超过约20-25个残基的小接头肽或利于纯化的小延伸(亲和标记物)，如多聚组氨酸链、蛋白A(Nilsson等，EMBO J，41075，1985；Nilsson等，酶学方法，1983，1991)。通常参阅，Ford等，蛋白质表达和纯化(Protein Expression andPurification)295-107，1991，该文献在此引用作为参考。编码亲和标记物的DNA可从产品供应商(如，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ；New England Biolabs，Beverly，MA)处购买到。
然而，即便上述的变化优选是性质较小的改变，这些改变也可以是性质较大的改变，如将长达300个氨基酸或更长的较大多肽融合作为氨基或羧基末端延伸。
表1保守氨基酸替换碱性精氨酸赖氨酸酸性谷氨酸天冬氨酸极性谷氨酰胺天冬酰胺丝氨酸苏氨酸半胱氨酸疏水性 亮氨酸异亮氨酸缬氨酸脯氨酸甲硫氨酸芳香族/杂芳香族苯丙氨酸色氨酸酪氨酸组氨酸小的甘氨酸丙氨酸除了20种标准氨基酸之外，也可用非标准氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)替换野生型多肽的氨基酸残基。也可用有限数量的非保守氨基酸、非遗传密码编码的氨基酸及非天然氨基酸替换氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后修饰而成，和/或在它们侧链上有不同于标准氨基酸侧链的化学结构。非天然氨基酸可以化学合成，或优选地购买得到，包括六氢吡啶羧酸、四氢噻唑羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸和3，3-二甲基脯氨酸。
本发明的果胶酸裂解酶多肽中的必需氨基酸可按本领域已知方法进行鉴别，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学(Science)2441081-1085，1989)。在后一技术中，在分子的每个残基位置处导入单个丙氨酸突变，检测所产生的突变分子的生物学活性(即果胶酸裂解酶活性)以鉴别对分子活性起关键作用的氨基酸残基。也可参阅，Hilton等，生物化学杂志(J.Biol.Chem)2714699-4708，1996。酶或其它生物学相互作用的活性位点也可通过对用诸如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记等技术测定的结构进行物理分析以及对推定的接触位点氨基酸进行突变而确定，参阅，例如，de Vos等，科学255306-312，1992；Smith等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224899-904，1992；Wlodaver等，FEBSLett.30959-64，1992。必需氨基酸的身份也可通过分析与本发明多肽相关的多肽的同源性来推断。
可用已知的突变、重组和/或改组方法及随后的相关筛选方法进行多重氨基酸替换和检测，这些方法例如有Reidhaar-Olson和Sauer(科学24153-57，1988)、Bowie和Sauer(美国国家科学院院报862152-2156，1989)、WO95/17413或WO95/22625所公开的技术。简单地说，这些作者公开了同时使多肽中两个或多个位置发生随机化或对不同突变进行重组/改组(WO95/17413，WO95/22625)、随后选择功能多肽、然后将诱变多肽测序以确定每个位置可允许的替换谱的方法。其它可用的方法包括噬菌体展示(如Lowman等，生物化学3010832-10837，1991；Ladner等，美国专利号5,223,409；Huse，WIPO出版物WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等，基因46145，1986；Ner等，DNA 7127，1988)。
上面公开的诱变/改组方法可与高通量、自动化筛选方法结合，以测定宿主细胞中克隆的诱变多肽的活性。编码活性多肽的诱变DNA分子可从宿主细胞中回收，并用现代化设备快速测序。这些方法使得可以快速确定目的多肽中各个氨基酸残基的重要性，并可应用于未知结构的多肽。使用上面讨论的方法，本领域技术人员能够鉴定和/或制备与SEQ ID NO2的1-399位残基基本同源并且保持亲本酶的果胶酸裂解酶活性的多种多肽。
然而，非常相同的方法也可用于提供具有比野生型蛋白质更有利的性质的本发明果胶酸裂解酶变体。使用这些方法，本发明人已经鉴定了许多位置，在这些位置处SEQ ID NO2的野生型果胶酸裂解酶可以被有利地置换，从而产生具有改进性质的变体。
优选的本发明果胶酸裂解酶变体在一个或多个下面的位置中具有置换(相对于SEQ ID NO2编号)5、9、11、26、28、30、31、37、40、45、46、47、48、49、50、51、52、54、61、64、68、69、70、71、74、75、76、79、86、87、91、99、105、106、107、111、115、116、118、122、123、134、136、139、140、141、146、148、156、158、170、182、185、186、189、193、194、196、199、201、202、204、213、215、218、224、228、229、234、235、237、251、256、257、258、272、277、286、295、298、301、302、303、305、307、308、314、316、323、324、326、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、349、356、357、363、366、378、381、384、386、387、389、390、391、393和397。
本发明优选的变体还包括其中酶的总电荷已经被变得更负的变体。在这些变体中，带正电荷的氨基酸可以已经被替代和/或者已经导入了在应用条件下带负电荷的氨基酸。
据此，优选的变体可以已经替换了在应用条件下部分或全部带正电荷的氨基酸残基，即His，Lys或Arg。此外，优选变体的任何残基也可以已经被在应用条件下带负电荷的氨基酸残基，即Asp、Glu和Tyr替换。
特别优选的变体为在一个或多个下面的位置(相对于SEQ ID NO2编号)中的赖氨酸残基已经被替换的变体26、47、54、59、71、79、87、90、99、100、115、118、139、148、213、218、247、257、263、265、274、314、317、334、386和397。
同样，特别优选其中在一个或多个下面的位置(相对于SEQ ID NO2编号)中的精氨酸残基已经被替换的变体38、110、112、120、155、206、217、272、279、282和284。
此外，优选的变体也可以是其中在一个或多个下面的位置(相对于SEQID NO2编号)中的组氨酸残基已经被替换的变体5、31、193、198、221、222、243、245、269、270、289、376和384。
优选地，果胶酸裂解酶变体已经被修饰从而改变了Ca2+结合常数，由此提高了钙耗竭稳定性(calcium-depletion stability)。在本发明的果胶酸裂解酶中，三个氨基酸残基D184、D223和D227在主要钙结合位点配位结合Ca2+。通过在该配位作用中募集第四个氨基酸残基，可以改变对Ca2+的结合常数。主要钙结合位点处Ca2+的存在可影响催化事件(通过减小催化残基的pKa)、底物的定位(alignment)或者确定该酶是否作为水解酶或者裂解酶起作用(Ca2+的存在是裂解酶活性的先决条件)。这种具有提高的钙耗竭稳定性的变体可含有置换Q182D和Q182E之一。
优选的变体的其他实例为具有提高的氧化稳定性的变体，其中对氧化作用不稳定的氨基酸残基已经被替换。“氧化不稳定的”指含有硫-或羟基基团的氨基酸，例如，甲硫氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸。优选的变体为下面一个或多个位置(相对于SEQ ID NO2编号)的氧化不稳定氨基酸残基已经被替换的变体64、122、199和237。
优选的变体的其他实例为在柔性残基中具有氨基酸置换的变体，其中已经导入较不柔性的氨基酸残基。在本发明的上下文中，术语“柔性的”指氨基酸中可能存在的α-碳原子的φ和 角的个数。肽骨架的柔性受结合α-碳原子的原子的空间位阻所限制。通常，残基之间仅仅氨基酸侧链不同，因此，侧链的大小(范德华半径)确定了柔性。甘氨酸具有最小的侧链——一个氢原子，因此，甘氨酸残基可以引入更多的柔性。脯氨酸则具有相反的情况，其可能的构象不仅被大侧链而且被环结构所限制。从而，脯氨酸残基比平均情况具有更小的柔性，可以赋予肽刚性和稳定性。
这些柔性较差的变体尤其包括，但不限于，其中甘氨酸残基已经被其他19种天然发生的氨基酸中的任何一种置换的变体或者其中任一氨基酸已经被脯氨酸残基置换的变体。
在特别优选的变体中较不具柔性的氨基酸残基已经被导入一个或多个下面的区域(相对于SEQ ID NO2进行位置编号)26-31、45-50、66-72、81-89、90-106、134-137、169-178、210-217、253-262、275-286、297-308、328-343、354-356、361-365、368-372和376-379。
在本发明的一个优选的实施方案中，枯草芽孢杆菌果胶酸裂解酶变体含有至少一个选自以下的置换的氨基酸残基H5R，E9G，N11Y，K26Q，S28T，S30F，S30P，S30T，H31N，N37D，Q40E，L45V，G46D，K47N，K47R，D48E，D48P，T49P，N50D，N50L，N50Y，N51Y，T52M，K54V，T61A，M64F，D68*，N69*，L70*，K71*，K71E，G74D，L75A，L75P，N76D，K79A，D86N，K87A，K87E，A91E，K99I，K99N，K99R，T105A，T105P，L106Q，E107K，A111E，K115A，K115I，K115N，K115Q，N116D，K118A，K118E，M122E，M122K，M122N，M122Q，V123I，S134L，T136S，K139E，K139F，K139I，K139M，K139N，K139S，I140V，V141G，V141E，V141L，V141N，Q146F，Q146H，Q146I，Q146V，K148E，K148Q，N156S，E158N，D170N，Q182D，Q182E，N185H，N186H，N189D，H193Y，I194V，I196V，C199N，C199S，F201L，N202K，G204R，K213E，K213N，K213T，F215Y，K218E，K218L，K218P，G224S，A228I，S229T，Y234H，I235V，M237I，F251I，S256C，K257E，K257N，T258I，L286Y，R272C，R272H，R272Y，V277D，G286A，Y295H，S298N，S301Y，S302A，D303S，A305P，S307R，Y308S，K314N，S316F，N323M，V324A，D326N，S331P，S331T，A332P，A333E，K334E，T335S，T335R，I336S，S337C，S337K，S337L，S337R，V338E，V338Y，F339I，S340A，S340K，S340N，S340P，S340Q，G341S，G349R，Q356H，I357V，N363S，S366N，T378G，T378S，A381D，H384N，K386P，K386R，S387A，V389I，I390N，I390T，S391N，A393V，K397D。
现在预期一个或多个这样的置换单独或者组合在一起可以增加果胶酸裂解酶变体与亲本酶相比时的洗涤剂稳定性。
增加洗涤剂稳定性的优选多重置换包括
A228I+F251I，S134L+K257E，K115I+K213E，K139I+K213N，H5R+K257N+S302A，K99I+I196V，K115A+K118A，K115A+K118A+M122N，V141E+C199S+K213E，K115I+Q146H，K71E+K118E，T49P+N156S，K314N+S340P，V141E+I235V，G46D+K257N，S28T+S30F+K334E+N363S，D48E+L106Q+I140V+F215Y+K218E，H193Y+S256C+V389I+A393V，E9G+H31N+N50D+L106Q+A111E+T136S+V141L+F201L+N202K+F215Y+G286A+A381D+H384N，K213N+T258I，E9G+H31N+L106Q+D303S+A305P+T335S+H384N+S391N，E9G+H31N+D48E+L106Q+A111E+S301Y+D303S+A305P+T378S+H384N+S391N，L45V+N50Y+N185H，N11Y+K87E+K99N，E9G+D48E+L106Q+S316F+A381D，S30P+K115I+K139I+Q146H+S337C，E9G+H31N+D48E+L106Q+I140V+F215Y+D303S+A305P+T378S+H384N+S391N，H31N+T105A+L106Q+A111E+V141L+K218E+D303S+A305P+D326N+T335S+H384N+S391N，K26Q+K47N+L106Q+I140V+F215Y+D303S+A305P+T378S+H384N+S391N，D48E+L106Q+I140V+F215Y+D303S+A305P+T378S+H384N+S391N，K213T+K218L+A305P，M64F+K213T+K218L+A305P，M64F+M122K+K118E+K213T+K218L+A305P，K139I+Q146H+K257N+S337C，M64F+K139I+Q146H+S337C，K139I+Q146H+S337C andD48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+S337K。
蛋白质生产本发明的多肽(包括全长蛋白质，其片段和融合蛋白)可根据常规技术在遗传工程化宿主细胞中产生。适宜的宿主细胞为可以用外源DNA转染或转化并培养生长的那些细胞类型，包括细菌、真菌细胞，和培养的高等真核细胞。优选细菌细胞，尤其是革兰氏阳性生物体的培养细胞。特别优选来自芽孢杆菌属的革兰氏阳性细胞，如地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、B.lautus、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、B.agaradherens或尤其是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。
操作克隆的DNA分子和导入外源DNA到各种宿主细胞中的技术由Sambrook等，《分子克隆实验室指南》，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989；Ausubel等(编者)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987；和(枯草芽孢杆菌和其他革兰氏阳性细菌，Sonensheim等，1993，American Society for Microbiology，Washington D.C.)公开，这些文献在此处被并入作为参考。
通常，编码本发明的果胶酸裂解酶的DNA序列在表达载体中被可操作地连接到其表达所需的其他遗传元件上，这些元件通常包括转录启动子和终止子。载体也通常含有一个或多个选择标记和一个或多个复制起点，然而本领域技术人员将意识到在某些系统中可以在分开的载体上提供选择标记，并且外源DNA可通过整合到宿主细胞基因组中进行复制。启动子、终止子、选择标记、载体和其他元件的选择是本领域普通技术水平中的常规设计。许多这样的元件在文献中描述并且可从商业供应商处得到。
为了指导多肽进入宿主细胞的分泌途径，在表达载体中提供分泌信号序列(也称为前导序列，前原序列或前序列)。分泌信号序列可以是该多肽自身的，也可以来自其它的分泌蛋白或者从头合成。许多适宜的分泌信号序列是本领域中公知的，参见《枯草芽孢杆菌和其他革兰氏阳性细菌》(Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria)Sonenshein等，1993，(American Society for Microbiology，Washington D.C.)；和Cutting，S.M.(编者)《芽孢杆菌的分子生物学方法》，(John Wiley and Sons，1990)，其中有关于特别是用于芽孢杆菌宿主细胞中的分泌的适宜分泌信号序列的进一步描述。分泌信号序列在正确的阅读框中与DNA序列结合。分泌信号序列通常被置于编码目标多肽的DNA序列的5’，虽然某些信号序列可位于目标DNA序列的别处(见，例如，Welch等，美国专利号5,037,743；Holland等，美国专利号5,143,830)。
根据常规方法将被转化或转染的宿主细胞培养于含有所选宿主细胞生长所需的营养物和其他成分的培养基中。各种适宜的培养基，包括成分确定的培养基和复杂培养基，是本领域公知的并且通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。如果需要，培养基可以还含有诸如生长因子或血清这样的组分。生长培养基通常例如，通过药物筛选或基本营养物缺乏(该缺乏通过表达载体上携带的或者共转染到宿主细胞中的选择标记补充)来选择含有外源加入的DNA的细胞。
可通过在有氧条件下在含有碳源和氮源以及其他必需营养物的营养培养基中培养进行发酵，其中按照本领域公知的原则组成所述培养基。培养基可以是复杂的丰富培养基或基本培养基。氮源可以是无机和/或有机的。适宜的无机氮源为硝酸盐和铵盐。在有机氮源中相当多的已被常规地用于发酵。实例为大豆粉、酪蛋白、玉米、玉米浆、酵母提取物、尿素和白蛋白。适宜的碳源为糖类或含有糖的物质。优选的营养培养基含有果胶酸盐、聚半乳糖醛酸和/或较高或较低程度酯化的果胶作为碳源和/或果胶酶产生的诱导剂。备选地，培养基可以含有富含果胶的材料如大豆粉、苹果浆或柑橘皮。
培养可优选地在碱性pH值如至少pH8或至少pH9下进行，其中可通过在生长培养基灭菌后加入适宜的缓冲剂如碳酸钠或碳酸钠和碳酸氢钠的混合物得到碱性pH值。
蛋白质分离当表达的重组多肽被分泌时，可从生长培养基纯化多肽。优选地表达宿主细胞在多肽纯化前从培养基中被除去(例如通过离心)。
当表达的重组多肽不从宿主细胞分泌时，优选将宿主细胞破坏并使多肽释放到水性“提取物”中，此步骤是这种纯化技术的第一阶段。优选地，在细胞破坏之前从培养基中除去表达宿主细胞(例如，通过离心)。
可通过常规技术如通过溶菌酶消化或迫使细胞经过高压来进行细胞破坏。关于这种细胞破坏技术的其他描述见(Robert K.Scobes，ProteinPurification，第二版，Springer-Verlag)。
不管表达的重组多肽(或者嵌合多肽)是否被分泌，其都可以使用分级分离和/或常规纯化方法和介质纯化。
硫酸铵沉淀和酸或离液剂提取可用于样品的分级分离。示例性纯化步骤可包括羟基磷灰石、大小排阻、FPLC和反向高效液相层析。适宜的阴离子交换介质包括衍生的葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特种硅胶，等等。优选PEI、DEAE、QAE和Q衍生物，尤其优选Fast-FlowSepharose(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。示例性层析介质包括用苯基、丁基或辛基基团衍生的介质，如Phenyl-Sepharose FF(Pharmacia)，Toyopearl butyl 650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)，Octyl-Sepharose(Pharmacia)等；或者聚丙烯酸树脂，如Amberchrom CG 71(Toso Haas)等。适宜的固相载体包括在它们所使用的条件下不溶的玻璃珠、基于硅的树脂、纤维素树脂、琼脂糖珠、交联的琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、交联的聚丙烯酰胺树脂，等等。这些支持物可以用活性基团修饰，这些活性基团使得蛋白质可通过氨基基团、羧基基团、巯基基团、羟基基团和/或糖部分附着。偶联化学反应的实例包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化、酰肼活化和用于碳二亚胺偶联化学的羧基和氨基衍生物。这些和其他固体介质是本领域熟知且广泛使用的，并且可从商业供应商处得到。
特定方法的选择属于常规设计并且部分取决于所选支持物的性质。见，例如，Affinity ChromatographyPrinciples & Methods，Pharmacia LKBBiotechnology，Uppsala，瑞典，1988。
本发明的多肽或其片段也可通过化学合成制备。本发明的多肽可以是单体或多体；糖基化或非糖基化的；PEG化或非PEG化的；并且可以包含或者不包含最初的甲硫氨酸残基。
因此，在另一方面，本发明还涉及产生本发明的酶制品的方法，该方法包括在允许产生本发明果胶酸裂解酶变体的条件下培养能够产生果胶酸裂解酶变体的微生物，并从培养物回收此酶。可使用常规发酵技术在诱导果胶酸裂解酶变体产生的生长培养基上进行培养，例如，在摇瓶或发酵罐中培养，并同时搅拌以确保充足的通气。生长培养基可含有常规N源如蛋白胨、酵母提取物或水解酪蛋白氨基酸、量减少的常规C源如葡萄糖或蔗糖，以及诱导剂如果胶酸或果胶或者复杂植物底物如谷物麸皮(例如小麦麸或米糠)。使用常规技术，例如通过离心或过滤分离生物量和上清液，回收上清液或如果目标酶在细胞内则破坏细胞，可能地接着采用如在EP 0 406314中描述的进一步纯化方法，或者通过如WO 97/15660中描述的方式结晶进行回收。
在另一方面，本发明涉及使用常规重组技术产生的具有上述性质并且不含同源杂质的、分离的果胶酸裂解酶变体。
方法和用途定量果胶酸裂解酶活性的微滴定测定法果胶酸裂解酶通过反式消除机制切割聚半乳糖醛酸。这意味着其为每次底物裂解留下双C-C键。该键在235nm有吸收，使得通过测量在该波长的吸光度可以直接检测果胶酸裂解酶对可溶性聚半乳糖醛酸的作用。
将酶样品在试验缓冲液(100mM Tris-HCI，0.68mM CaCl2，pH 8.0)中稀释到5到100ng/ml。如果酶样品含有洗涤剂，其应就洗涤剂而言被稀释至少1000倍。
将100μl酶缓冲液稀释物与100μl底物(1％(w/v)来自Sigma的聚半乳糖醛酸，P-3850，在试验缓冲液中搅拌至少15分钟并在2300g离心5分钟，使用上清液)在加热的板中混合并在加热块，优选PCR仪或具有相等准确性和加热速度的设备中加热到40℃，10分钟。
在UV-可透过的微滴定板中将100μl酶/底物溶液与100μl终止试剂(50mM H3PO4)混合。将UV板快而轻地摇动并在微滴定板分光计(Molecular Devices，Spectra-MAX 190)中在235nm测量吸光度。通过从所有测量值中减去(在没有加酶时运行的)对照样品的吸光度，相对于背景吸收校正吸光度读数。
基于SEQ ID NO2果胶酸裂解酶(来自保藏为IFO 3134的枯草芽孢杆菌)的活性的标准曲线在2.5至100ng酶/ml反应混合物之间是线性的

备选地，可通过粘度测定法，即，APSU，确定果胶酸裂解酶的催化活性。
粘度测定法，APSUAPSU单位APSU测定法测量没有加入钙离子时聚半乳糖醛酸溶液粘度的变化。
将5％w/v聚半乳糖醛酸钠(Sigma P-1879)溶液溶于0.1M甘氨酸缓冲液(pH10)中。将4ml这种溶液在40℃预孵育5分钟。然后，加入250微升酶(或酶稀释液)，之后将反应物在混合器上以最高速度混合10秒并在40℃或另一温度温育20分钟。
使用MIVI 600粘度计(Sofraser，45700 Villemandeur，法国)测量粘度。粘度测量为10秒后的mV值。为了计算APSU单位，使用下面的标准曲线

在洗涤剂工业中的用途另一方面，本发明涉及含有本发明的果胶酸裂解酶变体或果胶酸裂解酶变体制品的洗涤剂组合物；涉及织物的机器处理方法，包括在机器洗涤方法的洗涤循环中使用含有本发明的果胶酸裂解酶变体或果胶酸裂解酶变体制品的洗涤溶液处理织物。
通常，本发明的洗涤剂组合物含有常规成分如表面活性剂(阴离子的、非离子的、两性离子的、两性的)、助洗剂和其他成分例如，在WO 97/01629中所描述的那些成分，此处将此文献完整并入作为参考。
应用于纺织品和纤维素纤维加工工业本发明的果胶酸裂解酶变体可以与其它碳水化合物降解酶(如半纤维素酶，如阿拉伯聚糖酶、木葡聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶)共同使用以生物处理纤维或与洗涤剂联合以清洁纤维。棉纤维由含果胶的初生细胞壁层和主要含纤维素的次生层组成。在棉的处理或棉的精制过程中部分初生细胞壁将被去除。本发明涉及在棉的精制过程中通过去除初生细胞壁进行辅助，或在棉的清洁过程中辅助去除残余的果胶物质并防止纺织品变灰。
在本上下文中，术语“纤维素材料”旨在指纤维、织造的或非织造的织物，包括由棉、棉混合物或天然的或人造的纤维素物质(如来源于含木聚糖的纤维素纤维如木浆)或其混合物制成的针织物、机织织物、粗斜棉布、纱线和毛巾布。混合物的例子有棉或人造纤维/粘胶纤维与一种或多种伴随材料，如羊毛、合成纤维(如聚酰胺纤维、丙烯腈系纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚偏氯乙烯纤维、聚氨基甲酸酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)和含纤维素的纤维(如人造纤维/粘胶纤维、苧麻、大麻、亚麻(flax/linen)、黄麻、乙酸纤维素纤维、lyocell)的混合。
本发明的制品可以在纤维素纤维加工工业中用于预处理或从大麻、亚麻(flax)或亚麻(linen)纱线浸解纤维。
纺织工业中把纤维素材料如棉纤维加工成可用于服装生产的材料涉及几个步骤将纤维纺成纱线；将纱线加工成机织的或针织的织品，随后进行前处理、染色和整理。机织品通过在一系列经纱间织入纬纱制成；纱线可以是两种不同类型。针织品是通过从一条连续的长纱线形成互相缠绕的套索网络结构制成的。纤维素纤维也可用于无纺织物。
前处理过程对纺织品作前处理以便其在染色操作中有适当反应。前处理中涉及的子步骤包括a.退浆(用于机织品)，编织前加入聚合浆如淀粉、CMC或PVA以提高整经速度；在进一步加工前必须去除这种材料。
b.煮练，其目的是去除棉纤维上的非纤维素物质，尤其是角质层(主要由蜡组成)和初生细胞壁(主要由果胶、蛋白质和木葡聚糖组成)。适当去除蜡是获得高可湿性所必需的，是获得良好染色的措施。去除初生细胞壁-尤其是果胶-可提高蜡的去除和确保更均一的染色。此外这还可以提高漂白步骤的白度。煮练中使用的主要化学药品是高温(80-95℃)高浓度(高达70g/kg棉)的氢氧化钠；c.漂白；正常在煮练之后使用过氧化氢作为氧化剂进行漂白，以获得完全漂白的(白色)织物或确保染料的纯洁色泽。
也可以通过工业方式使用联合了煮练/漂白的一步法。尽管前处理过程最通常在织物状态时使用；但煮练、漂白和染色操作也可以在纤维或纱线阶段进行。
处理方案可以是分批地或连续地让织物以平幅或绳子形式与液体加工流接触。连续操作一般使用饱和器以便对每重量的织物使用几乎等量的化学药品浴(chemical bath)，之后进入加热的停留室中，在其中发生化学反应。然后洗涤部分对织物进行处理以预备用于下一加工步骤。分批处理一般在一个处理浴中进行，以便织物与大约其重量8至15倍的化学药物浴接触。在反应期之后，排掉化学药品、洗涤织物然后应用下一化学药品。不连续的浸轧-堆放处理涉及使用饱和器，由此将每重量织物几乎等量的化学药物浴应用于织物上，之后为停留期，对于冷浸轧-堆放这可以是一天或多天。
机织品是纺织品织物结构的最普遍形式。机织工艺需要对经纱进行“上浆”以防止其磨损。由于易于获得和廉价，淀粉、聚乙烯醇(PVA)、羧甲基纤维素、蜡和丙烯腈系粘合剂是典型使用的上浆化学药品的例子。编织完成后作为处理机织品的第一步必须除去浆。上浆的织物以平幅或绳状形式与含有退浆剂的加工液体接触。所用退浆剂取决于待除去的浆类型。对于PVA浆，常使用热水或氧化方法。对于棉织物，最常用的上浆剂是以淀粉为基础的上浆剂。因此，最常见的是，通过热水、α-淀粉酶(水解淀粉)和润湿剂或表面活性剂的组合对机织棉织物退浆。使此纤维素材料与退浆化学药品一起停留一段“保持期”，该“保持期”将足够长以能够完成退浆。该保持期取决于处理方案的类型和温度，其可以在15分钟至2小时之间变动，或在一些情况下可以为几天。典型地，将退浆化学药品加入一般在约15℃至约55℃之间的饱和器浴中。然后将织物放入诸如“J-盒”等可以提供充足热量(通常在约55℃至约100℃之间)的仪器中，以增加退浆剂的活性。保持期终止后洗净织物上的这些化学药品，包括除掉的上浆剂。
为了确保高的白度或良好的可湿性、由此以及可染性，必须彻底除去上浆化学药品和其它应用的化学药品。一般认为，有效的退浆对于随后的处理，即煮练和漂白是至关重要的。
煮练步骤除去棉中天然存在的大量非纤维素化合物。除了天然非纤维素杂质外，煮练可以除去污垢、污物和残余的制备中引入的物质如纺线、络筒(coning)或经纱上浆时的润滑剂。煮练步骤使用氢氧化钠或有关的苛化剂如碳酸钠、氢氧化钾或其混合物。一般在此过程中加入碱性稳定表面活性剂以增加疏水性成分的可溶性和/或防止它们再沉积回织物上。该处理一般在高温，即80℃-100℃，利用煮练剂的强碱溶液(pH 13-14)进行。由于化学处理的非特异性质，不仅杂质而且纤维素本身均会受到攻击，从而导致强度或其它期望的织物性质受损。纤维素纤维的柔性是残余天然棉蜡的函数。高温强碱煮练步骤的非特异性质不能区分期望的天然棉润滑剂和制造引入的润滑剂。而且，由于来自这些步骤的高碱性流出物，常规煮练步骤会造成环境问题。煮练阶段为在漂白中得到最佳的反应而预备织物。未充分煮练的织物在随后的漂白阶段将需要更高水平的漂白化学药品。
漂白步骤使天然的棉色素脱色，并除去在轧棉、梳棉或煮练过程中未完全除去的所有残余的天然木质性棉渣成分。目前使用的主要方法是碱性过氧化氢漂白。在许多情况下，尤其是在不需要非常高的白度时，可以将漂白和煮练合并。
在如下实施例中显示了煮练步骤可以使用本发明果胶酸裂解酶或果胶酸裂解酶制品在约50℃至80℃及约pH 7-11下进行，由此替代或补充这些高度苛化剂。优化后的酶方法确保了高的果胶清除和充分的可湿性。
植物材料的降解或修饰由于本发明果胶酸裂解酶变体具有高的植物细胞壁降解活性，故本发明的酶或酶制品优选作为试剂用于降解或修饰植物细胞壁或任何来源于植物细胞壁的含果胶物质。
本发明的果胶酸裂解酶变体可以单独地或联合其它酶如葡聚糖酶、果胶酶和/或半纤维素酶一起使用以利于从富含油的植物材料中提取油、如从大豆中提取大豆油、从橄榄中提取橄榄油、从菜籽油菜中提取菜籽油或从向日葵中提取葵花油。
本发明果胶酸裂解酶变体可以用于分离植物细胞材料的成分。尤其有意义的是将富含糖或淀粉的植物材料分离成具有相当可观的商业意义的成分(如从甜菜分离蔗糖或从马铃薯分离淀粉)和意义不大的成分(如浆或壳组分)。此外，尤其有意义的是将富含蛋白质或富含油的农作物分离为有价值的蛋白质及油和无价值的壳组分。这些分离可以使用本领域已知方法进行。
本发明果胶酸裂解酶变体还可以用于制备果汁或蔬菜汁以便增加产量，和用于酶促水解各种植物细胞壁来源的材料或废料，如酒或果汁生产中产生的废料，或农业残余物如蔬菜壳、豆壳、甜菜浆、橄榄浆、马铃薯浆等。
可以对植物材料进行降解以便利于不同类型的加工、促进非半乳聚糖的其它成分的纯化或提取如从柑橘纯化果胶、提高饲料价值、降低水结合能力、提高废水厂的降解能力、提高植物材料向青贮料的转化，等。
利用本发明酶制品，可以调节加工的水果或蔬菜的稠度和外观。稠度和外观已被证实取决于用于加工的酶的实际组合，即本发明果胶酸裂解酶变体所联合的酶的特异性。实例包括从如苹果、梨或浆果制备清澈果汁；从如苹果、梨、浆果、柑橘或番茄制备混浊的稳定果汁；以及从如胡萝卜和番茄制备果酱。
本发明果胶酸裂解酶变体可以用于改变植物细胞壁来源材料的粘度。例如，可以使用本发明果胶酸裂解酶变体降低含有半乳聚糖的饲料的粘度和促进含半乳聚糖的粘性材料的加工。可以通过用本发明酶制品在适宜的条件下处理含半乳聚糖的植物材料以完全或部分地降解该含半乳聚糖的材料，从而降低粘度。
本发明果胶酸裂解酶变体可以例如和其它酶联合用于清除植物纤维中的果胶物质。这种清除在例如制备纺织品纤维或其它纤维素材料时是必需的。对于此目的，可以用适量的本发明果胶酸裂解酶在适宜的条件下处理植物纤维材料以便完全或部分地降解与该植物纤维材料相关的果胶物质。
动物饲料添加剂本发明果胶酸裂解酶变体可以用于改变动物饲料并可以体外(通过改变饲料成分)或体内地起作用。该果胶酸裂解酶变体尤其适于加入含有大量阿拉伯半乳聚糖或半乳聚糖的动物饲料组合物中，如含有来自大豆、菜籽油菜、羽扇豆等的植物物质的饲料中。当加入饲料中时，该果胶酸裂解酶变体显著提高植物细胞壁物质的体内分解，籍此使动物能更好地利用这些植物养料。由此，提高动物的生长速度和/或饲料转化率(即消化的饲料重量与增加的体重的比例)。例如，通过果胶酸裂解酶(如与β-半乳糖苷酶联合)将无法消化的半乳聚糖降解为动物可消化的半乳糖或半乳糖寡聚物，由此提高饲料中的可利用能量。而且，通过降解半乳聚糖，该果胶酸裂解酶可以提高非碳水化合物饲料组分如蛋白质、脂肪和矿物质的可消化性和摄取。
对于进一步的描述，参考PCT/DK 96/00443和其中的实施例。
酒和汁的加工可以使用本发明酶或酶制品在蔬菜汁或果汁，尤其是苹果汁或梨汁中进行脱果胶化(de-petinization)和降低粘度。这可以通过使用对于降解水果或蔬菜汁中含果胶的物质而言有效量的本发明酶制品处理该水果或蔬菜汁来实现。
该酶或酶制品可以用于处理水果和蔬菜的捣碎物以便提高该捣碎物的可提取性或可降解性。例如，可以使用该酶制品处理果汁生产中使用的梨和苹果泥、和处理酒生产中使用的葡萄泥。
具有提高的洗涤剂稳定性的果胶酸裂解酶变体的实用性在果胶酸裂解酶变体存在于含有表面活性剂的环境中时是明显的。
洗涤剂的公开和实例表面活性剂体系本发明的洗涤剂组合物包含表面活性剂体系，其中表面活性剂可选自非离子的和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性的和/或两性离子的和/或半极性的表面活性剂。
表面活性剂通常以0.1％至60％重量的量存在。
表面活性剂优选配制成与组合物中存在的酶成分相容的形式。在液体或凝胶组合物中表面活性剂最优选配制成可促进或至少不降低组合物中的任何酶的稳定性的形式。
根据本发明所用的优选体系包含作为表面活性剂的一种或多种本文所述的非离子和/或阴离子表面活性剂。
烷基酚的聚环氧乙烷、聚环氧丙烷和聚环氧丁烷缩合物适合用作本发明表面活性剂体系中的非离子表面活性剂，优选聚环氧乙烷缩合物。这些化合物包括烷基酚与环氧烷的缩合产物，其中烷基酚的烷基在直链或支链构型中具有约6至14个碳原子，优选约8至14个碳原子。在优选的实施方案中，环氧乙烷相对于每摩尔烷基酚以约2至约25摩尔、更优选约3至约15摩尔的量存在。这种类型的可购买的非离子表面活性剂包括IgepalTMCO-630，由GAF Corporation销售；和TritonTMX-45、X-114、X-100和X-102，都由Rohm & Haas Company销售。通常将这些表面活性剂称作烷基酚烷氧基化物(例如烷基酚乙氧基化物)。
伯型和仲型脂肪族醇与约1至约25摩尔环氧乙烷的缩合产物适合用作本发明的非离子表面活性剂体系中的非离子表面活性剂。脂肪醇的烷基链可以是直链或支链、伯型或仲型的，并且通常包含约8至约22个碳原子。优选的是其烷基基团含有约8至约20个碳原子、更优选约10至约18个碳原子的醇类按每摩尔与约2至约10摩尔的环氧乙烷的缩合产物。相对于每摩尔的醇，约2至约7摩尔的环氧乙烷、最优选2至5摩尔的环氧乙烷存在于所述的缩合产物中。可购买的该类非离子型表面活性剂的例子包括TergitolTM15-S-9(C11-C15直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)、TergitolTM24-L-6 NMW(C12-C14伯醇与6摩尔环氧乙烷的窄分子量分布的缩合产物)，两者都由Union Carbide Corporation销售；NeodolTM45-9(C14-C15直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM23-3(C12-CI3直链醇和3.0摩尔的环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM45-7(C14-C15直链醇和7摩尔环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM45-5(C14-C15直链醇和5摩尔环氧乙烷的缩合产物)，其由Shell Chemical Company销售；KyroTMEOB(C13-C15醇和9摩尔环氧乙烷的缩合产物)，由The Procter & Gamble Company销售；和GenapolLA 050(C12-C14醇和5摩尔环氧乙烷的缩合产物)，由Hoechst销售。上述产物的优选HLB范围为8-11，最优选8-10。
也可用作本发明表面活性剂体系中的非离子表面活性剂的是US4,565,647中公开的烷基多糖，其具有包含约6至约30个碳原子、优选约10至约16个碳原子的疏水基团和含有约1.3至约10个、优选约1.3至约3个、最优选约1.3至约2.7个糖单元的多糖，例如聚苷亲水基团。任何包含5或6个碳原子的还原糖都可使用，例如，葡萄糖、半乳糖，并且半乳糖基部分可被替代为葡糖基部分(疏水基团任选地连接在2-、3-、4-等位置上，由此相对于葡糖苷或半乳糖苷产生葡萄糖或半乳糖)。糖间键可以例如在附加糖单元的1个位置和之前糖单元的2-、3-、4-和/或6-位之间。
优选的烷基聚苷具有以下通式R2O(CnH2nO)t(糖基)x其中R2选自烷基、烷基苯基、羟基烷基、羟基烷基苯基及其混合物，其中烷基包括约10至约18，优选约12至约14个碳原子；n是2或3，优选2；t是0至约10，优选0；且x是约1.3至约10，优选约1.3至约3，最优选约1.3至约2.7。糖基优选衍生自葡萄糖。为了制备这些化合物，首先形成醇或烷基聚乙氧基醇，然后与葡萄糖或葡萄糖源反应形成葡糖苷(连接在1位上)。附加糖基单元可在其1位和之前糖基单元的2-、3-、4-和/或6-位，优选主要2-位之间形成连接。
环氧乙烷与由环氧丙烷和丙二醇的缩合物形成的疏水碱性化合物的缩合产物也适宜用作本发明的另外的非离子表面活性剂体系。这些化合物的疏水部分优选具有约1500至约1800的分子量并且不溶于水。向该疏水部分中加入聚氧乙烯部分趋于提高分子的整体水溶性，并且该产物的液体特征可以维持在聚氧乙烯含量最多占缩合产物总重的约50％的水平，即相当于与不超过约40摩尔的环氧乙烷缩合。这类化合物的例子包括由BASF销售的某些可购买的PluronicTM表面活性剂。
还适宜用作本发明非离子表面活性剂体系的非离子表面活性剂的是环氧乙烷与环氧丙烷和乙二胺的反应产物的缩合产物。这些产物的疏水部分由乙二胺和过量环氧丙烷的反应产物组成，通常分子量为约2500至约3000。此疏水部分与环氧乙烷缩合的程度使得缩合产物含有约40％至约80％重量的聚氧乙烯、并且分子量约为5,000至约11,000。这类非离子表面活性剂的例子包括由BASF销售的某些可购买的TetronicTM化合物。
优选用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂是烷基酚的聚环氧乙烷缩合物、伯型和仲型脂肪醇与约1至约25摩尔环氧乙烷的缩合物、烷基多糖及其混合物。最优选的是具有3到15个乙氧基的C8-C14烷基酚乙氧化物以及具有2到10个乙氧基的C8-C18(优选平均为C10)醇乙氧化物及其混合物。
非常优选的非离子表面活性剂是下式的多羟基脂肪酸酰胺表面活性剂 其中R1是H或R1是C1-4烃基、2-羟乙基、2-羟丙基或其混合物，R2是C5-31烃基，Z是多羟基烃基(具有至少3个直接连接到链上的羟基的直链烃基链)或其烷氧基化衍生物。优选，在还原性胺化反应中，R1是甲基，R2是直链C11-15烷基或C16-18烷基或链烯基如椰油烷基或其混合物，Z衍生自还原糖如葡萄糖、果糖、麦芽糖或乳糖。
高度优选的阴离子表面活性剂包括烷基烷氧基化硫酸盐表面活性剂。有关例子是通式RO(A)mSO3M的水溶性盐或酸，其中R是未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基成分的羟基烷基，优选C12-C20烷基或羟基烷基，更优选C12-C18烷基或羟基烷基，A是乙氧基或丙氧基单元，m大于0，通常在约0.5至约6之间，更优选在约0.5至约3之间，M是H或阳离子并可以是例如金属阳离子(例如钠、钾、锂、钙、镁等)、铵或取代的铵阳离子。烷基乙氧基化硫酸盐和烷基丙氧基化硫酸盐也包括在本发明中。取代的铵阳离子的具体例子包括甲基-、二甲基-、三甲基-铵阳离子和季铵阳离子如四甲基铵和二甲基哌啶鎓阳离子和衍生自烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺的那些物质及其混合物等等。示范性的表面活性剂是C12-C18烷基聚乙氧基化(1.0)硫酸盐(C12-C18E(1.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化(2.25)硫酸盐(C12-C18(2.25)M)和C12-C18烷基聚乙氧基化(3.0)硫酸盐(C12-C18E(3.0)M)和C12-C18烷基聚乙氧基化(4.0)硫酸盐(C12-C18E(4.0)M)，其中M适宜地选自钠和钾。
可使用的适当的阴离子表面活性剂是烷基酯磺酸盐表面活性剂，其包括C8-C20羧酸(即脂肪酸)的直链酯类，该表面活性剂是由气态SO3磺化而成的，参见“美国石油化学家协会杂志”(″The Journal of the American OilChemists Society″)，52(1975)，pp.323-329。适当的原料包括衍生自动物脂、棕榈油等的天然脂肪物质。
优选的烷基酯磺酸盐表面活性剂，尤其在洗衣应用中，包括以下结构式的烷基酯磺酸盐表面活性剂 其中R3是C8-C20烃基，优选烷基或其组合；R4是C1-C6烃基，优选烷基或其组合；M为阳离子，其与烷基酯磺酸形成水溶性盐。适当的形成盐的阳离子包括金属诸如钠、钾和锂以及取代或未取代的铵阳离子，诸如一乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺。优选R3是C10-C16烷基，且R4是甲基、乙基或异丙基。尤其优选的是甲基酯磺酸盐，其中R3是C10-C16烷基。
其它适当的阴离子表面活性剂包括烷基硫酸盐表面活性剂，该表面活性剂是通式ROSO3M的水溶性盐或酸，其中R优选是C10-C24的烃基，优选烷基或含有C10-C20烷基成分的羟基烷基，更优选C12-C18烷基或羟基烷基，且M为H或阳离子，例如碱金属阳离子(例如钠、钾、锂)或铵或取代的铵(例如甲基-、二甲基-和三甲基铵阳离子和季铵阳离子如四甲基铵和二甲基哌啶鎓阳离子以及衍生自烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺及其混合物的季铵阳离子等)。通常C12-C16烷基链优选用于低温洗涤(例如低于约50℃)，而C16-C18烷基链优选用于高温洗涤(例如高于约50℃)。
其它可用于清洁目的的阴离子表面活性剂也可以包括在本发明的洗衣洗涤剂组合物中。它们可包括皂盐(包括例如钠、钾、铵和取代的铵盐如单-、二-和三乙醇胺盐)、C8-C22伯型或仲型链烷磺酸盐、C8-C24烯属磺酸盐、由碱土金属柠檬酸盐的热解产物通过磺化反应制备的磺化多羧酸(例如，英国专利说明书1,082,179所公开的)、C8-C24烷基聚乙二醇醚硫酸盐(其含有最多10摩尔的环氧乙烷)；烷基甘油磺酸盐、脂肪酰基甘油磺酸盐、脂肪油基甘油硫酸盐、烷基酚环氧乙烷醚硫酸盐、链烷磺酸盐、烷基磷酸盐、羟乙基磺酸盐如酰基羟乙基磺酸盐、N-酰基牛磺酸盐、烷基琥珀酰胺酸盐和磺基琥珀酸盐、磺基琥珀酸酯的单酯类(尤其是饱和和不饱和C12-C18单酯)和磺基琥珀酸酯的二酯类(尤其是饱和和不饱和C6-C12二酯)、酰基肌氨酸盐、烷基多糖的硫酸盐如烷基多葡萄糖苷(非离子非硫酸化的化合物，见下述)的硫酸盐、支链伯烷基硫酸盐和烷基聚乙氧基羧酸盐诸如通式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+的盐(其中R是C8-C22烷基，k是从1到10的整数，M是形成可溶性盐的阳离子)。树脂酸和氢化树脂酸如松香、氢化松香和在松浆油内的或衍生自松浆油的树脂酸和氢化树脂酸也是适宜的。
烷基苯磺酸盐是非常优选的。尤其优选的是直链(线性)烷基苯磺酸盐(LAS)，其中烷基基团优选包含10到18个碳原子。
其它实例在“表面活性剂和洗涤剂”(Surface Active Agents andDetergents)(Vol.I和II，Schwartz，Perrry和Berch)中描述。多种此类表面活性剂也一般性地公开于US 3,929,678(23栏，58行到29栏，23行，在本文中将其引入作为参考)。
当被包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物通常含有按重量计约1％到约40％，优选约3％到约20％这种阴离子表面活性剂。
本发明的洗衣洗涤剂组合物也可以含有此处已经公开的表面活性剂之外的阳离子、两性的、两性离子的和半极性表面活性剂，以及非离子和/或阴离子表面活性剂。
适合用于本发明的洗衣洗涤剂组合物的阳离子清洁表面活性剂具有一个长链烃基。此阳离子表面活性剂的例子包括铵表面活性剂如烷基三甲基铵卤化物和通式[R2(OR3)y][R4(OR3)y]2R5N+X-的表面活性剂，其中R2是在烷基链中含有约8至约18个碳原子的烷基或烷基苄基基团，每个R3选自-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、CH2CH(CH2OH)-、-CH2CH2CH2-及其混合物；每个R4选自C1-C4烷基、-C1-C4羟基烷基、通过连接两个R4基团形成的苄基环结构、-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH(其中R6是任何己糖或分子量小于约1000的己糖聚合物)和氢(当y非零时)；R5与R4相同或是烷基链，其中总碳原子个数或R2加R5的碳原子个数不超过约18；每个y从0至约10，并且y值总和为0至约15；且X是任何相容的阴离子。
非常优选的阳离子表面活性剂是可以用于本发明组合物中的水溶性季铵化合物，该化合物具有通式R1R2R3R4N+X-(i)，其中R1是C8-C16烷基，R2、R3和R4各独立地是C1-C4烷基、C1-C4羟基烷基、苄基和-(C2H40)xH，其中x的值为2到5，且X是阴离子。R2、R3和R4中最多一个为苄基。
优选的R1烷基链长度为C12-C15，尤其是当该烷基基团衍生自椰子或棕榈核脂肪并具有混合链长度时，或当该烷基基团通过烯烃聚合或OXO醇合成而衍生得到时。
优选的R2、R3和R4基团是甲基和羟乙基，且阴离子X可选自卤离子、甲基硫酸根离子、醋酸根离子和磷酸根离子。
适用于这里的通式(i)的季铵化合物的实例有椰油三甲基铵氯化物或溴化物；椰油甲基二羟乙基铵氯化物或溴化物；癸基三乙基铵氯化物；癸基二甲基羟乙基铵氯化物或溴化物；C12-15二甲基羟乙基铵氯化物或溴化物；
椰油二甲基羟乙基铵氯化物或溴化物；肉豆蔻基三甲基铵甲基硫酸盐；月桂基二甲基苄基铵氯化物或溴化物；月桂基二甲基(氧乙烯基)4铵氯化物或溴化物；胆碱酯(通式(i)的化合物，其中R1是 烷基，且R2、R3、R4是甲基)；二烷基咪唑啉[通式(i)的化合物]。
可用于本文的其它阳离子表面活性剂也记载于US 4,228,044和EP0000224中。
当包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物通常含有按重量计约0.2％到约25％，优选约1％到约8％的这些阳离子表面活性剂。
两性表面活性剂也适于用在本发明的洗衣洗涤剂组合物中。这些表面活性剂可被大致描述为仲胺或叔胺的脂肪族衍生物，或者杂环仲胺和叔胺的脂肪族衍生物，其中脂肪族基可以是直的或分枝的链。脂肪族取代基之一含有至少约8个碳原子，典型地约8到约18个碳原子，而至少一个含有阴离子水增溶基团，例如羧基、磺酸根、硫酸根。关于两性表面活性剂的实例见US 3,929,678(19栏，18-35行)。
当包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物通常含有按重量计约0.2％到约15％，优选约1％到约10％的这些两性表面活性剂。
两性离子表面活性剂也适合用于洗衣洗涤剂组合物中。可以将这些表面活性剂宽泛地描述为仲胺和叔胺的衍生物、杂环仲胺和叔胺的衍生物或季铵、季鏻或叔硫鎓化合物的衍生物。关于两性离子表面活性剂的例子可以参见US 3,929,678(第19栏，第38行至第22栏第48行)。
当被包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物通常含有按重量计约0.2％到约15％，优选约1％到约10％的这些两性离子表面活性剂。
半极性非离子表面活性剂是非离子表面活性剂的特殊类型，其包括含有1个具有约10至约18个碳原子的烷基部分和2个选自含有约1至约3个碳原子的烷基和羟基烷基的部分的水溶性胺氧化物；含有1个具有约10至约18个碳原子的烷基部分和2个选自含有约1至约3个碳原子的烷基和羟基烷基的部分的水溶性氧化膦；和含有1个具有约10至约18个碳原子的烷基部分和选自含有约1至约3个碳原子的烷基和羟基烷基的部分的水溶性亚砜。
半极性非离子洗涤剂表面活性剂包括具下式的胺氧化物表面活性剂 其中R3是含有约8至约22个碳原子的烷基、羟基烷基或烷基苯基或其混合物；R4是含有约2至约3个碳原子的亚烷基或羟基亚烷基或其混合物；x为0至约3每个R5各是含有约1至约3个碳原子的烷基或羟基烷基或含有约1至约3个环氧乙烷的聚环氧乙烷基团。R5可以相互连接，例如通过氧或氮原子连接成环结构。
这些胺氧化物表面活性剂尤其包括C10-C18烷基二甲基胺氧化物和C8-C12烷氧基乙基二羟基乙基胺氧化物。
当被包括在其中时，本发明的洗衣洗涤剂组合物通常含有按重量计约0.2％到约15％，优选约1％到约10％的这些半极性非离子表面活性剂。
助洗剂体系根据本发明的组合物可以进一步包含助洗剂体系。任何常规的助洗剂体系都适合用于这里，包括硅铝酸盐材料、硅酸盐、多羧酸酯和脂肪酸、如乙二胺四乙酸盐等材料、金属离子螯合剂如氨基多膦酸酯，尤其是二乙胺四亚甲基膦酸和二亚乙基三胺五亚甲基膦酸。尽管由于环境原因较不优选磷酸盐助洗剂，但其仍可以用在此处。
适当的助洗剂可以是无机离子交换材料，通常是无机水合硅铝酸盐材料，更特别的是水合的合成沸石，如水合沸石A、X、B、HS或MAP。
另一适合的无机助洗剂材料为层状硅酸盐，例如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是由硅酸钠(Na2Si2O5)组成的晶体层状硅酸盐。
适宜的含有一个羧基基团的多羧酸盐包括乳酸、甘醇酸和其醚衍生物，公开在比利时专利Nos.831,368、821,369和821,370中。包含两个羧基基团的多羧酸盐包括丁二酸、丙二酸、(亚乙二氧基)双乙酸、马来酸、二甘醇酸、酒石酸、丙醇二酸和富马酸的水溶性盐，以及在德国Offenle-enschrift 2,446,686和2,446,487、US 3,935,257中公开的醚羧酸盐和在比利时专利No.840,623中公开的亚硫酰基羧酸盐。含有三个羧酸基团的多羧酸盐包括尤其是水溶性柠檬酸盐、乌头酸盐和柠康酸盐以及丁二酸盐衍生物如英国专利No.1,379,241中公开的羧甲基氧基丁二酸盐，在荷兰申请7205873中公开的2-羟基丙氧基丁二酸盐(lactoxysuccinates)和在英国专利No.1,387,447中公开的氧化多羧酸盐材料如2-氧杂-1，1，3-丙烷三羧酸盐。
包含四个羧基基团的多羧酸盐包括在英国专利No.1,261,829中公开的氧联二丁二酸盐、含有磺基取代基的1，1，2，2，-乙烷四羧酸盐、1，1，3，3-丙烷四羧酸盐，包括在英国专利Nos.1,398,421和1,398,422以及US 3,936,448中公开的磺基琥珀酸盐衍生物，和在英国专利No.1,082,179中公开的磺化热解柠檬酸盐，而英国专利No.1,439,000公开了包含膦基取代基的多羧酸盐。
脂环族的和杂环的多羧酸盐包括环戊烷-顺，顺，顺-四羧酸盐、环戊二烯五羧酸盐、2，3，4，5-四氢呋喃-顺，顺，顺-四羧酸盐、2，5-四氢呋喃-顺-二羧酸盐、2，2，5，5，-四氢呋喃四羧酸盐、1，2，3，4，5，6-己烷-六羧酸盐和多元醇如山梨醇、甘露糖醇和木糖醇的羧甲基衍生物。芳族多羧酸盐包括在英国专利No.1,425,343中公开的苯六甲酸、1，2，4，5-苯四酸和邻苯二甲酸衍生物。
上述中优选的多羧酸盐是每个分子包含多达3个羧基基团的羟基-羧酸盐，更优选的是柠檬酸盐。
优选的用于本发明组合物中的助洗剂体系包括水不溶性硅铝酸盐助洗剂如沸石A或层状硅酸盐(SKS-6)和水溶性羧酸螯合剂如柠檬酸的混合物。
适合包含在本发明洗涤剂组合物中的螯合剂是乙二胺-N，N′-二琥珀酸(EDDS)或其碱金属、碱土金属、铵或取代铵盐，或它们的混合物。优选的EDDS化合物是游离酸形式和其钠或镁盐。这些优选的EDDS钠盐的实例包括Na2EDDS和Na4EDDS。优选的EDDS镁盐的实例包括MgEDDS和Mg2EDDS。镁盐最优选包含在本发明组合物中。
优选的助洗剂体系包括水不溶性硅铝酸盐助洗剂如沸石A和水溶性羧酸螯合剂如柠檬酸的混合物。
其它可以形成粒状组合物中使用的助洗剂体系的一部分的助洗剂材料包括无机材料如碱金属碳酸盐、碳酸氢盐、硅酸盐，和有机材料如有机膦酸盐、氨基聚亚烷基膦酸盐和氨基多羧酸盐。
其它适宜的水溶性有机盐是均聚物酸或共聚物酸或它们的盐，其中多羧酸包含至少两个被不多于两个碳原子相分隔的羧基基团。
GB-A-1,596,756公开了此类聚合物。此类盐的实例是MW 2000-5000的聚丙烯酸盐和它们与马来酸酐的共聚物，该共聚物的分子量是20,000到70,000，尤其约40,000。
组合物中通常包括5％到80％重量的洗涤助洗剂盐。液体洗涤剂中优选包括5％到30％的助洗剂。
酶优选的洗涤剂组合物，除了包含本发明的果胶酸裂解酶制品外，还包含其它可提供清洁性能和/或织物养护益处的酶。根据本发明，为了提高氧化和钙-耗竭稳定性可以修饰额外的酶。
这些酶包括蛋白酶、脂肪酶、角质酶，淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)、半纤维素酶，如甘露聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、酯酶、地衣多糖酶、arabinanases和其他果胶酸裂解酶。
蛋白酶任何适合用于碱性溶液的蛋白酶都可以使用。合适的蛋白酶包括来自动物、植物或微生物的蛋白酶。来源于微生物的蛋白酶是优选的。也包括经化学或遗传修饰的突变体。所述的蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草芽孢杆菌蛋白酶，特别是来自芽孢杆菌的枯草芽孢杆菌蛋白酶，例如，枯草芽孢杆菌蛋白酶Novo、枯草芽孢杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草芽孢杆菌蛋白酶309、枯草芽孢杆菌蛋白酶147和枯草芽孢杆菌蛋白酶168(WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如来自猪或牛的)和如WO 89/06270所公开的镰刀菌属蛋白酶。
优选的可购买的蛋白酶包括商品名为Alcalase，Savinase，Primase，Durazym，Esperase(Novo Nordisk A/S，丹麦出售)；Maxatase，Maxacal，Maxapem，Properase，Purafect，Purafect OxP(Genencor InternationalInc.出售)；Opticlean和Optimase(Solvay Enzymes出售)的那些。以酶蛋白质在组合物中的重量计，混合在本发明组合物中的蛋白酶可以占0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
脂肪酶适用于碱性溶液的任何脂肪酶均可以使用。合适的脂肪酶包括那些来源于细菌或真菌的脂肪酶。也包括经化学或遗传修饰的突变体。
有用的脂肪酶的实例包括来自Humicola lanuginosa的脂肪酶，如EP 258 068和EP 305 216中所述，来自Rhizomucor miehei的脂肪酶，如EP238 023所述，来自假丝酵母菌属(Candida)的脂肪酶，例如南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶，如EP214 761中所述的南极假丝酵母脂肪酶A或B，来自假单胞菌属(Pseudomonas)的脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(见例如EP 218 272)，洋葱假单胞菌(P.cepacia)(见例如EP 331 376)，施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)，荧光假单胞菌(P.fluorescens)的脂肪酶，来自芽孢杆菌属的脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人(1993)，生物化学与生物物理学学报(Biochemica et Biophysica acta)，1131，253-260)，嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)和短小芽孢杆菌(B.Pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。
此外，一些克隆的脂肪酶也可以使用，包括在Yamaguchi等，(1991)，基因(Gene)103，61-67中公开的沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶，白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(Schimada，Y.等.，(1989)，生物化学杂志(J.Biochem.).，106，383-388)，和各种根霉菌属(Rhizopus)脂肪酶如R.delemar脂肪酶(Hass，M.J等.，(1991)，基因109，117-113)，雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya et al.，(1992)，生物化学生物技术生物科学(Biosci.Biotech.Biochem.)56，716-719)和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。
其它类型的脂解酶如角质酶也可以使用，例如，在WO 88/09367中公开的衍生自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶，或衍生自腐皮镰孢菌(Fusarium solani pisi)的角质酶(例如在WO 90/09446中公开的)。
特别适合的脂肪酶是脂肪酶如M1 LipaseTM、Luma fastTM和LipomaxTM(Genencor)、LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novo NordiskA/S)，和脂肪酶P″Amano″(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.)。
以酶蛋白质在组合物中的重量计，混合在本发明洗涤剂组合物中的脂肪酶通常占0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
淀粉酶适用于碱性溶液的任何淀粉酶(α和/或β)均可使用。合适的淀粉酶包括那些来源于细菌或真菌的淀粉酶。也包括经化学或遗传修饰的突变体。淀粉酶包括例如，来自地衣芽孢杆菌的特定菌株的α-淀粉酶，详细内容参见GB 1,296,839。可购买的淀粉酶是DuramylTM，TermamylTM，FungamylTM和BANTM(可来自Novo Nordisk A/S)，RapidaseTM和Maxamyl PTM，PurastarTM和Purastar OxAmTM(可来自Genencor)。此外，与SP707(Tsukamoto，A.等，1988.Biochem.Biophys.Res.Commun.15125)或K38(Kao Corp.EP1022334)具有70％以上同源性的淀粉酶也是适宜的。
以酶蛋白质在组合物中的重量计，混合在本发明洗涤剂组合物中的淀粉酶通常占0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
纤维素酶任何适合用于碱性溶液的纤维素酶都可使用。合适的纤维素酶包括来源于细菌或真菌的纤维素酶。也包括经化学或遗传修饰的突变体。合适纤维素酶公开在如下文献中在US 4,435,307中公开了产生自Humicola insolens的真菌纤维素酶。特别适合的纤维素酶是有利于颜色养护的纤维素酶。这种纤维素酶的实例是公开在欧洲专利申请No.0 495257中的纤维素酶。可购买的纤维素酶包括由Humicola insolens菌株产生的CelluzymeTM(Novo Nordisk A/S)，和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
以酶蛋白质在组合物中的重量计，混合在本发明洗涤剂组合物中的纤维素酶通常占0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
过氧化物酶/氧化酶过氧化物酶与过氧化氢或过氧化氢源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)结合使用。氧化酶与氧气结合使用。两种类型的酶都用于“溶液漂白”，即防止当两种织物在洗涤液(优选含有如在WO94/12621和WO 95/01426中公开的增强剂)中一起洗涤的时候染色织物上的纺织品染料转移到另一织物上。合适的过氧化物酶/氧化酶包括来源于植物、细菌或真菌的过氧化物酶/氧化酶。也包括经化学或遗传修饰的突变体。
以酶蛋白质在组合物中的重量计，混合在本发明洗涤剂组合物中的过氧化物酶和/或氧化酶通常占0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
果胶酸裂解酶已经从不同的细菌属如欧文氏菌属、假单胞菌、克雷伯菌属和黄单胞菌属克隆了果胶酸裂解酶。也已经描述了从枯草芽孢杆菌(Nasser等(1993)FEBS 335319-326)和芽孢杆菌属种YA-14(Kim等(1994)Biosci.Biotech.Biochem.58947-949)克隆果胶酸裂解酶。
果胶酸裂解酶通常的特征是碱性最适pH和对二价阳离子的绝对需要，Ca2+具有最大刺激作用。
以上提到的酶的混合物也包括在本文中，特别是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和/或纤维素酶的混合物。
以酶蛋白质在组合物中的重量计，混合在洗涤剂组合物中的本发明果胶酸裂解酶或其它任何酶通常占0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
漂白剂另外可选择的可包括在本发明洗涤剂组合物中的洗涤剂组分包括漂白剂如PB1、PB4和粒径为400-800微米的过碳酸盐。这些漂白剂成分可以包括一种或多种氧漂白剂和根据选择的漂白剂而不同的一种或多种漂白活化剂。如果存在的话，氧漂白化合物通常以约1％至约25％的水平存在。通常，漂白化合物是非液体制剂，例如粒状洗涤剂中的任选加入组分。
用于这里的漂白剂组分可以是任何可以用于洗涤剂组合物的漂白剂，包括氧漂白剂以及其它本领域已知的漂白剂。
适用于本发明的漂白剂可以是活化的或未活化的漂白剂。
一种可用的氧漂白剂包括过羧酸漂白剂和其盐。此类漂白剂的适当实例包括单过氧邻苯二甲酸镁六水合物、间氯过苯甲酸镁，4-壬氨基-4-氧代过氧丁酸和二过氧十二烷二酸。US 4,483,781、US 740,446、EP 0 133 354和US 4,412,934中公开了这些漂白剂。非常优选的漂白剂也包括在US4,634,551中公开的6-壬氨基-6-氧代过氧己酸。
可使用的其它种类漂白剂包括卤素漂白剂。次卤酸盐漂白剂的实例包括例如三氯异氰脲酸，二氯异氰脲酸钠和钾及N-氯和N-溴烷烃磺酰胺。这些材料通常占成品的0.5-10％重量，优选1-5％重量。
过氧化氢释放剂可与漂白活化剂结合使用，漂白活化剂如四乙酰基乙二胺(TAED)，壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS，在US 4,412,934中公开)，3，5-三甲基-hexsanol氧基苯磺酸盐(ISONOBS，在EP 120 591中公开)或五乙酰基葡萄糖(PAG)，它们在过水解后形成作为活性漂白物的过酸，从而使漂白效果得到提高。另外，非常适合的漂白活化剂是C8(6-辛酰氨基-己酰基)氧基苯磺酸盐，C9(6-壬酰氨基己酰基)氧基苯磺酸盐和C10(6-癸酰氨基己酰基)氧基苯磺酸盐或其混合物。同样适当的活化剂是酰化柠檬酸酯，如在欧洲专利申请号91870207.7中公开的酰化柠檬酸酯。
在本发明的清洁组合物中有用的漂白剂(包括过氧酸)和漂白体系(包含漂白活化剂和过氧漂白化合物)在申请USSN08/136,626中公开。
过氧化氢也可在开始或在洗涤和/或漂洗过程中通过添加能够产生过氧化氢的酶体系(即酶及其底物)而存在。这种酶体系公开于欧洲专利申请EP 0 537 381中。
非氧漂白剂的其它漂白剂也是本领域已知的并可在此利用。一种特别有意义的非氧漂白剂包括光活化漂白剂如磺化酞菁锌和/或铝。这些材料在洗涤过程中可以沉积到底物上。在光的辐射下，在氧气存在时，如在白天通过悬挂衣物干燥，此磺化酞菁锌将被活化，导致底物被漂白。
优选的酞菁锌和光活化漂白方法公开于US 4,033,718。通常，洗涤剂组合物包含约0.025％至约1.25％重量的磺化酞菁锌。
漂白剂也可包含锰催化剂。锰催化剂可以是例如在“对于低温漂白有效的锰催化剂”，Nature 369，1994，pp.637-639中描述的化合物之一。
泡沫抑制剂另一可选组分是泡沫抑制剂，例如硅氧烷和二氧化硅-硅氧烷混合物。硅氧烷通常可以由烷基化聚硅氧烷材料代表，而二氧化硅通常以细碎形式使用，例如各种类型的二氧化硅气凝胶和干凝胶及疏水二氧化硅。这些材料可以以微粒的形式掺入，在其中泡沫抑制剂可有利地释放混合到水溶性的或水可分散的、实质上非表面活性洗涤剂的不可透过载体中。备选地，泡沫抑制剂可以溶解或分散在液体载体中并通过喷涂到一种或多种其它成分上而使用。
优选的硅氧烷泡沫控制剂公开于US 3,933,672。其它特别有用的泡沫抑制剂有自乳化硅氧烷泡沫抑制剂，在德国专利申请DTOS 2,646,126中公开。这种化合物的一个实例是DC-544，为硅氧烷-乙二醇共聚物，可从DowCorning购买。特别优选的泡沫控制剂为包含硅氧烷油和2-烷基-链烷醇的混合物的泡沫抑制剂体系。适合的2-烷基-链烷醇为2-丁基-辛醇，其可购买得到，商品名是Isofol 12R。
此泡沫抑制剂体系在欧洲专利申请EP 0 593 841中公开。
特别优选的硅氧烷泡沫控制剂在欧洲专利申请No.92201649.8中公开。所述组合物可以包含硅氧烷/二氧化硅混合物与火成无孔二氧化硅如Aerosil。
上述泡沫抑制剂通常为组合物的0.001％到2％重量，优选0.01％到1％重量。
其它成分可以应用其它在洗涤剂组合物中使用的成分，如污物悬浮剂、污物释放剂、荧光增白剂、磨料、杀细菌剂、晦暗抑制剂、着色剂和/或包囊化或未包囊化的香料。
特别适合的包囊化材料是水溶性胶囊，该胶囊由具有多糖和多羟基化合物的基质组成，如GB1,464,616中的公开。
其它适合的水溶性包囊化材料包含糊精，如在US 3,455,838中公开的，其衍生自取代的二羧酸的未糊化的淀粉酯。这些酸-酯糊精优选制备自淀粉如蜡质种玉米、蜡质种高梁、西米、木薯和马铃薯的淀粉。所述包囊化材料的适当实例包括National Starch生产的N-Lok。N-Lok包囊化材料由改性玉米淀粉和葡萄糖组成。淀粉通过添加单官能取代基团如辛烯基丁二酸酐改性。
在这里适合的抗再沉淀剂和污物悬浮剂包括纤维素衍生物如甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟基乙基纤维素和均-或共-聚多羧酸或它们的盐。这类聚合物包括在前作为助洗剂描述的聚丙烯酸盐和马来酸酐-丙烯酸共聚物，以及马来酸酐与乙烯、甲基乙烯基醚或甲基丙烯酸的共聚物，马来酸酐占共聚物的至少20摩尔％。这些材料通常以组合物的0.5％到10％重量，更优选0.75％到8％，最优选1％到6％重量使用。
优选的荧光增白剂在性质上是阴离子的，其例子是4，4′-二-(2-二乙醇氨基-4-苯氨基-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2′二磺酸二钠、4，4′-二-(2-吗啉代-4-苯氨基-s-三嗪-6-基氨基)-二苯乙烯-2，2′-二磺酸二钠、4，4 ′-二-(2，4-二苯氨基-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2′-二磺酸二钠、4′，4″-二-(2，4-二苯氨基-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2-磺酸一钠、4，4′-二-(2-苯氨基-4-(N-甲基-N-2-羟基乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2′-二磺酸二钠、4，4′-二-(4-苯基-2，1，3-三唑-2-基)-二苯乙烯-2，2′-二磺酸二钠、4，4′-二-(2-苯氨基-4-(1-甲基-2-羟基乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2′-二磺酸二钠、2-(二苯乙烯基-4″-(萘并-1′，2′4，5)-1，2，3-三唑-2″-磺酸钠和4，4′-二-(2-磺基苯乙烯基)联苯。
其它可用的聚合材料有聚乙二醇，特别是分子量1000-10000，更优选2000到8000且最优选约4000的聚乙二醇。这些材料以0.20％到5％，更优选0.25％到2.5％重量使用。这些聚合物和在前提到的均聚-或共聚-多羧酸盐对于在过渡金属杂质存在时粘性、蛋白质性和可氧化的污物上白度维护、织物灰沉积和清洁性能的提高是有价值的。
本发明组合物中可用的污物释放剂通常是具有各种排列的乙二醇和/或丙二醇单元与对苯二酸的共聚物或三元共聚物。此聚合物的实例公开于US 4,116,885和4,711,730和EP 0 272 033。根据EP 0 272 033的特别优选的聚合物具有以下通式
(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75其中PEG是-(OC2H4)O-，PO是(OC3H6O)且T是(pOOC6H4CO)。
另外非常有用的是作为对苯二甲酸二甲酯、磺基间苯二甲酸二甲酯、乙二醇和1，2-丙二醇的随机共聚物的改性聚酯，其中端基主要由磺基苯甲酸酯以及其次由乙二醇和/或1，2-丙二醇的单酯构成。目标是得到一种两端都被磺基苯甲酸酯基团封端的聚合物，在本上下文中，“主要”是指大部分所述共聚物被磺基苯甲酸酯基团封端。然而，有些共聚物未被完全封端，因此它们的端基可由乙二醇和/或1，2-丙二醇的单酯构成，即“其次”由该类物质构成。
这里选择的聚酯包含约46％重量的二甲基对苯二甲酸、约16％重量的1，2-丙二醇，约10％重量的乙二醇，约13％重量的二甲基磺基苯甲酸和约15％重量的磺基间苯二甲酸，并且其分子量为约3,000。聚酯和它们的制备方法参见EP 311 342中的公开。
软化剂织物软化剂也可混合到本发明的洗衣洗涤剂组合物中。这些软化剂可以是无机或有机类型。无机软化剂可举例的有如在GB-A-1 400898和US5,019,292中公开的绿土粘土(smectite clay)。有机织物软化剂包括在GB-A1514 276和EP 0 011 340中公开的水不溶性叔胺和在EP-B-0 026 528中公开的它们同单C12-C14季铵盐的联合和在EP 0 242 919中公开的双长链酰胺。其它可用的织物软化体系的有机成分包括在EP 0 299 575和0 313146中公开的高分子量聚环氧乙烷材料。
绿土粘土的水平通常是5％到15％，更优选8％到12％重量，该材料以干燥混合成分加入到制品的剩余组分中。有机织物软化剂如水不溶性叔胺或双长链酰胺材料的掺入水平为0.5％到5％重量，通常为1％到3％重量，而高分子量聚环氧乙烷材料和水溶性阳离子材料的加入水平为0.1％到2％，通常为0.15％到1.5％重量。这些材料通常加入到组合物的喷雾干燥部分中，尽管在一些情况下可能更适合将它们以干燥混合颗粒形式添加到其中，或将它们以熔化液体形式喷到组合物的其它固体组分上。
聚合物染料转移抑制剂本发明的洗涤剂组合物也可包含0.001％到10％，优选0.01％到2％，更优选0.05％到1％重量的聚合物染料转移抑制剂。所述聚合物染料转移抑制剂通常混合到洗涤剂组合物中用以抑制染料从有色织物转移到同时洗涤的其它织物上。这些聚合物能够在从染色织物洗出的易褪色染料有机会接触洗涤中的其它织物之前结合或吸收该染料。
特别适合的聚合物染料转移抑制剂是多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基-吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮聚合物，聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑或它们的混合物。
添加这些聚合物也可提高本发明酶的性能。
本发明的洗涤剂组合物可为液体、浆状、凝胶、棒状或颗粒形式。
无尘颗粒可采用例如在US 4,106,991和4,661,452(两者都是NovoIndustri A/S的)公开的方法生产，并可任选性地通过本领域已知方法加包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1000到20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16到50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；具有15到80个环氧乙烷单元的乙氧基化脂肪醇，其中醇包含12到20个碳原子；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-和双-和三甘油酯。适用于流化床技术的膜形成包衣材料的实例在GB 1483591中给出。
本发明颗粒组合物也可以采取“致密形式”，即，它们可以具有比通常的颗粒洗涤剂相对更高的密度，即550到950g/l；在此情况下，本发明的颗粒洗涤剂组合物将包括较通常的颗粒洗涤剂较小量的“无机填料盐”；典型的填料盐是碱土金属的硫酸盐和氯化物，典型地为硫酸钠；“致密”洗涤剂通常包含至多10％的填料盐。本发明的液体组合物也可是“浓缩形式”，在此情况下，本发明的液体洗涤剂组合物将包括较通常的液体洗涤剂较小量的水。通常，浓缩的液体洗涤剂的水含量占洗涤剂组合物重量的不到30％，更优选不到20％，最优选不到10％。
本发明的组合物可以例如配制成手洗和机洗洗衣洗涤剂组合物(其中包括洗衣添加剂组合物和适合用于污染织物的预处理的组合物)，漂洗时添加的织物柔软组合物，和用于普通家庭清洗硬表面和洗碗操作的组合物。
下述实施例旨在举例说明本发明组合物，而非旨在对本发明范围进行限定或定义。
在洗涤剂组合物中，简写的成分标识符的意义如下LAS 直链C12烷基苯磺酸钠TAS 牛油烷基硫酸钠XYAS C1x-C1Y烷基硫酸钠SS式2-丁基辛酸的第二皂表面活性剂25EY 与平均Y摩尔环氧乙烷缩合的主要为直链的C12-C15伯醇45EY 与平均Y摩尔环氧乙烷缩合的主要为直链的C14-C15伯醇XYEZS 每摩尔与平均Z摩尔的环氧乙烷缩合的C1x-C1y烷基硫酸钠非离子表面活剂平均乙氧基化程度为3.8而平均丙氧基化程度为4.5的C13-C15混合的乙氧基化/丙氧基化脂肪醇，由BASF GmbH售出，商品名为Plurafax LF404CFAA C12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺TFAA C16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺硅酸盐无定型硅酸钠(SiO2∶Na2O比率＝2.0)NaSKS-6 1式δ-Na2Si2O5的晶状多层硅酸盐碳酸盐无水碳酸钠磷酸盐三磷酸钠
MA/AA 1∶4马来酸/丙烯酸共聚物，平均分子量约为80,000聚丙烯酸盐平均分子量8,000的聚丙烯酸盐均聚物，BASF Gmbh生产，商品名PA30盐沸石A 初级粒径在1-10微米范围内的式Na12(AlO2SiO2)12·27H2O的水合硅铝酸钠柠檬酸盐 二水合柠檬酸三钠柠檬酸柠檬酸过硼酸盐 无水过硼酸钠一水合物漂白剂，经验式NaBO2H2O2PB4 无水过硼酸钠四水合物过碳酸盐 经验式为2Na2CO3·3H2O2的无水过碳酸钠漂白剂TAED 四乙酰基乙二胺CMC 羧甲基纤维素钠DETPMP二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)，由Monsanto售出，商品名为Dequest 2060PVP 聚乙烯吡咯烷酮聚合物EDDS 钠盐形式的乙二胺-N，N′-二琥珀酸[S，S]异构体泡沫抑制剂Mpt(熔点)为50℃的25％石蜡，17％疏水二氧化硅，58％石蜡油颗粒泡沫抑制剂12％硅氧烷/二氧化硅、18％十八烷醇、70％颗粒形式的淀粉硫酸盐无水硫酸钠HMWPEO高分子量的聚环氧乙烷TAE 25乙氧基化牛油醇(25)洗涤剂实施例1可以如下制备根据本发明的粒状织品清洁组合物
直链C12烷基苯磺酸钠 6.5硫酸钠 15.0沸石A 26.0次氮基三乙酸钠 5.0本发明的酶 0.1PVP0.5TAED 3.0硼酸 4.0过硼酸盐 18.0酚磺酸盐 0.1微量物质 达到100洗涤剂实施例II本发明致密颗粒织物清洁组合物(密度800g/l)可如下制备45AS 8.025E3S 2.025E5 3.025E3 3.0TFAA 2.5沸石A 17.0NaSKS 12.0柠檬酸 3.0碳酸盐 7.0MA/AA 5.0CMC0.4本发明的酶 0.1TAED 6.0过碳酸盐 22.0EDDS 0.3颗粒泡沫抑制剂 3.5
水/微量物质 达到100％洗涤剂实施例III尤其可用于洗涤有色织物的本发明颗粒织物清洁组合物制备如下LAS 10.7 -TAS 2.4 -TFAA - 4.045AS 3.1 10.045E7 4.0 -25E3S - 3.068E11 1.8 -25E5 - 8.0柠檬酸盐 15.0 7.0碳酸盐 - 10柠檬酸2.5 3.0沸石A 32.1 25.0Na-SKS-6 - 9.0MA/AA 5.0 5.0DETPMP0.2 0.8本发明的酶0.10 0.05硅酸盐2.5 -硫酸盐5.2 3.0PVP 0.5 -聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/乙烯基咪唑和乙烯 - 0.2基吡咯烷酮的共聚物过硼酸盐 1.0 -酚磺酸盐 0.2 -
水/微量物质达到100％洗涤剂实施例IV可提供“洗涤过程中软化”能力的本发明颗粒织物清洁组合物可如下制备45AS -10.0LAS 7.6-68AS 1.3-45E7 4.0-25E3 -5.0椰油烷基-二甲基羟乙基 1.4 1.0铵氯化物柠檬酸盐 5.0 3.0Na-SKS-6 -11.0沸石A 15.0 15.0MA/AA 4.0 4.0DETPMP0.4 0.4过硼酸盐 15.0 -过碳酸盐 -15.0TAED 5.0 5.0绿土粘土 10.0 10.0HMWPEO -0.1本发明的酶0.10 0.05硅酸盐3.0 5.0碳酸盐10.0 10.0颗粒泡沫抑制剂1.0 4.0CMC 0.2 0.1水/微量物质 达到100％
洗涤剂实施例V根据本发明的强效型液体织物清洁组合物可如下制备AB酸形式的LAS- 25.0柠檬酸5.0 2.0酸形式的25AS 8.0 -酸形式的25AE2S3.0 -25AE7 8.0 -CFAA 5-DETPMP1.0 1.0脂肪酸 8-油酸 - 1.0乙醇 4.0 6.0丙二醇2.0 6.0本发明的酶0.10 0.05椰油烷基-二甲基羟乙基铵氯 - 3.0化物绿土粘土 - 5.0PVP 2.0 -水/微量物质 达到100％实施例1测量液体洗涤剂中果胶酸裂解酶的稳定性如下所述，在温育酶-洗涤剂混合物后通过测量本发明果胶酸裂解酶变体的活性，评价变体的洗涤剂稳定性。
残留活性试验在两个样品管中将30微升酶溶液(培养物上清液或纯化的酶)与1ml典型的欧洲或美国强效型液体洗涤剂混合。其中一管贮藏在冰上，另一管于40℃温育90分钟。作为参照，将30微升的水与1ml的洗涤剂混合并在冰上温育。温育后，9ml的冰冷的水加入样品中，剧烈混合并贮藏在冰上待进一步的分析。
对于酶活性的测定，首先混合50微升酶-洗涤剂混合物和5ml试验缓冲液(100mM Tris-HCl，0.68mM CaCl2，pH8.0)，然后从该溶液中取出75微升与75微升新鲜制备的底物溶液(含1％聚半乳糖醛酸的试验缓冲液)混合并于40℃温育10分钟。再后，将100微升的温育混合物加入UV-可透过的微量滴定板中的100微升终止缓冲液(50mM H3PO4)内，并用分光光度计测量235nm处的吸光值。水-洗涤剂样品用来调节分光光度计的零点。
此时，通过计算在40℃温育90分钟的样品的活性(A235吸收值)与贮藏在冰上的样品的活性的相对值，得到残留活性值残留活性(RA)＝吸收值[温育在40℃的样品]/吸收值[温育在0℃的样品]×100从而，残留活性相当于酶的洗涤剂稳定性。表2列出了在典型欧洲强效型液体洗涤剂中温育的SEQ ID NO2果胶酸裂解酶的多种氨基酸置换的提高的残留活性。大多数置换与SEQ ID NO2中所示亲本果胶酸裂解酶相比引起洗涤剂稳定性得到50％以上的提高。表3中所列SEQ ID NO2果胶酸裂解酶的置换当在典型的美国强效型液体洗涤剂中温育时同样显著地提高酶的稳定性。
表2.在欧洲强效型液体洗涤剂中温育后SEQ ID NO2的果胶酸裂解酶中的置换引起增加的残留活性。







表3.在美国强效型液体洗涤剂中温育后SEQ ID NO2果胶酸裂解酶中的置换引起增加的残留活性。


实施例2长时间温育后液体洗涤剂中果胶酸裂解酶的稳定性本发明的果胶酸裂解酶变体的洗涤剂稳定性按如下所述方法通过在温育酶和洗涤剂混合物后测定变体的活性来确定。
残留活性测定在两个样品管中将30微升酶溶液(培养物上清液或纯化的酶)与1ml典型的欧洲强效型液体洗涤剂混合。其中一管贮藏在冰上，另一管于40℃温育18或24小时。作为参照物，将30微升的水与1ml的洗涤剂混合并在冰上温育。温育后，9ml冰冷的水加入样品中，剧烈混合并贮藏在冰上待进一步的分析。
对于酶活性的测定，首先混合50微升酶-洗涤剂混合物和5ml试验缓冲液(100mM Tris-HCl，0.68mM CaCl2，pH8.0)，接着从该溶液中取出75微升与75微升新鲜制备的底物溶液(含1％聚半乳糖醛酸的试验缓冲液)混合并于40℃温育10分钟。再后，将100微升的温育混合物加入在UV-可透过的微量滴定板中的100微升终止缓冲液(50mM H3PO4)内，并用分光光度计测量235nm处的吸光值。水-洗涤剂样品用来调节分光光度计的零点。
此时，通过计算在40℃温育90分钟的样品的活性(A235吸收值)与贮藏在冰上的样品的活性的相对值，得到残留活性值
残留活性(RA)＝吸收值[温育在40℃的样品]/吸收值[温育在0℃的样品]×100从而，残留活性相当于酶的洗涤剂稳定性。表4列出了SEQ ID NO2的果胶酸裂解酶中的多个置换在典型欧洲强效型液体洗涤剂中温育18小时后引起的残留活性增加。类似地，表5列出了果胶酸裂解酶变体温育24小时后的残留活性。
表4.SEQ ID NO2果胶酸裂解酶中的置换引起增加的残留活性，该残留活性为在欧洲强效型液体洗涤剂中温育18小时后所测得的残留活性。


表5.SEQ ID NO2果胶酸裂解酶中的置换引起增加的残留活性，该残留活性通过在欧洲强效型液体洗涤剂中温育24小时后测得。


实施例3.在果胶酸裂解酶野生型和变体上进行DSC用差示扫描量热法(DSC)测量本发明的果胶酸裂解酶变体的热稳定性。实验在缓冲液(与洗涤剂不同)中进行。纯化的酶样品在10kDa截留值Slide-A-Lyzers(Pierce，USA)中用5L 20mM HEPES缓冲液，0.68mMCaCl2，pH 8.0透析两次并通过在Biofuge Stratos(Kendro，德国)中于YM10kDa Centricon cells(Amicon)中以2,400g离心浓缩到约10mg/ml。DSC在MSC 4100(Calorimetry Sciences Corporation，USA)中以1℃/min梯度从5到110℃运行，并通过CpCalc 2.1软件(Applied Thermodynamics，USA)分析数据。
表6.受试果胶酸裂解酶的转变温度(Tt)。

值得注意的是，所有变体均比亲体有增加的热稳定性。
序列表<110>诺和酶股份有限公司(Novozymes A/S)<120>果胶酸裂解酶变体<130>10190.010-DK<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1200<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1200)<400>1gct gat tta ggc cac cag acg tta gaa tca aat gat ggc tgg ggc gcg 48Ala Asp Leu Gly His Gln Thr Leu Glu Ser Asn Asp Gly Trp Gly Ala1 5 10 15tac tcg acc ggc aca aca ggc gga tca aaa gct tcg tca tcc cac gtg 96Tyr Ser Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ser Lys Ala Ser Ser Ser His Val20 25 30tat acc gtc agc aac aga aac cag ctt gtc tcg gca tta ggc aag gac144Tyr Thr Val Ser Asn Arg Asn Gln Leu Val Ser Ala Leu Gly Lys Asp35 40 45acc aac aca acg cca aaa atc att tat att aag gga acg att gac atg192Thr Asn Thr Thr Pro Lys Ile Ile Tyr Ile Lys Gly Thr Ile Asp Met50 55 60aac gtc gat gac aat ctg aag ccg ctt ggt cta aat gat tat aaa gat240Asn Val Asp Asp Asn Leu Lys Pro Leu Gly Leu Asn Asp Tyr Lys Asp65 70 75 80cca gag tac gat ttg gac aaa tat ttg aaa gcc tat gac cct agc aca288Pro Glu Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Leu Lys Ala Tyr Asp Pro Ser Thr85 90 95tgg ggc aaa aag gag ccg tcg ggg aca cta gaa gag gcg aga gca cga336Trp Gly Lys Lys Glu Pro Ser Gly Thr Leu Glu Glu Ala Arg Ala Arg100 105 110tct cag aaa aat caa aaa gca cga gtc atg gtg gat att ccg gca aac384Ser Gln Lys Asn Gln Lys Ala Arg Val Met Val Asp Ile Pro Ala Asn115 120 125acg acg atc gtc ggt tca ggg aca aat gcc aaa atc gtg ggc gga aat432Thr Thr Ile Val Gly Ser Gly Thr Asn Ala Lys Ile Val Gly Gly Asn130 135 140ttc cag atc aag agt gat aat gtc atc atc cgc aac atc gaa ttc cag480Phe Gln Ile Lys Ser Asp Asn Val Ile Ile Arg Asn Ile Glu Phe Gln
145 150 155 160gat gct tat gat tat ttt ccg caa tgg gat ccg act gac ggc agc tca 528Asp Ala Tyr Asp Tyr Phe Pro Gln Trp Asp Pro Thr Asp Gly Ser Ser165 170 175gga aac tgg aac tca caa tac gac aac atc aca ata aac ggc ggc acg 576Gly Asn Trp Asn Ser Gln Tyr Asp Asn Ile Thr Ile Asn Gly Gly Thr180 185 190cat ata tgg att gat cat tgt aca ttt aat gac ggt tcc cgt ccg gac 624His Ile Trp Ile Asp His Cys Thr Phe Asn Asp Gly Ser Arg Pro Asp195 200 205agc aca tcg cca aag tat ttc ggc aga aaa tat cag cac cat gac ggc 672Ser Thr Ser Pro Lys Tyr Phe Gly Arg Lys Tyr Gln His His Asp Gly210 215 220caa acc gat gct tct aac ggc gct aac tat atc acg atg tct tac aac 720Gln Thr Asp Ala Ser Asn Gly Ala Asn Tyr Ile Thr Met Ser Tyr Asn225 230 235 240tat tat cac gat cat gat aaa agc tcc att ttc gga tca agc gac agc 768Tyr Tyr His Asp His Asp Lys Ser Ser Ile Pne Gly Ser Ser Asp Ser245 250 255aaa aca tct gat gac ggc aaa tta aaa atc acg ctc cat cat aac cgc 816Lys Thr Ser Asp Asp Gly Lys Leu Lys Ile Thr Leu His His Asn Arg260 265 270tat aaa aat atc gtc cag cgc gca ccg aga gtc cgc ttc ggg cag gtg 864Tyr Lys Asn Ile Val Gln Arg Ala Pro Arg Val Arg Phe Gly Gln Val275 280 285cac gtt tac aac aac tat tat gaa ggc agc aca agc tcc tcg gat tat 912His Val Tyr Asn Asn Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr Ser Ser Ser Asp Tyr290 295 300gcc ttc agc tat gcg tgg gga atc gga aaa tca tct aaa atc tac gct 960Ala Phe Ser Tyr Ala Trp Gly Ile Gly Lys Ser Ser Lys Ile Tyr Ala305 310 315 320caa aac aat gtc att gac gtg cct gga ctg tca gcc gct aaa acg atc1008Gln Asn Asn Val Ile Asp Val Pro Gly Leu Ser Ala Ala Lys Thr Ile325 330 335agc gta ttc agc ggg gga acg gct tta tat gac tca ggc aca ttg ctg1056Ser Val Phe Ser Gly Gly Thr Ala Leu Tyr Asp Ser Gly Thr Leu Leu340 345 350aat ggc acg cag atc aac gca tcg gct gca aac ggg ctg agt tct tct1104Asn Gly Thr Gln Ile Asn Ala Ser Ala Ala Asn Gly Leu Ser Ser Ser355 360 365gtc ggc tgg aca ccg tct ctg cac ggc aca atc gat gct tcc gcg cat1152Val Gly Trp Thr Pro Ser Leu His Gly Thr Ile Asp Ala Ser Ala His370 375 380gta aaa tcg aat gtt ata tct caa gcg ggt gcg ggt aaa tta aat taa1200Val Lys Ser Asn Val Ile Ser Gln Ala Gly Ala Gly Lys Leu Asn385 390 395
<210>2<211>399<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌<400>2Ala Asp Leu Gly His Gln Thr Leu Glu Ser Asn Asp Gly Trp Gly Ala1 5 10 15Tyr Ser Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ser Lys Ala Ser Ser Ser His Val20 25 30Tyr Thr Val Ser Asn Arg Asn Gln Leu Val Ser Ala Leu Gly Lys Asp35 40 45Thr Asn Thr Thr Pro Lys Ile Ile Tyr Ile Lys Gly Thr Ile Asp Met50 55 60Asn Val Asp Asp Asn Leu Lys Pro Leu Gly Leu Asn Asp Tyr Lys Asp65 70 75 80Pro Glu Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Leu Lys Ala Tyr Asp Pro Ser Thr85 90 95Trp Gly Lys Lys Glu Pro Ser Gly Thr Leu Glu Glu Ala Arg Ala Arg100 105 110Ser Gln Lys Asn Gln Lys Ala Arg Val Met Val Asp Ile Pro Ala Asn115 120 125Thr Thr Ile Val Gly Ser Gly Thr Asn Ala Lys Ile Val Gly Gly Asn130 135 140Phe Gln Ile Lys Ser Asp Asn Val Ile Ile Arg Asn Ile Glu Phe Gln145 150 155 160Asp Ala Tyr Asp Tyr Phe Pro Gln Trp Asp Pro Thr Asp Gly Ser Ser165 170 175Gly Asn Trp Asn Ser Gln Tyr Asp Asn Ile Thr Ile Asn Gly Gly Thr180 185 190His Ile Trp Ile Asp His Cys Thr Phe Asn Asp Gly Ser Arg Pro Asp195 200 205Ser Thr Ser Pro Lys Tyr Phe Gly Arg Lys Tyr Gln His His Asp Gly210 215 220
Gln Thr Asp Ala Ser Asn Gly Ala Asn Tyr Ile Thr Met Ser Tyr Asn225 230 235 240Tyr Tyr His Asp His Asp Lys Ser Ser Ile Phe Gly Ser Ser Asp Ser245 250 255Lys Thr Ser Asp Asp Gly Lys Leu Lys Ile Thr Leu His His Asn Arg260 265 270Tyr Lys Asn Ile Val Gln Arg Ala Pro Arg Val Arg Phe Gly Gln Val275 280 285His Val Tyr Asn Asn Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr Ser Ser Ser Asp Tyr290 295 300Ala Phe Ser Tyr Ala Trp Gly Ile Gly Lys Ser Ser Lys Ile Tyr Ala305 310 315 320Gln Asn Asn Val Ile Asp Val Pro Gly Leu Ser Ala Ala Lys Thr Ile325 330 335Ser Val Phe Ser Gly Gly Thr Ala Leu Tyr Asp Ser Gly Thr Leu Leu340 345 350Asn Gly Thr Gln Ile Asn Ala Ser Ala Ala Asn Gly Leu Ser Ser Ser355 360 365Val Gly Trp Thr Pro Ser Leu His Gly Thr Ile Asp Ala Ser Ala His370 375 380Val Lys Ser Asn Val Ile Ser Gln Ala Gly Ala Gly Lys Leu Asn385 390 39权利要求
1.具有果胶酸裂解酶活性(EC 4.2.2.2)的亲本酶的变体，该变体在选自如下位置编号的一个或多个位置含有改变5，9，11，26，28，30，31，37，40，45，46，47，48，49，50，51，52，54，61，64，68，69，70，71，74，75，76，79，86，87，91，99，105，106，107，111，115，116，118，122，123，134，136，139，140，141，146，148，156，158，170，182，185，186，189，193，194，196，199，201，202，204，213，215，218，224，228，229，234，235，237，251，256，257，258，272，277，286，295，298，301，302，303，305，307，308，314，316，323，324，326，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，349，356，357，363，366，378，381，384，386，387，389，390，391，393，397，其中所述改变独立地为(i)占据该位置的氨基酸下游的氨基酸插入，(ii)占据该位置的氨基酸的缺失，或(iii)占据该位置的氨基酸被不同的氨基酸置换，并且其中每个位置均相应于具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的果胶酸裂解酶的氨基酸序列位置，并且其中亲本酶为SEQ ID NO2所示果胶酸裂解酶或者与SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少65％同一性的果胶酸裂解酶。
2.根据权利要求1的变体果胶酸裂解酶，其中该变体与亲本酶相比具有提高的洗涤剂稳定性。
3.根据权利要求1或2的变体，其中所述改变为置换。
4.根据权利要求1-3任一项的变体，其含有一个或多个选自如下的置换H5R，E9G，N11Y，K26Q，S28T，S30F，S30P，S30T，H31N，N37D，Q40E，L45V，G46D，K47N，K47R，D48E，D48P，T49P，N50D，N50L，N50Y，N51Y，T52M，K54V，T61A，M64F，D68*，N69*，L70*，K71*，K71E，G74D，L75A，L75P，N76D，K79A，D86N，K87A，K87E，A91E，K99I，K99N，K99R，T105A，T105P，L106Q，E107K，A111E，K115A，K115I，K115N，K115Q，N116D，K118A，K118E，M122E，M122K，M122N，M122Q，V123I，S134L，T136S，K139E，K139F，K139I，K139M，K139N，K139S，I140V，V141G，V141E，V141L，V141N，Q146F，Q146H，Q146I，Q146V，K148E，K148Q，N156S，E158N，D170N，Q182D，Q182E，N185H，N186H，N189D，H193Y，I194V，I196V，C199N，C199S，F201L，N202K，G204R，K213E，K213N，K213T，F215Y，K218E，K218L，K218P，G224S，A228I，S229T，Y234H，I235V，M237I，F251I，S256C，K257E，K257N，T258I，L286Y，R272C，R272H，R272Y，V277D，G286A，Y295H，S298N，S301Y，S302A，D303S，A305P，S307R，Y308S，K314N，S316F，N323M，V324A，D326N，S331P，S331T，A332P，A333E，K334E，T335S，T335R，I336S，S337C，S337K，S337L，S337R，V338E，V338Y，F339I，S340A，S340K，S340N，S340P，S340Q，G341S，G349R，Q356H，I357V，N363S，S366N，T378G，T378S，A381D，H384N，K386P，K386R，S387A，V389I，I390N，I390T，S391N，A393V，K397D，并且其中每个位置均相应于具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的果胶酸裂解酶的氨基酸序列位置。
5.根据前面权利要求任一项的变体，其中亲本果胶酸裂解酶具有与SEQ ID NO2的氨基酸序列有至少约70％，优选至少约80％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％，最优选至少约97％同一性的氨基酸序列。
6.根据前面权利要求任一项的变体，其中亲本果胶酸裂解酶由在中度，更优选高度严格条件下与SEQ ID NO1的多核苷酸或其互补链杂交的多核苷酸编码。
7.根据前面权利要求任一项的变体，其中所述改变通过随机或定点诱变或者通过改组一种或多种编码与SEQ ID NO2具有至少65％同一性的果胶酸裂解酶的DNA序列来导入。
8.根据前面权利要求任一项的变体，其中亲本果胶酸裂解酶为野生型果胶酸裂解酶。
9.根据前面权利要求任一项的变体，其中亲本果胶酸裂解酶为芽孢杆菌果胶酸裂解酶。
10.根据前面权利要求任一项的变体，其中亲本果胶酸裂解酶由枯草芽孢杆菌DSM 14218的质粒中存在的多核苷酸编码。
11.根据前面权利要求任一项的变体，其中所述改变的总数为13，优选12，更优选11，甚至更优选10，甚至更优选9，甚至更优选8，甚至更优选7，甚至更优选6，甚至更优选5，甚至更优选4，甚至更优选3，甚至更优选2，最优选1。
12.编码前面权利要求任一项的变体的多核苷酸。
13.含有权利要求12的多核苷酸的表达载体。
14.用权利要求13的表达载体转化的微生物宿主细胞。
15.根据权利要求14的微生物宿主细胞，其中细胞为细菌，优选芽孢杆菌，更优选枯草芽孢杆菌。
16.根据权利要求14的微生物宿主细胞，其中细胞为真菌或酵母，优选丝状真菌，最优选曲霉属真菌。
17.生产根据权利要求1-11任一项的果胶酸裂解酶变体的方法，其中根据权利要求14-16任一项的微生物宿主细胞在利于变体表达和分泌的条件下培养，并且其中变体被回收。
18.提高果胶酸裂解酶的洗涤剂稳定性的方法，该方法包括改变选自以下位置编号的一个或多个位置5，9，11，26，28，30，31，37，40，45，46，47，48，49，50，51，52，54，61，64，68，69，70，71，74，75，76，79，86，87，91，99，105，106，107，111，115，116，118，122，123，134，136，139，140，141，146，148，156，158，170，182，185，186，189，193，194，196，199，201，202，204，213，215，218，224，228，229，234，235，237，251，256，257，258，272，277，286，295，298，301，302，303，305，307，308，314，316，323，324，326，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，349，356，357，363，366，378，381，384，386，387，389，390，391，393，397，其中所述改变独立地为(i)占据该位置的氨基酸下游的氨基酸插入，(ii)占据该位置的氨基酸的缺失，或(iii)占据该位置的氨基酸被不同的氨基酸置换，并且其中每个位置均相应于具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的果胶酸裂解酶的氨基酸序列位置，并且其中所述果胶酸裂解酶与SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少65％同一性。
19.根据权利要求18的方法，其中所述改变为置换。
20.根据权利要求18或19的方法，其包括实施选自如下的一个或多个置换H5R，E9G，N11Y，K26Q，S28T，S30F，S30P，S30T，H31N，N37D，Q40E，L45V，G46D，K47N，K47R，D48E，D48P，T49P，N50D，N50L，N50Y，N51Y，T52M，K54V，T61A，M64F，D68*，N69*，L70*，K71*，K71E，G74D，L75A，L75P，N76D，K79A，D86N，K87A，K87E，A91E，K99I，K99N，K99R，T105A，T105P，L106Q，E107K，A111E，K115A，K115I，K115N，K115Q，N116D，K118A，K118E，M122E，M122K，M122N，M122Q，V123I，S134L，T136S，K139E，K139F，K139I，K139M，K139N，K139S，I140V，V141G，V141E，V141L，V141N，Q146F，Q146H，Q146I，Q146V，K148E，K148Q，N156S，E158N，D170N，Q182D，Q182E，N185H，N186H，N189D，H193Y，I194V，I196V，C199N，C199S，F201L，N202K，G204R，K213E，K213N，K213T，F215Y，K218E，K218L，K218P，G224S，A228I，S229T，Y234H，I235V，M237I，F251I，S256C，K257E，K257N，T258I，L286Y，R272C，R272H，R272Y，V277D，G286A，Y295H，S298N，S301Y，S302A，D303S，A305P，S307R，Y308S，K314N，S316F，N323M，V324A，D326N，S331P，S331T，A332P，A333E，K334E，T335S，T335R，I336S，S337C，S337K，S337L，S337R，V338E，V338Y，F339I，S340A，S340K，S340N，S340P，S340Q，G341S，G349R，Q356H，I357V，N363S，S366N，T378G，T378S，A381D，H384N，K386P，K386R，S387A，V389I，I390N，I390T，S391N，A393V，K397D，其中每个位置均相应于具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的果胶酸裂解酶的氨基酸序列位置。
21.清洁组合物或洗涤剂组合物，优选洗衣或洗盘组合物，其含有如权利要求1-11任一项所定义的变体并且还含有表面活性剂。
22.根据权利要求21的组合物，其还含有纤维素酶、脂肪酶、角质酶、氧化还原酶、蛋白酶、淀粉酶、半纤维素酶，如甘露聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、酯酶、地衣多糖酶、阿拉伯聚糖酶和另一种果胶酸裂解酶或它们的混合物。
23.根据权利要求1-11任一项的变体果胶酸裂解酶在洗涤剂组合物，优选洗衣和/或洗盘洗涤剂中的用途。
24.根据权利要求1-11任一项的变体果胶酸裂解酶在纺织品和纤维素纤维加工中的用途。
25.酶促煮练方法，其包括将细胞壁物质与权利要求1-11任一项中定义的果胶酸裂解酶变体接触。
26.从纺织品酶促除去细胞壁物质的方法，其包括将纺织品与权利要求1-11任一项中定义的果胶酸裂解酶变体接触。
27.具有果胶酸裂解酶活性(EC 4.2.2.2)的亲本酶的变体，其中已经使酶具有更负的总电荷。
28.具有果胶酸裂解酶活性(EC 4.2.2.2)的亲本酶的变体，其中变体中氧化不稳定的氨基酸残基已经被替换。
29.具有果胶酸裂解酶活性(EC 4.2.2.2)的亲本酶的变体，其中变体中更柔性的氨基酸残基已经被较不柔性的氨基酸残基替换。
30.具有果胶酸裂解酶活性(EC 4.2.2.2)的亲本酶的变体，该变体具有提高的钙耗竭稳定性。
全文摘要
本发明涉及果胶酸裂解酶变体，该变体相对于显示出果胶酸裂解酶活性为其主要酶促活性的亲本酶显示出变化；涉及生产这种酶的方法；涉及这种酶在纺织品、洗涤剂和纤维素纤维加工工业中的用途。与亲本酶相比，本发明的果胶酸裂解酶变体可以显示出在洗涤剂中提高的稳定性。
文档编号C12N15/60GK1662650SQ03813805
公开日2005年8月31日 申请日期2003年5月14日 优先权日2002年5月14日
发明者S·S·格拉, C·安德森, T·V·博尔歇特, K·S·约翰森, H·弗里斯纳, M·E·约恩瓦德, T·西斯泰德 申请人:诺和酶股份有限公司