新的磷脂酶及其用途的制作方法

专利名称：新的磷脂酶及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新鉴定的多核苷酸序列，它包含分离自黑曲霉(Aspergillusniger)的新磷脂酶的编码基因。本发明以新基因的全长核苷酸序列、包含新磷脂酶全长编码序列的cDNA序列及功能蛋白质和它的功能等价物的全长氨基酸序列为特征。本发明也涉及这些酶在工业流程中的使用方法和诊断真菌感染的方法。本发明还包括用本发明多核苷酸转化的细胞和经遗传修饰后增加或降低本发明磷脂酶活力和/或表达水平的细胞。
背景技术：
磷脂由甘油骨架组成，该甘油骨架具有两条分别位于外部(sn-1)和中间(sn-2)位置的酯化脂肪酸，而甘油的第三个羟基被磷酸酯化。磷酸可以依次例如与氨基醇酯化，如与乙醇胺酯化形成磷脂酯乙醇胺，与胆碱酯化形成磷脂酰胆碱。除了与磷酸酯化，第三个羟基也可以与糖残基结合，如半乳糖或它的二聚体(如双半乳糖甘油二酯)。
这里定义的磷脂酶是指参与磷脂(包括以上描述的双半乳糖甘油二酯)中的一个或多个键的水解的酶。
一些水解连接脂肪酰部分和甘油骨架之间的酯键的磷脂酶活力类型可以被区分。
o磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)和A2(EC 3.1.1.4)分别催化从二酰甘油磷脂sn-1和sn-2位置脱去脂肪酰基，产生溶血磷脂。
o溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5，也被生物化学与分子生物学国际联合命名委员会命名为磷脂酶B(Enzyme Nomenclature，Academic Press，New York，1992))o催化溶血磷脂中剩余脂肪酰基的水解。已报道的一种来自点青霉(Penicillium notatum)的磷脂酶B(Saito等人，1991，Methods inEnzymology 197446-456)从二酰甘油磷脂上催化两个脂肪酸的脱酰，本质上具有溶血磷脂酶的活力。
o半乳糖脂酶(galactolipase)(EC 3.1.4.3)从双半乳糖甘油二酯上分别催化位于sn-1和sn-2位置的一个或两个脂肪酰基的水解。
磷脂酶C(EC 3.1.4.3)水解甘油骨架和磷酸基之间的磷酸酯键，例如磷脂酰胆碱+H2O＝1，2二酰甘油+磷酸胆碱。
磷脂酶D(EC 3.1.4.4)水解磷酸基和氨基醇之间的磷酸酯键，如磷脂酰胆碱+H2O＝胆碱+磷酸。
磷脂酶可以方便的在微生物中生产。可以从各种资源获得微生物磷脂酶；芽孢杆菌是细菌酶的通常资源，而真菌酶通常产生自曲霉。
已从各种资源中报道了具有磷脂酶活力的真菌酶，包括Cryptococcus neoformans(Chen等人，1997，Infection and Immunity65405-411)，坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)(Fifis等人，1996，Veterinary Microbiology 49219-233)，点青霉(也称为产黄青霉(Penicillium chrysogenum)；Kawasaki，1975，Journal of Biochemistry 771233-1244；Masuda等人，1991，European Journal of Biochemistry 202783-787)，圆弧青霉(Penicillium cyclopium)(Mustranta等人，1995，ProcessBiochemistry 30393-401)，啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae) (Ichimasa等人1985，Agric. Bio1. Chem.491083-1089；Paultauf等人，1994，J.Biol. Chem. 26919725-19730)，戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)(原名罗茜糖酵母(Saccharomyces rosei)，Kuwabara，1988，Agric.Biol.Chem. 522451-2458；Watanabe等人，1994，REMSMicrobiological Letters 12429-34)，粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)(Chakravarti等人，1981，Archives of Biochemistry andBiophysics 206393-402)，黑曲霉(Aspergillus niger)(TechnicalBulletin，G-zymeTMG6999，Enzyme Bio-Systems Ltd.；Mustranta等人，1995，同上)，离心伏革菌(Corticium centrifugum)(Uehara等人，1979，Agric.Biol.Chem.43517-525)，尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)(WO 98/26057)，和茄病镰孢(Fusarium solani)(Tsung-Che等人，1968，Phytopathological Notes 581437-38).
已从若干资源中克隆了真菌磷脂酶基因，包括点青霉(Masuda等人，1991，同上)，戴尔凯氏有孢圆酵母(Wa tanabe等人，1994，FEMSMicrobiology Letters 12429-34)，啤酒糖酵母(Lee等人，1994，Journal of Biological Chemistry 26919725-19730)，曲霉(JP10155493)，粗糙链孢霉(EMBL 042791)，和粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(EMBL 013857)。
磷脂酶在工业中有多种应用，包括修饰磷脂乳化剂。磷脂乳化剂的一个例子是卵磷脂，它是极性和中性脂质的混合物，其中极性脂质含量不低于60％。磷脂乳化剂在食品和非食品中具有多种应用，例如鸡蛋卵磷脂被用作例如奶制品(特别是蛋黄酱、敷料剂、面饼等)的乳化剂，大豆卵磷脂被用作(低热量)沙司、面包、人造黄油、化妆品等的乳化剂，其它卵磷脂被用于例如巧克力、小牛饲料。磷脂酶对磷脂乳化剂的修饰可以增加油/水混合物的乳化。磷脂酶对磷脂乳化剂的修饰增加了乳状液的稳定性，这是通过添加适于更宽或不同pH和/或温度范围的修饰的磷脂乳化剂而实现的。磷脂酶对磷脂乳化剂的修饰可增加乳状液的稳定性，这是通过在Ca2+或Mg2+存在的情况下添加修饰的磷脂乳化剂而实现的。
磷脂酶在工业应用的另一个例子是它可以被用于在加工植物油过程中的对植物油的脱胶。在典型的脱胶过程中，通过用水洗涤油相，植物油(如大豆油、菜子(油菜)油、亚麻子油、向日葵油)中的卵磷脂被除去以增加植物油的稳定性，其中在高剪切力条件下混合油水迫使大量的卵磷脂进入水相，随后再在分离器中被除去。在所谓的水脱胶相中，只有能迅速水合的磷脂才易于被除去，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇和磷脂酰乙醇胺。不可水合的磷脂/phosphatide，多数是磷脂，由50％镁盐和/或钙盐组成，它们不易在水脱胶步骤中被除去。将不可水合的磷脂/phosphatide暴露于磷脂酶A2使这些磷脂更易溶于水，因此易于进入水脱胶相。磷脂酶在工业应用的另一个例子是它们被用于除去在糖化面筋或小麦淀粉(在α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的帮助下)以产生葡萄糖浆的过程中产生的沉淀。沉淀的去除能够有效的加速产生的葡萄糖浆的随后过滤。以上提到的磷脂酶的工业应用只是一些例子，这些列举并不意味着限制。
而磷脂酶在食品工业应用的另一例子是磷脂酶在烘焙应用中对于提高生面团或烘焙产品质量特别有用。小麦面粉含有约2.2-2.9％的脂质。面粉脂质可以被分成淀粉脂质(0.8-0.9％)和非淀粉脂质(1.4-2.0％)。而淀粉脂质主要由极性溶血磷脂组成，非淀粉脂质由约40％的中性甘油三脂和40％的极性磷脂和糖脂组成。为了优化面粉脂质部分，可以通过加入磷脂酶A，原位水解生面团中的磷脂。
例如EP-A-109244和WO 98/26057描述在制作面包中使用磷脂酶A。在捷克斯洛伐克专利AO 190264中磷脂酸(磷脂酶D的水解产物)被用作生面团和面包改进剂。在EP-A-075463中磷脂酶A和D被联合应用以产生作为生面团调节剂的溶血磷脂酸。
WO 00/32758描述了通过改变脂质分解酶(lipolytic enzyme)的氨基酸序列从而产生脂质分解酶变异体，以提高目的活力的水平。发现来自Humicula科或Zygomycete科的脂质分解酶变体在烘焙应用上特别有用，因为它具有磷脂酶和/或双半乳糖甘油二酯活力。WO98/45453描述了一来自塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)的具有脂肪酶活力的多肽也表现出很高的水解双半乳糖甘油二酯的活力。然而这些酶具有较低的活性专一性。
在上述方法中，使用来自重组DNA技术的磷酸酶是有利的。与它们传统纯化的对应物相比，这些酶具有一些优势。重组酶可以低的成本、高的得率生产，并免除了细菌或病毒之类的污染剂，也免除了细菌毒素或其它酶活力污染。
本发明解决了至少一种(如果不是全部的话)上述难题。
本发明目的本发明的一个目的是提供编码具有改进特性的新磷脂酶的新多核苷酸序列。进一步的目的是提供天然和重组产生的磷脂酶，以及产生它们的重组菌株。融合多肽以及制造和使用本发明多核苷酸和多肽的方法也是本发明的一部分。本发明的一特别的目的是提供同时具有半乳糖脂酶活力的磷脂酶。
本发明还有的目的是提供至少解决一项上述提及难题的新磷脂酶，或提供具有一项或多项改进特性的新磷脂酶(如果是用于生面团和/或烘焙产品)，或具有较宽底物特异性的新磷脂酶，其中所述改进的特性选自增加生面团的强度、弹性、稳定性、降低粘性、提高延展性、可加工性、增加烘焙产品的体积、改善烘焙产品的面包心结构、增加烘焙产品的柔软性、改善烘焙产品的滋味、改善烘焙产品的抗陈腐能力、改善烘焙产品的颜色、改善烘焙产品的外皮。
发明概述本发明提供编码新磷脂酶的新多核苷酸序列。更特别的是本发明提供其核苷酸序列与选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的序列杂交的多核苷酸，优选的是在高度严紧的条件下杂交的多核苷酸。因此本发明提供与选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的一条或多条序列同源性高于40％的核酸，如同源性为约60％，优选的为65％，更优选的为70％，甚至为75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在更优选的实施方案中，本发明提供来自丝状真菌的分离的多核苷酸，特别优选的是来自黑曲霉。
在一实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，它含有的核酸序列编码具有选自SEQ ID NO3、6、9、12和15或其功能等价物的氨基酸序列的多肽。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，它至少编码具有选自SEQ ID NO3、6、9、12和15或其功能等价物的氨基酸序列的多肽的一个功能结构域。
在优选的实施方案中，本发明提供具有选自SEQ ID NO1、4、7、10和13的核苷酸序列的磷脂酶基因。在另一方面本发明提供多核苷酸，优选的是编码其氨基酸序列选自SEQ ID NO3、6、9、12和15的黑曲霉磷脂酶或此多肽的变异体或片段的cDNA。在优选的实施方案中该cDNA具有选自SEQ ID NO2、5、8、11和14或其功能等价物的序列。
甚至在进一步优选的实施方案中，本发明提供包含本发明多肽编码序列的多核苷酸，优选的为选自SEQ ID NO2、5、8、11和14的多核苷酸序列。
本发明也涉及含有本发明多核苷酸序列的载体和可以被用来扩增或检测本发明DNA的引物、探针和片段。
在进一步优选的实施方案中，提供载体，其中本发明多核苷酸与适合在合适的宿主细胞(如黑曲霉或米曲霉(A.oryzea))中表达编码的氨基酸序列的调控序列进行了功能性连接。本发明也提供制备本发明多核苷酸和载体的方法。
本发明也涉及重组产生的含有本发明异源或同源多核苷酸的宿主细胞。
在一实施方案中，本发明提供重组宿主细胞，其中本发明磷脂酶的表达被显著增加或磷脂酶的活力被显著提高。
在另一实施方案中本发明提供含有本发明异源或同源多核苷酸的重组产生的宿主细胞，此细胞能产生本发明的功能性磷脂酶，优选的是能过表达本发明磷脂酶的细胞，例如含有增加的拷贝数的本发明基因或cDNA的曲霉菌株。
而本发明的另一方面提供纯化的多肽。本发明的多肽包括由本发明多核苷酸编码的多肽。特别优选的是具有选自SEQ ID NO3、6、9、12和15或其功能等价物的氨基酸序列的多肽。
含有本发明多肽的融合蛋白质也属于本发明的范围。本发明也提供制造本发明多肽的方法。
本发明也涉及本发明磷脂酶在这里所描述的任何工业程序中的使用。
发明详述多核苷酸本发明提供编码磷脂酶的多核苷酸，这些磷脂酶具有选自SEQID NO3、6、9、12和15或其功能等价序列的氨基酸序列。对来自黑曲霉的相应基因组克隆进行测序而确定了分别编码磷脂酶PLP03、PLP06、PLP15、PLP26和PLP34的5个基因。本发明提供包含分别编码PLP03和PLP06和PLP15和PLP26和PLP34磷脂酶的基因的多核苷酸序列以及它们的完整cDNA序列和它们的编码序列。因此，本发明涉及分离的多核苷酸，这些多核苷酸包含选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14或其功能等价物的核苷酸序列。
更特别的是，本发明涉及分离的多核苷酸，此多核苷酸可与包含选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14或其功能等价物的核苷酸序列的多核苷酸在严谨条件下(优选的为在高度严谨条件下)杂交。
有利的是这类多核苷酸可以从丝状真菌(特别是从黑曲霉)中获得。更特别的是，本发明涉及具有选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的核苷酸序列的分离的多核苷酸。
本发明也涉及分离的多核苷酸，该多核苷酸至少编码具有选自SEQID NO3、6、9、12和15或功能等价物的氨基酸序列的多肽的一个功能结构域。
这里使用的术语“基因”和“重组基因”是指可从染色体DNA中分离的、包含编码蛋白质(如黑曲霉磷脂酶)的开放阅读框的核酸分子。基因可能包括编码序列、非编码序列、内含子和调控序列。此外，基因还指如这里所定义的分离的核酸分子。
本发明的核酸分子，如具有选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14或其功能等价物的核苷酸序列的核酸分子，可以使用标准的分子生物学技术和此处提供的序列信息而分离。例如，使用选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的核酸序列的全长或部分作为杂交探针，可以使用标准的杂交和克隆技术(如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.在Molecular CloningA Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989所描述的)分离本发明核酸分子。
此外，使用基于SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14所含的序列信息设计的合成寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应(PCR)可以分离包含选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的核酸序列的全长或部分的核酸分子。
本发明核酸可以通过使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板，适当的寡核苷酸作为引物，按照标准PCR技术进行扩增。如此扩增的核酸可以被克隆到载体，并通过DNA序列分析了解其特征。
此外，可以使用标准的合成技术(如使用自动DNA合成仪)制备相应于本发明核苷酸序列或可与其杂交的寡核苷酸。
在一优选的实施方案中，分离的本发明核酸分子含有表示于SEQID NO2的核苷酸序列。SEQ ID NO2序列相应于提供于SEQ ID NO1的黑曲霉PLP03磷脂酶基因的编码区。这一cDNA包含编码SEQ ID NO3的黑曲霉PLP03多肽的序列。
在第二个优选的实施方案中，分离的本发明核酸分子含有表示于SEQ ID NO5的核苷酸序列。SEQ ID NO5序列相应于提供于SEQ IDNO4的黑曲霉PLP06磷脂酶基因的编码区。这一cDNA包含编码SEQ IDNO6的黑曲霉PLP06多肽的序列。
在第三个优选的实施方案中，分离的本发明核酸分子含有表示于SEQ ID NO8的核苷酸序列。SEQ ID NO8序列相应于提供于SEQ IDNO7的黑曲霉PLP15磷脂酶基因的编码区。这一cDNA包含编码SEQ IDNO9的黑曲霉PLP15多肽的序列。
在第四个优选的实施方案中，分离的本发明核酸分子含有表示于SEQ ID NO11的核苷酸序列。SEQ ID NO11序列相应于提供于SEQID NO10的黑曲霉PLP26磷脂酶基因的编码区。这一cDNA包含编码SEQ ID NO12的黑曲霉PLP26多肽的序列。
在第五个优选的实施方案中，分离的本发明核酸分子含有表示于SEQ ID NO14的核苷酸序列。SEQ ID NO14序列相应于提供于SEQID NO13的黑曲霉PLP34磷脂酶基因的编码区。这一cDNA包含编码SEQ ID NO15的黑曲霉PLP34多肽的序列。
在另一优选的实施方案中，分离的本发明核酸分子包含与选自SEQID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14或它们的功能等价物的核苷酸序列互补的核酸分子。
与另外的核苷酸序列互补的核酸分子是能够与其它核苷酸序列充分互补以至于能与其它核苷酸序列杂交形成稳定的双体的分子。
本发明的一个方面涉及编码本发明多肽或它的功能等价物(如生物活性片段或结构域)的核酸分子，以及足以用作探针以鉴定编码本发明多肽的核酸分子的核酸分子，和适合用作扩增或突变核酸分子的PCR引物的这类核酸分子的片段。
“分离的多核苷酸”或“分离的核酸”是DNA或RNA，它们不与在它们所源自的生物体天然基因组中直接毗邻的两编码序列(一个在5’端，一个在3’端)直接毗邻。因此，在一实施方案中，分离的核酸包括直接毗邻编码序列的部分或全部5’端非编码序列(如启动子)。因此，此术语包括重组DNA，例如整合入载体、自主复制质粒或病毒的重组DNA，或整合入原核或真核基因组DNA的重组DNA，或以独立于其它序列的独立分子(如cDNA或通过PCR或限制性内切核酸酶处理产生的基因组DNA片段)存在的重组DNA。也包括编码完全不含细胞物质、病毒物质、培养基(当通过重组DNA技术生产时)或化学前体或其它化学物品(当化学合成时)的额外多肽的杂合基因之一部分的重组DNA。此外，“分离的核酸片段”并不是作为片段而自然产生并在自然状态下不可能被发现的核酸片段。
这里使用的术语“多核苷酸”或“核酸分子”包括DNA分子(如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如mRNA)和用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链或双链，但是优选的是双链DNA。可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(如肌苷或硫代磷酸核苷酸)合成核酸。这类衍生物可以被用来例如制备具有改变的碱基配对能力的核酸或增加对核酸酶的稳定性。
本发明另一实施方案提供与本发明核酸分子反义的分离的核酸分子。在本发明的范围也包括这里描述的核酸分子的互补链。
测序错误这里提供的序列信息不应该被狭义的理解为需要包含错误鉴定的碱基。这里公开的特定序列易于用来从丝状真菌(特别是黑曲霉)中分离完整基因，该完整基因也容易被进一步进行序列分析，由此鉴定测序错误。
除非另有说明，这里所有通过对DNA分子测序而测定的核苷酸序列都是通过使用DNA序列自动测定仪来测定，这里对所有DNA分子编码的多肽氨基酸序列的确定都是通过对如上测定的DNA序列的翻译来预测。因此，如本领域已知的关于任何由这种自动方法测定的DNA序列，这里所测定的任何核苷酸序列可能含有一定的错误。通过自动测定的核酸序列与所测序DNA分子的真实核苷酸序列一般至少具有90％的一致性，更一般的则至少具有约95％到99％的一致性。通过包括本领域熟知的手工DNA测序法在内的其它方法可以更精确的测定真实的序列。也如本领域所知，测定的核苷酸序列相对于真实序列的一个插入或缺失会导致核苷酸序列的翻译框架移位，以至于预测的被所测定核苷酸序列编码的氨基酸序列从此插入或缺失的点开始完全不同于由被测序DNA分子事实上所编码的氨基酸序列。
本领域的技术人员能够鉴定这类错误测定的碱基，并知道如何纠正这类错误。
核酸片段、探针和引物本发明核酸分子可能包含选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的核酸序列的部分或片段，如可能被用作引物或探针的片段或编码部分本发明蛋白质的片段。从磷脂酶基因和cDNA克隆测定的核苷酸序列允许产生设计用来鉴定和/或克隆其它磷脂酶家族成员以及其它物种的磷脂酶同源物的探针和引物。典型的探针/引物包含基本纯化的寡核苷酸，通常这种寡核苷酸含有能与选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14或其功能等价物的核苷酸序列中至少约12或15个连续的核苷酸杂交(优选为在严谨条件下杂交)的核苷酸序列，优选的与约18或20，优选的约22或25，更优选的约30、35、40、45、50、55、60、65或75或更多的连续核苷酸杂交。
基于这里所提供的核苷酸序列的探针可以被用来检测转录物(多数为mRNA)或编码相同或同源蛋白质的基因组序列，例如在其它生物中。在优选的实施方案中，探针进一步包含附于其上的标记基团，如标记基团可能是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。这类探针也可以被用作鉴定表达磷脂酶的细胞的诊断试剂盒的一部分。
一致性&同源性术语“同源性”或“一致性百分数”在这里可互换使用。为了本发明的目的，这里定义为了确定两氨基酸序列或两核酸序列的一致性百分数，序列以最有利于比较的目的被排列(如可以在第一条氨基酸或核酸序列中引入缺口以达到与另一条氨基酸或核酸序列的最佳比对)。由此比较位于相应氨基酸位点或核苷酸位点的氨基酸残基或核苷酸。当第一条序列的位点与第二条序列的相应位点被同样的氨基酸残基或核苷酸所占据，那么两分子在这一位置具有一致性。两序列的一致性百分数是该序列所共有的一致性位点数目的函数(即％一致性＝一致性位点数/位点总数(即相重叠的位点)×100)。优选的是，两序列具有相同的长度。
技术人员知道一些不同的计算机程序可以被用来测定两序列的同源性。例如，使用数学算法可以完成两序列的序列比较和一致性百分数测定。在一优选的实施方案中，使用在GCG软件包(可从http//www.gcg.com获得)中已被整合进GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)444-453(1970))算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的缺口加权和1、2、3、4、5或6的长度加权测定两氨基酸序列的一致性百分数。技术人员将领略到当使用不同的算法时，所有这些不同的参数将产生轻微不同的结果，但是两序列的整体一致性百分数不会有显著改变。
而在另一实施方案中，使用GCG软件包(可从http//WWW.gcg.com获得)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口加权和1、2、3、4、5或6的长度加权测定两核苷酸序列的一致性百分数。在另一实施方案中，使用被整合到ALIGN程序(2.0版)(可从http//Vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi获得)的E.Meyers和W.Miller算法(CABlOS，411-17(1989)，并使用PAM120加权残基表，12的缺口长度罚分和4的缺口罚分测定两氨基酸或核苷酸序列的一致性百分数。
本发明的核酸和蛋白质序列可以被进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜寻，例如鉴定其它家族的成员或相关序列。可使用Altschul等人(1990) (J.Mol.Biol. 215403-10)的BLASTN和BLASTX程序完成这些搜寻。可使用BLASTN程序，分数＝100、字长＝12完成BLAST核苷酸搜寻，以获得与本发明PLP03核酸分子同源的核苷酸序列。可使用BLASTX程序，分数＝50，字长＝3完成BLAST蛋白质搜寻，以获得与本发明PLP03蛋白质分子同源的氨基酸序列。可使用如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402描述的带缺口BLAST，以获得为了比较目的的缺口比对。当使用BLAST和带缺口BLAST程序时，可使用各自程序(如BLASTX和BLASTN)的默认参数。见http//WWW.ncbi.nim.nih.gov.
杂交如这里所使用的，术语“杂交”倾向于描述彼此至少具有约50％、至少约60％、至少约70％，更优选的是至少约80％，甚至更优选的是至少约85-90％，更优选的是至少95％同源性的核酸序列保持彼此杂交的杂交和洗涤条件。
这种杂交条件的一个优选的非限制性的例子是于约45℃在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后于50℃、优选的为55℃、60℃，甚至更优选的为65℃，在1x SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。
高度严谨条件包括，例如在68℃、5x SSC/5x Denhardt′s溶液/1.0％SDS中杂交，并于室温下在0.2x SSC/0.1％SDS中洗涤。可另选的是，可以在42℃完成洗涤。
技术人员知道使用哪种条件作为严谨条件和高度严谨条件。本领域易于获得关于这些条件的附加指导，例如Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress，N.Y.；和Ausubel等人(eds.)，1995，Current Protocols inMolecular Biology，(John Wiley & Sons，N.Y.)。
当然，仅与多聚腺苷酸序列(如mRNA的3’端多聚腺苷酸片段)或T(或U)残基的互补片段杂交的多核苷酸，将不会被包含在用于与本发明核酸的一部分进行特异杂交的本发明多核苷酸中，因为这种多核苷酸将与含有多聚腺苷酸片段或它的互补序列的任何核酸分子(如事实上任何的双链cDNA克隆)杂交。
从其它生物体中获得全长DNA分子在一典型的方法中，可以筛选构建自其它生物的cDNA文库，如丝状真菌，特别是曲霉菌。
例如可以通过Northern印迹分析筛选曲霉菌株的同源多核苷酸。基于对本发明多核苷酸的同源转录物的检测，可以利用本领域技术人员所熟知的标准技术，以适当菌株中分离的RNA构建cDNA文库。可另选的是，使用与本发明多核苷酸杂交的探针筛选总基因组DNA文库。
如通过使用基于这里提供的核苷酸序列所设计的两个简并寡核苷酸引物工具来进行PCR，可以分离同源基因。
反应的模板可以是对已知或怀疑表达本发明多核苷酸的菌株中制备的mRNA进行逆转录所得的cDNA。PCR产物可以被亚克隆并被测序，以确保扩增序列代表新的PLP03核酸序列，或它的功能等价物。
然后，PCR片段可以通过各种已知的方法被用来分离全长cDNA克隆。例如，扩增的片段可以被标记并用来筛选噬菌体或粘粒cDNA文库。另选的是，标记的片段可以被用来筛选基因组文库。
PCR技术也可以被用来从其它生物体中分离全长cDNA序列。例如，按照标准操作可以从适当的细胞或组织资源中分离RNA。使用专一于多数扩增片段的5’端的寡核苷酸引物，完成RNA的逆转录反应以引导第一条链合成。
产生的RNA/DNA杂合体可以通过标准末端转移酶反应被加上“尾”(如使用鸟嘌呤)，可使RNaseH消化杂合体，并随后引导第二条链的合成(如使用多聚胞嘧啶引物)。因此扩增片段上游的cDNA序列可以容易的被分离。对于有用的克隆战略，见例如Sambrook等人(前述)和Ausubel等人(前述)。
载体本发明的另一方面涉及载体，优选的为表达载体，其包含编码本发明蛋白质或它的功能等价物的核酸。如这里所使用的，术语“载体”指能够运送已与之连接的其它核酸的核酸分子。一种载体是“质粒”，它指能够连接进额外DNA片段的环状双链DNA环。另一种载体是病毒载体，其中额外的DNA片段能够被连接进病毒基因组。一些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(如具有细菌复制起点的细菌载体和游离的哺乳动物载体)。其它载体(如非游离哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组上，因此随宿主基因组复制。此外，有些载体能指导与它们有效连接的基因的表达。这里涉及的这类载体称为“表达载体”。通常，在重组DNA技术中使用的表达载体常常是质粒的形式。因为质粒是最常使用的载体形式，因此这里使用的术语“质粒”和“载体”可以被互换使用。然而本发明趋向包括其它形式的具有相同功能的表达载体，如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
本发明重组表达载体含有以适合在宿主细胞中表达核酸的形式存在的本发明核酸，这意味着重组表达载体含有一种或多种基于用来表达的宿主细胞而选择的调控序列，它们与要被表达的核酸序列有效的连接起来。在重组表达载体中“有效的连接”趋向于指目的序列以允许核苷酸序列被表达的方式与调控序列相连接(如在体外的转录/翻译系统中或当载体被引入宿主细胞后的宿主细胞中)。术语“调控序列”倾向于包括启动子、增强子和其它表达控制元件(如多聚腺苷酸信号)。这类调控序列的描述见例如Goeddel；Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)。调控序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成性或可诱导表达的序列，以及只在特定的宿主细胞中指导核苷酸序列表达的序列(如组织专一性调节序列)。本领域的技术人员将领略到表达载体的设计依赖于被转化的宿主细胞的选择、所需的目的蛋白质的表达等之类的因素。本发明表达载体可以被引入宿主细胞，由此产生由这里描述的核酸编码的蛋白质或多肽(如磷脂酶、突变磷脂酶、它们的片段、它们的变异体或功能等价物、融合蛋白质等等)。
本发明重组表达载体可以被设计来在原核或真核细胞中表达磷脂酶。例如，本发明蛋白质可以在细菌(如大肠杆菌和芽孢杆菌)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳细胞中被表达。在Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中进一步讨论了合适的宿主细胞。另选的是，可在体外转录和翻译重组表达载体，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
对本发明有用的表达载体包括染色体载体、游离载体和病毒来源的载体，如来自细菌质粒、噬菌体、酵母游离基因、酵母染色体元件、病毒如杆状病毒、乳突病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒的载体，以及来自其组合的载体，例如来自质粒和噬菌体基因元件的载体(如粘粒和噬粒)。
插入的DNA应该与适当的启动子有效连接，例如lambda噬菌体PL启动子、大肠杆菌lac、trp和tac启动子，SV40早期和晚期启动子和LTRs逆转录病毒启动子等等。本领域技术人员知道其它合适的启动子。在一特定的实施方案中，优选的启动子能够在丝状真菌中指导磷脂酶的高水平表达。在本领域中已知这类启动子。表达构件体可以含有转录起始点、终止点，并在转录区具有用于翻译的核糖体结合位点。构件体表达的成熟转录物的编码部分将包括开始的转录起始点AUG和位于将被翻译的多肽末端恰当位置的终止密码子。
载体DNA可以通过传统的转化或转染技术被引入原核或真核细胞。如这里所使用的术语“转化”和“转染”用于指各种将外源核酸(如DNA)导入宿主细胞的本领域已知技术，包括磷酸钙和氯化钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖-介导的转染、转导、感染、脂质转染、阳离子脂质介导的转染或电穿孔。适当的转化或转染宿主细胞的方法可见Sambrook等人(Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd，ed. ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spr ing Harbor，NY，1989)，Davis等人，Basic Methods inMolecular Biology(1986)和其它实验室手册。
已知对于哺乳细胞的稳定转染，只有小部分的细胞可以将外源DNA整合到它们的基因组(依赖于使用的表达载体和转染技术)。为了鉴定和筛选这些整合体，编码选择性标记(如抗生素抗性)的基因通常与目的基因被一起引入宿主细胞。优选的选择性标记包括赋于抗药性的那些，如G418、潮霉素、methatrexate。优选的，被引入宿主细胞的编码选择性标记的核酸与编码本发明蛋白质的核酸位于同一载体，或者可以在一独立的载体上被引入。被引入的核酸稳定转染的细胞可以通过药物筛选来鉴定(如已经整合入选择性标记基因的细胞将存活，而其它细胞将死亡)。
蛋白质在原核细胞中的表达常常在大肠杆菌中进行，利用含有组成性或可诱导启动子的载体指导融合或非融合蛋白质的表达。融合载体对所携带编码的蛋白质(如重组蛋白质的氨基末端)增加若干氨基酸。这类融合载体主要服务于三个目的1)增加重组蛋白质的表达；2)增加重组蛋白质的可溶性；3)通过作为亲和纯化中的配体帮助纯化重组蛋白质。在融合表达载体中，通常在融合部分与重组蛋白质的连接处引入蛋白水解切割位点，使纯化融合蛋白之后重组蛋白质与融合蛋白质能够分离。这些酶(以及它们的相关识别位点)包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。
如所指出的，优选的表达载体含有选择性标记。这类标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性和用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素或氨苄青霉素抗性。适当宿主的代表性例子包括细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾Sf9；动物细胞，如CHO、COS和Bowes黑色素瘤；及植物细胞。本领域已知上述宿主细胞的适当培养基和培养条件。
优选的用于细菌的载体有pQE70、pQE60和PQE-9(可从Qiagen获得)；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A(可从Stratagene获得)；和ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(可从Pharmacia获得)。优选的用于真核细胞的载体有PWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pZTl和pSG(可从Stratagene获得)；和pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(可从Pha rmacia获得)。对于技术入员而言获知其它合适的载体是很容易的。
已知的用于本发明的细菌启动子包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、lambda PR、PL启动子和trp启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTRs启动子，如Rous肉瘤病毒(″RSV″)启动子和金属硫蛋白启动子(如小鼠金属硫蛋白-1启动子)。
向载体中插入增强子序列可以通过更高级的真核细胞增加编码本发明多肽的DNA的转录。增强子是DNA顺式作用元件，通常从约10到300bp，作用是在一既定的宿主细胞类型中增加启动子的转录活性。增强子的例子包括定位于复制起始点后侧100至700bp的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起始点后侧的多形瘤增强子和腺病毒增强子。
为了翻译的蛋白质能够分泌到内质网腔、壁膜间隙或胞外环境，适当的分泌信号可以被引入表达的多肽。此信号对于多肽而言可以是内源的也可以是异源的。
多肽可以以修饰的形式(如融合蛋白质)被表达，也可以既包含分泌信号也包含额外的异源功能区域。因此，例如，附加的氨基酸区域(特别是带电荷的氨基酸)可以被加入到多肽的N末端，以便在纯化或随后的操作和储存中提高多肽在宿主细胞中的稳定性并延长持续时间。也可以向多肽增加肽部分以利于纯化。
本发明多肽本发明提供分离的多肽，该多肽具有选自SEQ ID NO3、6、9、12和15的氨基酸序列或通过选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的多核苷酸序列在适当的宿主中表达而获得的氨基酸序列。含有上述多肽的功能等价物的肽或多肽也包含于本发明。上述多肽都包含于术语“本发明多肽”。
术语“肽”和“寡肽”被认为是同义的(如通常所认为的)，两术语可以按上下文的需要互换使用，表示至少含有两个以肽键连接的氨基酸的链。这里使用的词“多肽”代表含有超过7个氨基酸残基的链。这里所有的寡肽和多肽分子式或序列都是从左到右以氨基端到羧基端的方向书写。这里使用的单字母氨基酸代码是本领域所共知的，并可见于Sambrook等人(Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd，ed. Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
“分离的”多肽或蛋白质是指从其天然环境中分离的多肽或蛋白质。例如，为本发明目的，重组产生的多肽和在宿主细胞中表达的蛋白质被认为是分离的，正如已经通过任何适合的技术(如Smith和Johnson公布的一步纯化法，Gene 6731-40(1988))基本纯化的天然或重组多肽。
本发明磷脂酶可以通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收并纯化，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最优选的是使用高效液相色谱(“HPLC”)进行纯化。
本发明多肽包括天然纯化的产物、化学合成产物和通过重组技术从原核或真核宿主(包括如细菌、酵母、真菌、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)产生的产物。依赖于在重组生产方法中所使用的宿主，本发明的多肽可能被糖基化或非糖基化。另外，本发明多肽有可能包括修饰的起始甲硫氨酸残基，在一些情况下是宿主介导过程的结果。
蛋白质片段本发明也以本发明多肽的生物活性片段为特征。
本发明多肽的生物活性片段包括含有与磷脂酶氨基酸序列(如选自SEQ ID NO3、6、9、12和15的氨基酸序列)足够一致性或来自磷脂酶氨基酸序列的氨基酸序列，它们含有比全长蛋白质更少的氨基酸，并至少表现出一种相应全长蛋白质的生物活性。通常生物活性片段含有至少具有相应全长蛋白质一种活性的结构域或基序。本发明蛋白质生物活性片段可能是在长度上具有如10、25、50、100或更多氨基酸的多肽。此外，可以通过重组技术制备其它的生物活性部分(其中蛋白质的其它区域被缺失了)，并评估本发明多肽天然形式的一种或多种生物活力。
本发明也以编码上述磷脂酶生物活性片段的核酸片段为特征。
融合蛋白质本发明蛋白质或其功能等价物(如其生物活性部分)可与非磷脂酶多肽(如异源氨基酸序列)有效连接，以形成融合蛋白。如这里所使用的，磷脂酶“嵌合蛋白质”或“融合蛋白质”含有与非磷脂酶多肽有效连接的磷脂酶多肽。
在一优选的实施方案中，融合蛋白至少包含一个本发明磷脂酶生物活性片段。在另一优选的实施方案中，融合蛋白至少包含两个本发明磷脂酶生物活性部分。在融合蛋白质中，术语“有效的连接”指磷脂酶和非磷脂酶多肽按读码框于磷脂酶的N端或C端彼此融合在一起。
例如，在一实施方案中，融合蛋白质为GST-磷脂酶融合蛋白质，其中磷脂酶序列融合到GST序列的C端。这类融合蛋白质便于重组磷脂酶的纯化。在另一实施方案中，融合蛋白质是在N端含有异源信号序列的磷脂酶蛋白质。在一定的宿主细胞(如哺乳动物和酵母宿主细胞)中，可以通过使用异源信号序列增加磷脂酶的表达和/或分泌。
在另一例子中，杆状病毒包膜蛋白质的gp67分泌序列可以被用作异源信号序列(Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人，eds.，John Wiley & Sons，1992)。其它真核异源信号序列的例子包括蜂毒素和人胎盘碱性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；LaJolla，California)。而在另一例子中，有用的原核异源信号序列包括phoA分泌信号(Sambrook等人，前述)和蛋白质A分泌信号(Pharmacia Biotech；Piscataway，New Jersey)。
信号序列可以被用来为本发明多肽或蛋白质的分泌和分离提供方便。信号序列一般的特征是具有疏水氨基酸核心，并通常在分泌过程中通过一次或多次切割事件从成熟蛋白质中切除。这类信号肽含有经过分泌途径时允许将信号肽从成熟蛋白质中切除的加工位点。信号序列指导蛋白质的分泌，如从表达载体所转化的真核宿主中分泌，信号序列随后或同时被切除。通过本领域所知的方法可以容易的从胞外基质中纯化蛋白质。可另选的是，可使用利于纯化的序列(如GST结构域)连接信号序列和目的蛋白质。因此，例如，编码多肽的序列可以融合标记序列，如编码利于此融合多肽纯化的肽的序列。在本发明这一方面的某些优选的实施方案中，标记序列是六个组氨酸的肽，如pQE载体(Qiagen，Inc.)中提供的标签，许多是商业可获得的。如Gentz等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86821-824(1989)的描述，例如为了便于纯化融合蛋白质提供了六-组氨酸。例如，HA标签是另一种用于纯化的肽，它相应于已被Wilson等人(Cell 37767(1984))描述的来自流感血凝素蛋白质的表位。
优选的是，通过重组DNA技术产生本发明嵌合或融合蛋白质。例如，使用传统技术按读码框将编码不同多肽序列的DNA片段连接起来，例如使用平末端或粘末端连接，限制性酶消化提供适当的末端，适当地填充粘性末端，用碱性磷酸酶处理避免不必要的连接，以及进行酶连接。在另一实施方案中，可通过包括自动DNA合成仪在内的传统技术合成融合基因。另选的是，可使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，锚定引物产生两连续的基因片段之间互补的突出端，使它们随后可以被退火，并通过再扩增产生嵌合基因序列(见，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology，eds.Ausubel等人，John Wiley& Sons1992)。此外，许多可商业获得的表达载体已经编码了融合部分(如GST多肽)。本发明的核酸可以被克隆到这类表达载体，以便两融合部分按读码框连接，以表达含有本发明蛋白质的融合蛋白质。
功能等价物术语“功能等价物”和“功能变异体”在这里被互换使用。编码磷脂酶DNA的功能等价物是编码表现出这里所定义的黑曲霉磷脂酶特定功能的多肽的分离DNA片段。本发明磷脂酶多肽的功能等价物是表现出至少一种这里所定义的黑曲霉磷脂酶功能的多肽。功能等价物因此也包括生物活性片段。
蛋白质或多肽功能等价物可能只是在选自SEQ ID NO3、6、9、12和15的氨基酸序列中含有一个或多个保守性氨基酸取代，或取代、插入或缺失非必需的氨基酸。因此，非必需氨基酸是在选自SEQ ID NO3、6、9、12和15的氨基酸序列中能够被更改而又不实质性改变生物功能的残基。例如，预测在本发明磷脂酶蛋白质中的保守氨基酸残基特别不适合被更改。此外，在本发明磷脂酶蛋白质和其它磷脂酶中保守的氨基酸也不适合更改。
术语“保守性取代”指用具有相似氨基酸侧链的残基替换氨基酸残基的取代。这些家族在本领域是已知的，包括具有碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(如天门冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支的侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
功能核酸等价物一般含有沉默突变或并不改变编码多肽生物功能的突变。因此，本发明提供编码含有改变氨基酸残基的磷脂酶的核酸分子，其中发生改变的氨基酸残基对于特定生物活性是非必需的。这类蛋白质不同于选自SEQ ID NO3、6、9、12和15的氨基酸序列，但是它们保留了至少一种生物活性。在一实施方案中，分离的核酸分子含有编码蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质含有与选自SEQ IDNO3、6、9、12和15的氨基酸序列至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性或更高同源性的氨基酸序列。
例如，Bowie，J.U.等人Science 2471306-1310(1990)提供了关于如何制备表型沉默氨基酸取代的指导，其中作者表明有两种研究氨基酸序列容忍改变的主要方法。第一种方法依赖于进化的过程，其中通过自然选择来接受或拒绝突变。第二种方法使用遗传工程在克隆基因的特定位点引入氨基酸变化，通过选择或筛选来鉴定保持功能的序列。如作者所陈述的，蛋白质对于氨基酸取代具有惊人的耐受性。作者进一步指出了在蛋白质的某一位置可能允许哪些改变。例如，许多隐藏的氨基酸需要非极性侧链，而通常表面侧链很少有保守的特征。其它这类表型沉默的取代被描述于Bowie等人(前述)和这里引用的参考。
通过分别向选自SEQ ID NO1和2、4和5、7和8、10和11、13和14的核苷酸编码序列引入一个或多个核苷酸取代、加入或缺失，以至于向被编码的蛋白质引入一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，从而可以创造编码与选自SEQ ID NO3、6、9、12和15的蛋白质同源的蛋白质的分离核酸分子。这类突变可以通过如定点诱变或PCR介导的诱变之类的标准技术被引入。
术语“功能等价物”也包括这里提供的黑曲霉磷脂酶的直向同源物。黑曲霉磷脂酶直向同源物是能够从其它菌株或物种中分离的蛋白质，并与黑曲霉磷脂酶具有相似或一致的生物活性。这类直向同源物由于含有与选自SEQ ID NO3、6、9、12和15的氨基酸序列基本同源的氨基酸序列而易于被鉴定。
如这里所定义的，术语“基本上同源”指第一条氨基酸或核苷酸序列含有相对于第二条氨基酸或核苷酸序列足够或最少数量的一致或等价的(如具有相似的侧链)氨基酸或核苷酸，以至第一和第二条氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构域。例如，含有某一共同结构域的氨基酸或核苷酸序列在此处被定义为具有足够的一致性，其中所述共同结构域具有约60％，优选的为65％，更优选的为70％，甚至更优选的为75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的一致性。
编码其它磷脂酶家族成员，因而具有不同于选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的核苷酸序列的核酸也属于本发明的范围。此外，编码不同物种磷脂酶蛋白质，因而具有不同于选自SEQ IDNO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的核苷酸序列的核酸也属于本发明的范围。基于与这里所公开的核酸的同源性，使用这里所公开的cDNA或它们的合适片段作为杂交探针，按照标准杂交技术(优选的是在高度严谨的杂交条件下)能够分离相应于本发明DNA的变异体(如天然等位基因变异体)和同源物的核酸分子。
除了这里提供的黑曲霉序列的天然发生的等位基因变异体外，技术人员知道可以通过突变选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的核苷酸序列来引入改变，从而导致不基本改变蛋白质功能的磷脂酶蛋白质氨基酸序列的改变。
在本发明的另一方面提供改进的磷脂酶。改进的磷脂酶是至少改进了一种生物活性的蛋白质。这类蛋白质可以通过向整个或部分编码序列随机引入突变获得(如饱和诱变)，产生的突变体可以重组表达，并筛选生物活性。例如，本领域提供测量磷脂酶酶活力的标准方法，因此改进的蛋白质可以容易的被挑选。
在优选的实施方案中，磷脂酶具有选自SEQ ID NO3、6、9、12和15的氨基酸序列。在另一实施方案中，磷脂酶与选自SEQ ID NO3、6、9、12和15的氨基酸序列基本同源，并至少保持了一种分别选自SEQ ID NO3、6、9、12和15的磷脂酶的生物活力，但由于天然的变异或以上描述的诱变而在氨基酸序列上不同。
在进一步优选的实施方案中，磷脂酶具有能与选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的核苷酸序列杂交(优选的是在高度严谨的杂交条件下)的分离的核酸片段所编码的氨基酸序列。因此，磷脂酶是含有与选自SEQ ID NO3、6、9、12和15的氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列的蛋白质。
特别是，磷脂酶是含有与SEQ ID NO3表示的氨基酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列的蛋白质，或是含有与SEQID NO6表示的氨基酸序列具有至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列的蛋白质，或是含有与SEQ ID NO9表示的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列的蛋白质，或是含有与SEQ ID NO12表示的氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列的蛋白质，或是含有与SEQ ID NO15表示的氨基酸序列具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的氨基酸序列的蛋白质。
本发明蛋白质的功能等价物也可以通过如从本发明蛋白质突变体(如截短突变体)组合文库中筛选具有磷脂酶活力的突变体而被鉴定。在一实施方案中，通过在核酸水平的组合诱变产生变异体的多样化文库。变异体的多样化文库可如下生成，例如，用酶将合成的寡核苷酸混合物连接成基因序列以便一套简并的潜在的蛋白质序列作为单个多肽或作为一套更大的融合蛋白质(如用噬菌体展示)被表达。有各种方法可以被用来从简并寡核苷酸序列中产生本发明多肽潜在变异体文库。本领域已知合成简并寡核苷酸的方法(例如，见Narang(1983)Tetrahedron 393；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等人(1984)Science 1981056；lke等人(1983)NucleicAcid Res. 11477)。
另外，本发明多肽编码序列的片段文库可以被用来产生多肽多样群体，用于随后的变异体筛选。例如，可以通过在仅对每一分子造成一次切割的条件下使用核酸酶处理目的编码序列的双链PCR片段，变性双链DNA，复性DNA形成双链(此双链DNA可能包括来自不同切割产物的正义/反义配对)，使用S1核酸酶处理重新形成的双倍体，以除去单链部分，并将产生的片段文库连接到表达载体中，由此产生编码序列的片段文库。通过这种方法，可以获得编码目的蛋白质N端和各种长度的内部片段的表达文库。
本领域已知一些由点突变或截短制备的组合文库的基因产物的筛选方法，以及从cDNA文库中筛选具有所选特性的基因产物的方法。最广泛使用的能够承受高通量分析的筛选大基因文库的技术通常包括将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所产生的载体文库转化合适的细胞，在所需活力的检测便于编码基因(其产物被检测)的载体被分离的条件下表达组合基因。Recursive ensemble mutagenesis(REM)是一种在文库中增加功能突变体频率的技术，它可以结合筛选分析被用来鉴定本发明蛋白质的突变体(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897811-7815；Delgrave等人(1993)ProteinEngineering 6(3)327-331)。
对于本领域技术人员而言，在既定的群体中可能存在导致磷脂酶氨基酸序列改变的DNA序列多态性是显而易见的。这类遗传多态性可存在于来自不同种群的细胞或天然等位基因变异的种群。等位基因变异体也可能包括功能等价物。
本发明多核苷酸的片段也可能包含不编码功能多肽的多核苷酸。这类多核苷酸可能具有作为探针或PCR反应引物的功能。
本发明核酸可以被用作杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)引物(不管它们编码功能或非功能多肽)。不编码具有磷脂酶活力多肽的本发明核酸分子的用途包括(除了其它)(1)从cDNA文库(如从黑曲霉以外的其它生物)中分离编码本发明磷脂酶的基因或它的等位基因变异体，(2)如Verma等人在Human Chromosomesa Manual of BasicTechniques，Pergamon Press，New York(1988)中描述的，与中期染色体原位杂交，以提供PLP03基因的精确染色体位置；(3)Northern印迹分析以在特定组织和/或细胞中检测磷脂酶mRNA表达以及4)作为探针和引物，可以被用作在给定的生物(如组织)样品中分析可与磷脂酶探针杂交的核酸存在的诊断工具。
本发明也包括编码磷脂酶的基因或cDNA的功能等价物的获得方法。此方法需要有一标记的探针，该探针包括编码选自SEQ ID NO3、6、9、12和15序列或它们的变异体的全长或部分的分离核酸；在允许探针与文库中核酸片段杂交的条件下用标记的探针筛选核酸片段文库，由此形成核酸二倍体，从任何标记的二倍体核酸片段中制备全长基因序列，以获得与磷脂酶基因有关的基因。
在一实施方案中，本发明的核酸与选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的序列或它们的互补序列具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在另一优选实施方案中，本发明多肽与选自SEQ ID NO3、6、9、12和15的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
宿主细胞在另一实施方案中，本发明以细胞为特征，如含有本发明包括的核酸的转化宿主细胞或重组宿主细胞。“转化细胞”或“重组细胞”是通过重组DNA技术已引入本发明核酸的细胞(或这种细胞的后代)。包括原核和真核细胞，如细菌、真菌、酵母等等，特别优选的细胞是丝状真菌，尤其是黑曲霉。
调节插入序列的表达或以专门的、需要的方式修饰和加工基因产物的宿主细胞可以被选择。这种蛋白质产品的修饰(如糖基化)和加工(如切割)可以便于蛋白质功能的最优化。
各种宿主细胞具有特有和专门的翻译后加工和修饰蛋白质和基因产物的机制。可以选择分子生物学和/或微生物学领域的技术人员所熟悉的适当的细胞系或宿主系统，以确保表达的外源蛋白质按目的进行正确的修饰和加工。为此，可以选择具有适当加工原初转录物、具有基因产物糖基化和磷酸化的细胞机制的真核细胞。这类宿主细胞在本领域是众所周知的。
宿主细胞也包括(但不限于)哺乳动物细胞系(如CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38)和脉络丛细胞系。
如果需要的话，可以通过稳定转染的细胞系生产本发明多肽。公众可以获得一些适合稳定转染哺乳动物细胞系的载体，构建这类细胞系的方法也已公诸于众，如Ausubel等人的描述(前述)。
抗体本发明进一步以抗体为特征，如与本发明磷脂酶特异结合的单克隆或多克隆抗体。
如这里所使用的术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)意欲包括完整的分子和能够与PLP03蛋白质特异结合的抗体片段(如Fab和F(ab′)2片段)。Fab和F(ab′)2片段缺乏完整抗体的Fc片段，在循环中被更快的清除，并且可能具有比完整抗体更低的非组织专一性结合(Wahl等人J.Nucl.Med.24316-325(1983))。因此，这些片段是优选的。
可以通过任何各种方法制备本发明抗体。例如，可以向动物注射表达磷脂酶或它的抗原片段的细胞，以诱导产生含有多克隆抗体的血清。在优选的方法中，制备并纯化了基本不含天然污染物的磷脂酶制品。这一制品被引入动物以产生具有更高专一性活力的多克隆抗血清。
在最优选的方法中，本发明抗体是单克隆抗体(或其结合磷脂酶的片段)。可以使用杂交瘤技术制备这类单克隆抗体(Kohler等人，Nature 256495(1975)；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511(1976)；Hammerling等人，InMonoclonal Antibodies and T-CellHybridomas，Elsevier，N.Y.，pp.563-681(1981))。总体而言，这类方法涉及用本发明蛋白质或表达本发明蛋白质的细胞免疫动物(优选的为小鼠)。提取被免疫小鼠的脾细胞并与适当的骨髓瘤细胞系融合。根据本发明，任何合适的骨髓瘤细胞系都可以被使用；优选的是亲本骨髓瘤细胞系(SP2O)，可从American Type Culture Collection，Rockville，Maryland获得。融合之后，产生的杂交瘤细胞被选择性的保持在HAT培养基中，并如Wands等人(Gastro-enterology 80225-232(1981))所描述的，通过有限稀释来克隆。然后分析通过这种选择而获得的杂交瘤细胞，以鉴定能够分泌与PLP03蛋白质抗原结合的抗体的克隆。通常，多肽可以与Ausubel等人描述的(前述)KLH之类的载体蛋白质耦联，并与佐剂混合，注射入宿主哺乳动物。
特别是，通过注射目的多肽可以免疫各种宿主动物。合适的宿主动物的例子包括兔子、小鼠、荷兰猪和大鼠。依赖于宿主的种类，可以使用各种佐剂来增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物胶佐剂(如氢氧化铝)、表面活性物质(如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳化物、钥孔血蓝蛋白、二硝基酚、BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。多克隆抗体是来自被免疫动物血清的抗体分子杂合群体。
这种抗体可以是包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD在内的各种免疫球蛋白类别和它们的任何亚类。产生本发明mAbs的杂交瘤可以在体内或体外培养。
多克隆或单克隆抗体一旦被产生，则在免疫分析(如使用标准技术的Western印迹或免疫沉淀分析，如Ausubel等人的描述，前述)中测试其对本发明蛋白质或其功能等价物的专一性识别。与本发明蛋白质或其功能等价物专一性结合的抗体在本发明是有用的。例如，这类抗体可以被用于免疫分析，以检测病原或非病原曲霉菌株中(如曲霉提取物中)的本发明蛋白质。
优选地，使用可能具有抗原性的本发明蛋白质片段(通过如高频率的电荷残基之类的标准)生产本发明抗体。例如，可通过标准PCR技术产生这类片段，然后被克隆进pGEX表达载体(Ausubel等人，前述)。然后可以在大肠杆菌中表达融合蛋白质，并使用如Ausubel等人描述(前述)的谷胱甘肽琼脂糖亲和介质纯化。如果需要的话，对于每个蛋白质可以产生几个(如两个或三个)融合体，每一个融合体可以被注射入至少两只兔子。通过一系列的注射可以产生抗血清，一般包括至少三次加强注射。通常，要检测抗血清免疫沉淀重组PLP03多肽或其功能等价物的能力，而不相关的蛋白质可以被用作免疫反应专一性的对照。
可另选的是，描述的用来产生单链抗体的技术(U.S.专利4,946,778和4,704,692)可以被用来产生针对本发明蛋白质或其功能等价物的单链抗体。产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒是可商业获得的(如从Pharmacia)。
另外，特别适合用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂可见于如U.S.Patent No.5,223,409；PCT Publication No.WO 92/18619；PCT Publication No.WO 91/17271；PCT Publication No.WO 20791；PCT Publication No.WO 92/20791；PCT Publication No.WO92/15679PCT Publication No.WO 93/01288；PCT Publication No.WO 92/01047PCT Publication No.WO 92/09690；PCT Publication No.WO 90/02809Fuchs等人(1991)Bio/Technology 91370-1372；Hay等人(1992)HumAntibod.Hybridomas 381-85；Huse等人(1989)Science 246；1275-1281；Griffiths等人(1993)EMBO J.12725-734.
与本发明蛋白质或其功能等价物特异结合的多克隆和单克隆抗体可以被用于如检测编码本发明蛋白质或其功能等价物的基因的表达(如在另一种曲霉菌株中)。例如，用传统的对曲霉细胞或提取物的免疫分析将容易地检查本发明蛋白质。合适的分析例子包括(不限于)Western印迹、ELISA分析、放射免疫分析(RIA′s)等等。
“特异结合”意指抗体识别并结合特定抗原(如本发明蛋白质)，但基本上不识别和结合样品中其它无关分子。
抗体可以被纯化，如通过将多肽抗原固定在树脂上的亲和层析方法。
针对本发明蛋白质的抗体(如单克隆抗体)可以被用于通过标准技术分离蛋白质，如亲和层析或免疫沉淀。此外，此类抗体可以被用于检测蛋白质(如在细胞裂解物或细胞上清中)，以便评估蛋白质表达的模式和丰度。抗体也可以作为临床测试方法的一部分，被用于诊断检测细胞或组织的蛋白质水平，如测定一种既定的治疗方案的效率或对曲霉的诊断。
将抗体与可检测的物质耦联将促进检测。可检测的物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。适当的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的荧光材料的例子包括伞形花内酯、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白，合适的放射材料的例子包括125I、131I、35S或3H。
优选的抗原肽所包含的表位是位于蛋白质表面的区域，如亲水区域。蛋白质的疏水图(Hydrophobicity plots)可以被用于鉴定亲水区域。
本发明蛋白质的抗原肽至少包含选自SEQ ID NO3、6、9、12和15的氨基酸序列的7个优选10、15、20或30个连续的氨基酸残基，并包含该蛋白质的表位，以致于所引起的针对此肽的抗体与蛋白质形成特异样免疫复合体。优选的抗原肽所包含的表位是位于本发明蛋白质表面的区域，如亲水区域、疏水区域、含有α-螺旋的区域、含有β-链或折叠的区域、卷曲区域、回转区域和柔性区域。
免疫分析可使用任何本领域已知的方法进行生物样品中本发明蛋白质的定性或定量测定。基于抗体的技术在分析生物样品中特定的多肽水平上具有特殊的优势。在这种技术中，初级抗体(多抗或单抗)提供特异性识别，而二级检测系统可以利用荧光、酶或其它耦联的二级抗体。结果是得到免疫复合体。
因此，本发明提供诊断生物是否感染曲霉菌的方法，包括步骤·从所述被怀疑感染曲霉的生物中分离生物样品，·将所述生物样品与本发明抗体反应，·测定是否形成免疫复合体。
也可以抽提组织(如使用尿素和中性去污剂)，以释放用于Western-杂交或斑点/狭线分析的蛋白质。此技术也可以被用于体液。
其它对于检测本发明蛋白质有用的基于抗体的技术包括免疫分析，如酶联免疫吸附分析(ELISA)和放射免疫分析(RIA)。例如，针对本发明蛋白质的单克隆抗体可以被用作免疫吸附剂和酶标探针以检测和定量本发明蛋白质。存在于样品中的特定蛋白质的量可以通过参考标准制品中的量，使用线性回归计算机运算法则计算。在另一ELISA分析中，两种截然不同的特异性单克隆抗体可以被用来检测生物液体中的本发明蛋白质。在这种分析中，一种抗体被用作免疫吸附剂，另一种被用作酶标探针。
以上技术可以主要按“一步”或“两步”分析操作。“一步”分析涉及将本发明蛋白质与固定的抗体接触，并(不经洗涤)将混合物与标记的抗体接触。“两步”法涉及在混合物与标记抗体接触以前进行洗涤。其它传统方法也可以被适当使用。通常需要将分析系统的一种成分固定在支持物上，由此允许将系统的其它成分与此成分接触，并易于从样品中除掉。
合适的酶标记包括，例如，那些来自氧化酶类别的酶，它们催化与底物反应产生过氧化氢。氧化酶标记的活性可以通过测量酶标抗体/底物反应产生的过氧化氢的浓度来分析。
除了酶以外，其它合适的标记物包括放射性同位素(如碘(125I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc))和荧光标记物(如荧光素、罗丹明)和生物素。
测试化合物与本发明蛋白质的特异结合可以被检测，如通过体外将本发明蛋白质可逆或不可逆的固定在基质(如96孔聚苯乙烯微量滴定板的孔表面)上。本领域熟知固定多肽和其它小分子的方法。例如，可以通过向每个孔加入蛋白质溶液(通常浓度为0.05到1mg/ml，体积为1-100μl)，并且在室温至37℃孵育平板0.1到36小时，使微量滴定板被本发明蛋白质所覆盖。通过从平板中倒出过量的溶液，然后用水或缓冲液洗涤平板(一次或反复进行)，可以除去未与平板结合的蛋白质。通常，多肽保持在水或缓冲液中。然后用不含有被结合多肽的缓冲液洗涤平板。用与被结合多肽无关的蛋白质封闭平板，以除去平板上空余的蛋白质结合位点。例如，合适的有300μl溶于Tris-HCl的浓度为2mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)。合适的基质包括能进行明确交联化学反应的基质(如塑料基质，如聚苯乙烯、苯乙烯或来自Corning Costar Corp.(Cambridge，MA)的聚丙烯基质)。如果需要的话，珠状颗粒(如beaded agarose或beaded sepharose)可以被用作基质。
测试化合物与本发明蛋白质的结合可以被本领域已知的各种方法所检测。例如，特定的抗体可以被用于免疫分析。如果需要的话，抗体可以被标记(如用荧光或放射性同位素)，并被直接检测(例如，见West和McMahon，J.Cell Biol.74264，1977)。替代的是，可以使用二级抗体来检测(如与抗AN97抗体Fc部分结合的标记抗体)。在一替代的检测方法中，本发明蛋白质被标记，并且此标记被检测(如通过使用放射性同位素、荧光团、发光团等等标记本发明蛋白质)。还在另一种方法中，本发明蛋白质与可以被光学检测的蛋白质(如可以在紫外光下检查的绿色荧光蛋白质)融合后产生。在替代的方法中，本发明蛋白质可与具有可检测酶活力的酶(辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、α-半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶)共价连接或融合。编码所有这些酶的基因都已被克隆，并对于本发明的技术人员而言是易于获得的。如果需要的话，融合蛋白质可以包括抗原，并且可以使用多克隆或单克隆抗体，通过传统方法检测和测量这一抗原。合适的抗原包括酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和α-半乳糖苷酶)和非酶多肽(如血清蛋白质(如BSA和球蛋白)和乳蛋白质(如酪素))。
表位、抗原和免疫原在另一方面，本发明提供含有本发明多肽表位携带部分的肽或多肽。此多肽部分的表位是本发明多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”被定义为当整个蛋白质是免疫原时，引起抗体反应的蛋白质部分。这些免疫原性表位被认为被限制在分子的一些位点。在另一方面，抗体能结合的蛋白质分子区域被定义为“抗原性表位”。蛋白质的免疫原性表位的数量通常少于抗原性表位的数量。例如，见Geysen，H.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002(1984)。
关于带有抗原性表位(即含有抗体能结合的蛋白质分子区域)的肽或多肽的选择，本领域熟知模仿蛋白质部分序列的短的合成肽通常能产生与被部分模仿的蛋白质反应的抗血清。例如，见Sutcliffe，J.G.等人，Science 219660-666(1984)。常用蛋白质的初级序列表示能够产生与蛋白质反应的血清的肽，可以用一套简单的化学规则描述其特征，它既没有被限制在完整蛋白质的免疫优势区域(即免疫原性表位)，也没有被限制在氨基或羧基端。极端疏水和具有6个或更少残基的肽通常对于诱导结合被模拟的蛋白质的抗体是无效的。更长的、可溶的肽(特别是含有脯氨酸残基的肽)通常是有效的(Sutcliffe等人，前述，661页)。例如，按照这一指导设计的含有8-39个氨基酸残基、占流感病毒血凝素HA1多肽链序列75％的20个肽中，有18个肽诱导出了与HAl蛋白质或完整病毒反应的抗体；而从MuLV聚合酶中设计的12个肽和从狂犬病糖蛋白中设计的18个肽全部都诱导出沉淀各自蛋白质的抗体。
由此，带有抗原性表位的本发明肽和多肽对于引起抗体(包括专门与本发明多肽结合的单克隆抗体)是有用的。因此，通过融合用带有抗原性表位的肽免疫的供体所提供的脾细胞而获得的杂交瘤，通常有较高的比例分泌与天然蛋白质反应的抗体(Sutcliffe等人，前述，663页)。由带有抗原性表位的肽或多肽所引起的抗体对于检测被模仿的蛋白质是有用的，针对不同多肽的抗体可以被用来追踪在进行翻译后加工的蛋白质前体的不同区域的命运。肽和抗肽抗体可以被用于检测被模拟蛋白质的各种定性或定量实验，如在竞争性分析中，因为对于免疫沉淀分析，已经表明即使是短的肽(如约9个氨基酸)也能结合并置换较长的肽。例如，见Wilson，I.A.等人(Cell 37767-778，777页(1984))。本发明抗肽抗体也可以被用于纯化被模拟蛋白质，例如使用本领域众所周知的方法通过吸附层析。
按照上述指导设计的本发明带有抗原性表位的肽和多肽优选的含有至少7个，更优选的含有至少9个，最优选的含有15到30个含于本发明多肽氨基酸序列中的氨基酸。然而含有更大部分本发明多肽氨基酸序列的肽或多肽，例如含有30到50个氨基酸或任何长度，以及包括本发明多肽完全的氨基酸序列的肽，也可以被认为是本发明带有表位的肽和多肽，并被用于诱导与被模拟的蛋白质反应的抗体。优选的，选择的带有抗原性表位的肽的氨基酸序列能够基本上溶于水性溶剂(即该序列包括相对亲水残基，而高度疏水的序列是要优先避免的)；含有脯氨酸残基的序列是特别优选的。
可以通过传统的制造肽或多肽的手段(包括使用本发明核酸分子的重组手段)来产生本发明带有表位的肽和多肽。例如，短的带有表位的氨基酸序列可以与作为重组生产和纯化过程中的载体的更大的多肽融合，其中该多肽也是免疫过程中的载体，以产生抗肽抗体。
也可以使用已知的化学合成法合成带有表位的肽。例如，Houghten描述了一种简单的合成大量肽的方法，如在4周内制备并表征(通过ELISA-型结合研究)了10-20毫克248种不同的13残基肽，它们代表HAI多肽片段的单氨基酸变异体(Houghten，R.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825131-5135(1985))。这种″Simultaneous MultiplePeptide Synthesis(SMPS)″方法被进一步描述于U.S.Patent No.4,631,211(Houghten等人(1986))。在这一程序中，用于固相合成各种多肽的单个树脂被保持在分离的、溶剂可渗透的小囊中，使能够最佳的利用许多固相方法所涉及的相同的重复步骤。完全手工的程序允许同时进行500-1000或更多个合成。Houghten等人，前述，5134页。
本发明带有表位的肽和多肽可以根据本领域所熟知的方法被用于诱导抗体。例如，见Sutcliffe等人，前述；Wilson等人，前述；Chow，M.等人，Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 82910-914；和Bittle，F.J.等人，J.Gen.Virol.662347-2354(1985)。通常，可以使用游离的肽免疫动物，而通过将肽与大分子载体(如钥孔血蓝蛋白(KLH)或破伤风类毒素)耦联可以提高抗肽抗体的滴度。例如，对于含有半胱氨酸的肽可使用如马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺脂(MBS)之类的连接物与载体耦联，而其它肽可使用如戊二醛之类的更普通的试剂与载体耦联。使用游离的或载体耦联的肽免疫如兔子、大鼠和小鼠之类的动物，例如通过腹膜内和/或皮内注射含有约100μg肽或载体蛋白质以及弗氏佐剂的乳状液。可能需要几次加强注射，例如，间隔约两周，以提供可以被检测(如使用被固相表面吸附的游离肽进行ELISA分析)的有用滴度的抗肽抗体。通过挑选抗肽抗体可以增加被免疫动物血清中的抗肽抗体滴度，如按照本领域所熟知的方法，将肽吸附在固相支持体上，并洗脱所选择的抗体。
本发明带有免疫原性表位的肽(即当整个蛋白质作为免疫原时，引起抗体反应的蛋白质部分)根据本发明已知的方法被鉴定。例如，Geysen等人(1984，前述)公开了一种在固相支持物上迅速同时合成许多纯度足以在酶联免疫吸附试验中反应的肽的方法。然后，合成的肽与抗体的相互作用可以容易的被检测，无需将它们从支持物上移走。通过这种方式，带有目的蛋白质免疫原性表位的肽可以被本领域的普通技术人员例行鉴定。例如，Geysen等人通过合成覆盖蛋白质整个213氨基酸序列的相互重叠的208个所有可能的6肽，从而定位了口蹄疫病毒衣壳蛋白质的免疫学重要表位，其分辩率为7个氨基酸。于是，一套完整置换的肽(位于表位的每个位点被所有20个氨基酸依次取代)被合成，由此确定了赋于与抗体反应专一性的特定氨基酸。因此，可以通过此方法例行制造本发明带有表位的肽的肽类似物。Geysen(1987)的U.S.Patent No.4,708,781进一步描述了鉴定带有目的蛋白质免疫原性表位的肽的方法。
Geysen(1990)的U.S.Patent No.5,194,392还进一步描述了一种普通的检测或测定单体(氨基酸或其它化合物)序列的方法，此单体是与目的抗体特定互补位(抗原结合位点)互补的表位的拓扑等价物(即“模拟表位(mimotope)”)。更一般地，Geysen(1989)的U.S.Patent No.4,433,092描述了一种检测或测定单体序列的方法，此单体是与特定的目的受体的配体结合位点互补的配体的拓扑等价物。相似的，Houghten，R.A.等人(1996)的U.S.Patent No.5,480,971(关于全烷基化的寡肽混合物)公开了线性C1-C7-烷基完全烷基化寡肽以及成套的这类寡肽和它们的文库，并且公开了使用成套的这类寡肽和它们的文库测定与目的受体分子优先结合的完全烷基化寡肽的序列的方法。因此，通过这些方法也能例行制作本发明带有表位的肽的非肽类似物。
磷脂酶在工业方法中的用途本发明也涉及本发明磷脂酶在所选的一些工业和药物方法中的用途。尽管这些方法有长期的经验，本发明磷脂酶具有若干比目前所使用的酶显著有利的特征。依赖于具体的应用，这些有利条件包括如降低生产成本、提高底物专一性、更低的抗原性、更低的不需要的副作用、当使用合适的微生物生产时获得更高的得率、更合适的pH和温度范围、终产物具有更好的味道、食品级别并更卫生等方面。
本发明磷脂酶的一个重要方面是它们覆盖整个最佳的pH和温度范围，被认为适合各种应用。例如，许多大规模的加工受益于50℃或以上的相对较高的加工温度(如控制微生物污染的危险)。本发明的一些磷脂酶满足这一要求，但同时它们并不具有如此高的热稳定性，以至于它们能抵抗附加的热处理导致的失活。后一特征允许烘焙产品(如面包)之类的产生终产物的方式不合有残余的酶活力。许多饲料和食物产品具有轻微的酸性pH值，因此对于它们的加工而言，具有酸性或近中性最佳pH的磷脂酶是优选的。本发明的磷脂酶也满足这一需要。
本发明磷脂酶可以被用于任何需要水解磷脂或获得它的特异切割产物的应用。例如应用本发明磷脂酶可以产生溶血磷脂、二酰甘油、胆碱-或乙醇胺磷酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺和各种磷脂酸。本发明磷脂酶被优选用于最佳活力pH。
本发明磷脂酶可以被用于水性糖溶液或浆状物的脱胶，以提高其过滤性，尤其是淀粉水解产物，特别是难于过滤并产生浑浊滤液的小麦淀粉水解产物。此处理可以使用本领域所熟知的方法完成。例如，见EP-A-219,269和EP-A-808,903。
通过用多肽水解磷脂的主要部分，并从油中分离含有被水解的磷脂的水相，本发明磷脂酶可以被用于降低食用油的磷脂含量。这一方法可以被用于纯化任何含有磷脂的食用油，如植物油(如大豆油、菜籽油、向日葵油)。在用磷脂酶处理之前，优选的是油被通过湿法精制之类的预处理以除去粘液(胶浆)。通常，在开始用磷脂酶处理之时，油中含有50-250ppm以磷脂形式的磷，处理可以将磷值降到低于5-10ppm。磷脂酶处理是通过散布磷脂酶的水性溶液来完成，优选的为平均直径低于10μm的小滴形式。优选的，水量占油重量的0.5-5％。可以加入乳化剂。可以使用机械搅动来保持乳化。磷脂酶处理可以在约3.5到5的pH范围进行，以最大化酶的性能，或者可以使用约1.5到3(如2-3)的pH范围，以抑制甘油三脂的碱水解(皂化)。可以通过加入柠檬酸、柠檬酸缓冲液或盐酸来调节pH。适合的温度通常是30-70℃(尤其是30-45℃，如35-40℃)。反应时间通常是1-12个小时(如2-6小时)。合适的酶剂量通常是0.1-10mg每升(如0.5-5mg每升)。磷脂酶处理可以分批进行(如在一搅拌的容器中)，或者也可以连续进行(如在一系列搅拌的反应容器内)。磷脂酶处理之后是对水相和油相的分离。此分离可以通过传统的方式完成(如离心)。水相中含有磷脂酶，并且这些酶可以被重复利用以提高此过程的经济性。可以使用本领域已知的各种方法完成此处理。例如，见U.S.Patent No.5,264,367，EP-A-654,527和JP-A-2-153997.
烘焙产品是由生面团制成，生面团通常由基本成分面粉、水和可选的盐制成。依赖于烘焙产品的不同，其它选择性的成分包括糖、调味品等等。对于发酵产品，面包酵母主要在化学发酵系统(如酸(产生酸的化合物)和重碳酸盐的组合)之后被使用。为了提高生面团的操作特性和烘焙产品的最终性质，一直在努力发展有助于提高性质的手段。需要被提高的生面团性质包括可加工性、气体保留能力等等。可以被提高的烘焙产品的性质包括面包体积、面包皮脆度、面包心质地和柔软性、味道和香味以及保质期。目前具有的加工辅助手段可以被分为两组化学添加剂和酶。
改善性质的化学添加剂包括氧化剂(如抗坏血酸、溴酸盐、和偶氮碳酸盐)、还原剂(如L-半胱氨酸和谷胱甘肽)、作为生面团调节物的乳化剂(如二乙酰酒石酸单/双甘油酯(DATEM)、硬脂酰乳酸钠(SSL)或硬脂酰乳酸钙(CSL))，或作为面包心软化剂的乳化剂(如单硬脂酸甘油脂(GMS)等)、脂肪材料(如甘油三脂(脂肪)或卵磷脂及其它)。
目前趋向于用酶来代替化学添加剂。后者被认为是更天然的化合物，因此更加被消费者接受。合适的酶可以选自淀粉降解酶、阿拉伯糖木聚糖及其它半纤维素降解酶、纤维素降解酶、氧化酶、脂肪材料裂解酶和蛋白质降解酶。
本发明也涉及制备生面团或烘焙产品的方法，该方法包括向生面团中整合入有效量的本发明磷脂酶，相对于没有加入多肽的生面团或烘焙产品而言，该磷脂酶改善生面团或来自此生面团的烘焙产品的一种或多种性质。
短语“整合入生面团”在这里的被定义为将本发明磷脂酶加入生面团、任何将要制成生面团的成分和/或任何将要制成生面团的生面团成分混合物。换句话说，本发明磷脂酶可以在制备生面团的任何步骤中加入，并且可以在一步、两步或多步中被加入。使用本领域熟知的方法，本发明磷脂酶被加入到生面团成分中，其中该生面团被揉制，并被烘焙成烘焙产品。例如，见U.S.Patent No.4,567,046，EP-A-426,211，JP-A-60-78529，JP-A-62-111629和JP-A-63-258528。
术语“有效的量”在这里的定义是在生面团和/或烘焙产品的至少一个目的性质上足以提供可测量效果的本发明磷脂酶的量。
术语“改善的性质”在这里的定义是相对于没有加入本发明磷脂酶的生面团或烘焙产品而言，任何被本发明磷脂酶的作用所改善的生面团或来自此生面团的产品(特别是烘焙产品)的性质。改善的性质可能包括(但不限于)增加生面团的强度、弹性、稳定性、降低生面团粘性、提高生面团延展性、改善烘焙产品的味道、改善抗陈腐能力。
可以通过在以下实施例中描述的本发明方法对加入和没有加入本发明多肽而制备的生面团和/或烘焙产品进行比较，从而测定改善的性质。感观质量可以使用烘焙工业已良好制定的程序来评估，例如，可以包括使用一组经训练的味道测试员。
术语“生面团增加的强度”在这里的定义是生面团通常更具弹性和/或需要更多工作进行塑造和成形的性质。
术语“生面团增加的弹性”在这里的定义是生面团在经受一定的物理力后具有更高的恢复原有形状的趋向的性质。
术语“生面团增加的稳定性”在这里的定义是生面团不易被机械损坏，因此更好的保持其形状和体积的性质。
术语“生面团降低的粘性”在这里的定义是生面团更不易与表面(如在生产生面团的机器中)粘附的性质，并且被有经验的测试面包师依经验评估或使用本领域已知的质地分析器(如TAXT2)进行测量。
术语“改善的生面团延展性”在这里的定义是生面团能够经受更大的张力和牵引而不断裂的性质。
术语“改善的生面团可加工性”在这里的定义通常是生面团具有更低的粘性和/或更加牢固和/或更具弹性的性质。
术语“烘焙产品增加的体积”是以给定的面包条的特定体积(体积/重量)，其通常是通过传统的油菜籽置换方法被测定。
术语“改善的烘焙产品面包心结构”在这里的定义是烘焙产品面包心中具有更精细和/或更细薄的腔壁和/或在面包心中具有更一致/同源分散的小腔，通常经有经验的测试面包师按经验评估。
术语“改善的烘焙产品柔软性”与“坚固性”相对，在这里的定义是烘焙产品更容易被压缩的性质，并且被有经验的测试面包师按经验评估或使用本领域已知的质地分析器(如TAXT2)进行测量。
术语“烘焙产品改善的滋味”通过经训练的测试小组评估。
术语“改善的烘焙产品抗腐败能力”在这里的定义是烘焙产品在储存过程中质量参数(如柔软性和/或弹性)下降整率减慢的性质。
术语“生面团”在这里的定义是面粉和其它成分的混合物，其坚固足以承受揉捏或辊压。生面团可以是新鲜的、冷冻的、未加工的(pre-bared)或烘焙前的。
冷冻的生面团的制备由Kulp和Lorenz在Frozen andRefrigerated Doughs and Batters中描述。
术语“烘焙产品”在这里的定义是指任何由生面团制备的产品，不管具有柔软还是松脆的特征。可以被本发明方便生产的烘焙产品(不管是白色、浅色或者暗黑型)是面包(特别是白面包、粗粮面包或燕麦面包，)通常的形式是块型、卷型、法国棍型面包、意大利面食、皮塔饼、玉米粉圆饼(tortillas)、玉米面豆卷(tacos)、蛋糕、薄煎饼(pancake)、饼干、小甜饼、馅饼皮、馒头、脆面包等等。
在本发明方法中使用的本发明磷脂酶和/或附加的酶可以以任何适合所需用途的形式被使用，如以干粉、凝聚粉或颗粒(特别是无尘颗粒)、液体(特别是稳定的液体)或被保护的酶(如WO01/11974和W002/26044中所描述的)的形式。颗粒和凝聚粉可以通过传统的方法被制备，如通过将本发明磷脂酶喷雾到流化床制粒机的载体上。载体可以由具有适当颗粒大小的颗粒核心组成。载体可以是可溶的或不可溶的，如盐(例如NaCl或硫酸钠)、糖(如蔗糖或乳糖)、糖醇(如山梨糖醇)、淀粉、大米、玉米粗粉或大豆。本发明磷脂酶和/或附加的酶可以含于缓慢释放的制剂中。本领域熟知制备缓慢释放制剂的方法。按照确立的方法，加入在营养上可接受的稳定剂，如糖、糖醇、或其它多元醇、和/或乳酸或其它有机酸可以例如稳定液体酶制剂。
本发明磷脂酶可以被加入含有如EP-A-0619947、EP-A-0659344和WO02/49441所公开的组合物的ub酵母。
对含于混合前的面粉而言，本发明多肽以干燥产物的形式(如无尘颗粒)是有利的，而对含于液体而言，则液体形式是有利的。
一种或多种附加的酶也可以被整合入生面团。附加的酶可以来自包括哺乳动物和植物在内的任何来源，优选的是微生物(细菌、酵母或真菌)来源的，并且可以通过本领域使用的传统技术获得。
在一优选的实施方案中，附加的酶可以是淀粉酶(如α-淀粉酶(用于提供可被酵母发酵的糖和延迟腐败)或β-淀粉酶)、环糊精葡聚糖转移酶、肽酶(特别是外肽酶，用于增强口味)、谷氨酰胺转移酶、脂酶(用于存在于生面团或生面团成分中的脂质的修饰，以便于软化生面团)、磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶(特别是戊聚糖酶，如木聚糖酶(用于部分水解戊聚糖，增加生面团延展性)、蛋白酶(用于弱化麸质，特别是在使用硬质小麦粉时)、蛋白质二硫键异构酶(如WO95/00636中公开的蛋白质二硫键异构酶)、糖基转移酶、过氧化物酶(用于改善生面团的稠度)、漆酶、或氧化酶(如葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、醛糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂氧化酶或L-氨基酸氧化酶(用于改进生面团稠度))。
当按照本发明的方法加入一种或多种附加酶活力时，这些活力可以与本发明多肽分开或一起被加入，可选地作为改善面包和/或生面团的组合物的成分。其它酶活力可以是以上描述的任何酶，并且可以按照已确立的烘焙实践被使用。
本发明也涉及制作烘焙产品的方法，包括将来自本发明方法的生面团烘焙成烘焙产品。使用本领域所熟知的方法可以将生面团烘焙成烘焙产品。
本发明也分别涉及由本发明方法所产生的生面团和烘焙产品。
本发明进一步涉及用于生面团和/或由生面团制成的烘焙产品的预混物(pre-mix)(如以面粉组合物的形式)，其中预混物包括本发明多肽。这里定义的术语“预混物”将被理解成它的传统含义，即通常包括面粉的烘焙制剂混合物，它不仅可以用于通常包括面粉的工业面包烘焙试剂(不仅可以被用于工业面包烘焙厂/设备)，也可用于零售面包店。预混物可以通过将本发明多肽或含有该多肽的改善面包和/或生面团的组合物与合适的载体(如面粉、淀粉、糖或盐)混合来制备。预混物也可以包括其它改善面包和/或生面团的添加剂，如包括酶在内的以上提及的任何添加剂。
本发明进一步涉及颗粒或凝聚粉形式的烘焙添加剂，此添加剂包括本发明多肽。优选的烘焙添加剂具有狭窄的颗粒大小分布，其中超过95％(重量百分比)的颗粒在25到500μm的范围内。
在生面团和面包制作中，本发明可以与前文定义的加工辅助手段结合使用，例如化学加工辅助物如氧化剂(如抗坏血酸)、还原剂(如L-半胱氨酸)、氧化还原酶(如葡萄糖氧化酶)和/或其它酶，如多糖修饰酶(如α-淀粉酶、半纤维素酶、分支酶等等)和/或蛋白质修饰酶(内切蛋白酶、外切蛋白酶、分支酶等等)。
实施例1黑曲霉的发酵这里提供的核酸序列所编码的磷脂酶是通过构建含有该DNA序列的表达质粒，用此质粒转化黑曲霉菌株，并以下述方式繁殖黑曲霉菌株而获得。
新鲜的黑曲霉孢子(106-107)被接种于20ml CSL-培养基(100ml烧瓶，隔板)，并于34℃、170rpm生长20-24小时。将5-10ml CSL预培养物接种到100ml CSM培养基(500ml烧瓶，隔板)后，于34℃、170rpm持续3-5天发酵菌株。
通过在50ml Greiner试管中离心(30分钟，5000rpm)而获得无细胞上清。上清经GF/A Wha tman Glass微纤维过滤器(150mm AE)预过滤除去大的颗粒，用4 N KOH将pH调到5(如果必要的话)，并经0.2μm(瓶口)的过滤器，使用抽气泵无菌过滤，以除掉真菌物质。上清被储存于4℃(或-20℃)。
CSL培养基由100g Corn Steep Solids(Roquette)、1gNaH2PO4*H2O、0.5g MgSO4*7H2O、10g葡萄糖*H2O和0.25g Basildon(消泡剂)组成(每升的量)。成分被溶解于脱矿质水并用NaOH或H2SO4将pH调到5.8；向具有隔板和泡沫球的100ml烧瓶中加入20ml发酵培养液，于120℃灭菌20分钟，冷却到室温后向每个烧瓶加200ul含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml链霉素的溶液。
CSM培养基由150g麦芽糖*H2O、60g Soytone(蛋白胨)、1gNaH2PO4*H2O、15g MgSO4*7H2O、0.08g吐温80、0.02g Basildon(消泡剂)、20g MES、1gL-精氨酸组成(每升的量)。成分被溶解于脱矿质水并用NaOH或H2SO4将pH调到6.2；向具有隔板和泡沫球的500ml烧瓶中加入100ml发酵培养液，于120℃灭菌20分钟，冷却到室温后向每个烧瓶加入1ml含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml链霉素的溶液。
实施例2本发明磷脂酶的纯化第一步-超滤液的制备培养物上清(如在实施例1中获得的)被超滤除去会干扰酶活力测定及烘焙测试的低分子污染物。在装备截留值为10kDa过滤器的Millipore Labscale TFF系统中完成30ml上清的超滤。
依赖于它们的颜色，用体积为40ml的pH为6.0、并含有0.5mMCaCl2的100mM冷磷酸缓冲液将样品洗涤3-5次。酶溶液的最终体积为30ml，并被进一步称为“超滤液”。
第二步-通过A280和HPSEC测定磷脂酶浓度。
根据归于磷脂酶的280nm消光(A280)和算出的磷脂酶分子消光系数计算出超滤液中的磷脂酶浓度。使用Uvikon XL Secomam分光光度计(Beun de Ronde，Abcoude，The Netherlands)完成A280的测量。
酶的分子消光系数可以根据每个酶分子中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸残基的数量算出(S.C.Gil1和P.H.von Hippel，Anal.Biochem.182，319-326(1989))。这些氨基酸的分子消光系数分别为1280、5690和120M-1.cm-1。本发明磷脂酶中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸残基的数量可以从选自SEQ ID NO3、6、9、12和15的蛋白质序列中推算出。
计算出的本发明磷脂酶消光系数总结于表1。
表1
归于磷脂酶的超滤液280nm(A280)的消光依赖于酶的纯度。使用TSK SW-XL柱(300*7，8mm；MW范围10-300kDa)，通过HPSEC(HighPerformance Size Exclusion Chromatography)测定纯度。洗脱缓冲液由pH6.0的25mM磷酸钠缓冲液组成，并以1ml/min的流速被使用。注入5-100μl样品。测量在280nm的吸收。
从色谱中各种磷脂酶的峰面积与在280吸收的峰的总面积的比例得出超滤液中归于本发明磷脂酶的A280。然后通过将超滤液A280与上述比例相乘，再除以计算出的每一磷脂酶的消光系数(1mg/ml溶液-表1最右行)而计算出超滤液中的磷脂酶浓度。
实施例3活性测量实施例2的超滤液经受以下酶活力测量·磷脂酶A1或A2·溶血磷脂酶·磷脂酶C·半乳糖脂酶活力·真菌α-淀粉酶磷脂酶A的测定是通过使用1，2-二硫代二辛酰-磷脂酰胆碱为底物的分光光度法。磷脂酶水解在位置1(PLA1)或2(PLA2)的硫化物键，由此释放4硫代辛酸，4硫代辛酸随后与4，4′-二硫代吡啶反应形成4-硫代吡啶酮。后者与在334nm吸收的4-巯基吡啶处于互变异构平衡。反应在37℃于pH4.0的0.1M醋酸缓冲液+0.2％的Triton-X100中进行。在所述的反应条件下每分钟释放1微摩尔4硫代辛酸的酶量被定义为1磷脂酶A单位(PLA)。
溶血磷脂酶活力的测定是通过使用溶血磷脂酰-胆碱为底物的31P-NMR光谱。溶血磷脂酶水解酯键，因此从甘油部分释放脂肪酸。由此形成的甘油磷脂酰胆碱被NMR定量。
反应在55℃于pH4.5、进一步含有1mg/ml溶血磷脂酰胆碱和5mMCaCl2的50mM醋酸缓冲液中进行30分钟。
在所述的反应条件下每分钟形成1微摩尔4甘油磷脂酰胆碱的酶量被定义为1溶血磷脂酶单位(LPC)。
磷脂酶C活力的测定是通过使用对-硝基苯磷脂酰胆碱为底物的分光光度法。磷脂酶C水解酯键，由此释放在405nm吸收的对-硝基酚。
反应在37℃于pH5.0、进一步含有20mM CaCl2、0.25％TritonX-100和20mM对-硝基苯磷酰胆碱的100mM醋酸缓冲液中进行7分钟。终止反应，并通过向1体积的分析混合物中加入0.75体积的1M TRIS溶液来升高pH，之后测量在405nm的消光(ε405nm＝18500M-1.cm-1)。
在所述的反应条件下每分钟形成1微摩尔对-硝基酚的酶量被定义为1磷脂酶C单位。
半乳糖脂酶活力的测定是根据Hirayama和Matsuda(1972)Agric.Biol.Chem.36，1831描述的方法，通过使用双半乳糖甘油二酯为底物的H-NMR光谱。半乳糖脂酶水解脂肪酸与甘油骨架之间的酯键，由此释放一个或两个脂肪酸。
反应在30℃于pH4.5、进一步含有4mM CaCl2、0.2％TritonX-100和1mg/ml双半乳糖甘油二酯(Lipid Product)的50mM醋酸缓冲液中进行30分钟。
在所述的反应条件下每分钟形成1微摩尔脂肪酸的酶量被定义为1半乳糖脂酶单位。
使用Phadebas Amylase测试药片(Pharmacia)测量真菌α-淀粉酶活性。Phadebas药片含有不溶于水的淀粉底物和与底物交联结合的兰色染料。底物被真菌淀粉酶所水解，释放被染色的可溶麦芽糊精进入溶液。用含有参照真菌α淀粉酶活力的溶液制备校准曲线。
用pH5.5的50mM苹果酸缓冲液制备参照和未知样品的适当稀释液。5ml样品在30℃被孵青5分钟。加入Phadebas药片，并在15分钟后加入1.0ml 0.5当量的氢氧化钠终止反应。冷却5分钟，使混合物降到室温，然后加入4.0ml水，用手摇动，15分钟后于4700rpm离心样品10分钟。在620nm测量上层消光系数。OD 620nm是真菌α淀粉酶活力的量度标准。
在所述的反应条件下每小时将1克淀粉(100％干物质)转变成与已知强度的碘溶液反应后能够在620nm传输信息的产物的酶量被定义为1真菌淀粉酶单位。
表2a实施例2制备的超滤液中的磷脂酶活力。
表2b由280nm方法测定的实施例2制备的超滤液中每毫克蛋白质所具有的磷脂酶活力单位。
除了提及的活力，还具有更少活力的葡萄糖淀粉酶和木糖聚酶，然而这些酶如此低的量并不会干扰描述于实施列4的烘焙实验。
实施例4烘焙实验1-小面包条小面包条来自烘焙150克生面团块。该生面团是通过混合200g面粉(KolibriTM/lbiSTM，以80/20的比例)、1.4g干面包酵母(Fermipan)、4g盐、3g糖、10mg抗坏血酸、116g水和2g脂肪而成。在一小型混合器(pin mixer)中混合6分15秒之后，生面团被分成150克的小块并于30℃试粉(proof)45分钟，打压，再试粉25分钟，成形并放入烘焙锅。进行试粉的相对湿度为90-100％。在30℃最终试粉70分钟后，生面团在225℃被烘焙20分钟。
不同磷脂酶在烘焙实验中的各种效果(表3)与含有与超滤液中相同数量真菌淀粉酶(超滤液中的真菌淀粉酶活力见表2)的对照相比较。这是必要的，因为同磷脂酶一起被加入的淀粉酶的数量对于面包的体积(而不是其它参数)有特别的影响。被加入对照数量真菌淀粉酶的面包的体积被看作100％。
表3
使用面包体积测量器BVM-3(RI Cards Instruments AB，Viken，Sweden)测定面包条体积。这一测量原理基于围绕旋转面包的传感器测量的超声反射。测量所需时间是45秒。
生面团的粘性和延展性由合格面包师使用表3描述的量度评估。每一对象平均测量两个面包条。
在这些测试之后生面团块被做成圆形，于30℃第一次试粉45分钟，之后生面团被打压、成形、放入烘焙锅，在30℃试粉75分钟。试粉时的相对湿度被置于85％。
随后通过出现的气泡、裂开的表皮(torn side crust)和不规则弯曲表面判断试粉生面团的稳定性。生面团块在225℃被烘焙20分钟。通过BVM-3方法测定面包条体积表中呈现的是从同一对象烘焙的两个面包的平均值。
面包心结构由合格面包师使用表3描述的量度评估。
面包条在聚乙烯袋中室温保存3天后，其面包心坚固性被StevensTexture Analyser测量。取自每个面包条中心的两厘米厚的两面包片被质地分析器分析，使用1.5英寸直径探针，5mm压缩深度(25％)和0.5mm/秒压缩速率。表中显示的是两个测量的平均值。
面包皮的颜色由合格面包师使用表3描述的量度评估。荷兰模制面包的标准方案被作为参考使用。
面包心的颜色由合格面包师使用表3描述的量度评估。对照面包的面包心颜色被判断为正常(3)。作为阳性对照，使用了两个对象的面包其与对照具有相同的组成，只是多加了0.5％大豆粉。试粉和烘焙程序与没有大豆粉的对照是一样的。后者被判断为“非常好”。
面包的顶部隆起通过顶部相对于烘焙模具的突出而判断，面包顶部的边缘越低，则判断值也越低，隆起越少，则判断值越好。
表4本发明磷脂酶的烘焙成绩
实施例5烘焙实验2-batard本发明磷脂酶的烘焙成绩用称为″batard”的法国型面包测试。在一标准烘焙方法中batard的制备是通过在约20℃，在一螺旋式混合器(Diosna速度1为两分钟；速度2输入100Wh)中混合3000g小麦粉、70g压缩酵母、60g盐、68ppm抗坏血酸、17ppm FermizymeP200(真菌α-淀粉酶)、30ppm FermizymeHS2000(真菌半纤维素酶)、7ppm BakezymeP500和1680ml水(8-10℃)。生面团温度为27℃。生面团的可机械加工性通过面包师手工分析。生面团在32℃和90％的RH下，在发酵柜中被给予15分钟的大量试粉。之后生面团被分成重350g的6块，并被做成圆形，在32℃和90％的RH下发酵15分钟。这一时期结束后生面团被塑造成形，并在32℃和90％的RH下被给予90分钟的最终试粉。完全试粉的生面团被切成生面团块，在烤箱中于240℃烘焙30分钟，并在最初加入蒸气。在冷却到室温后使用BvM-方法测定面包条体积(见实施例4)。
在冷却到室温后，破裂、碎片和面包的形状被有资格的面包师使用表5的量度直接分析。在室温储存于一封闭的盒子16小时后，面包心的质量被有资格的面包师评估。面包的值来自1个对象。
表5
表6本发明磷脂酶的烘焙成绩
*基于面粉重量和由A280方法测定的酶重量，单位为ppm
序列表<110>DSM N.V.
<120>新的磷酯酶及其用途<130>20950WO<160>15<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3763<212>DNA<213>黑曲霉<400>1ggtggatgat agcacacggg cgacgcaaga tcgagaaata acttggtcat cattatttct 60tgtgggtaag caagagtctt atagggggtc ctgctgtggt ctgcgacatc tggtggatgt 120ggatggacga tgatgaagat gggggaacta ttcccaatgc ggtgcgcggg tgcgatggaa 180tggacaggaa gagaattttt catctcagga ttggggaaat ggttgaactc gaccggtgtg 240tgtgtgccgt tgaagcagct ggagtgttat ctgtagtatc tacggtctat gcgcatcatc 300ttcaacagat ccgaccagag tgtgaaagat gccatcgaag aaagaaaaat aactaaaccc 360ggtcgggact gctatcgaca gcctgaggca gtaaggcagt gaggcagtga ggcagtgagg 420cagtgaggca gtcaggtgat gatcaggcat ccaatcatct ctgcctcgcc gccttgccgc 480ctggggtgtc aaggcgaagg accagctcgt catccgatcg agatccatcc cgaataatgt 540ccaggctgtt cgcagtgcct ggtgctagtt gtagatatat gggttatgat atctcactgt 600tctctaccat ccttcctgtt cctggctctc tgctgtggtg tgtatccgag cgggccggaa 660gctaccgatc gccggattgt tccggccctt ttcttattcc atgggctgtg cccttactct 720gcctctcttt ctatctttct ctctctctct ctctctctga ttcgttccca atggagaatt 780caggtacaaa gtaattccct ctggcatgac tgcttgacat gtcgccattc aacatcatga 840agtactaagt agtagtagac caactactct ggacggctga tagcagccaa tcacgggaaa 900gtggccacgc acgggggctg tcgatccccg atgatcgtgc attggcagag ccatgaagaa 960agacggtagg acaagcctcg accagtctct gctacagtgt atcccctccc agatatgggg 1020taaaccctca aataccgtcc gacccggtcc ctcgtgcccc tgcagatcga tgccattgga 1080gttgcatccg gccttcgcgt ctccaccgat ggagaaggga gggtgaataa tggcgtccat 1140gcaaatggct cgcttgactc acaagatgta gtacttgttt aatgaaaata gatggtgtct 1200cgaccacttg acaccaccac gtgcagaccc tgcaagggga gagatgagga gaaaagctgt 1260ccgagtgaca gctccaactc caccctgacc atggtataag aaggctcccc ctcgaccatc 1320ttgtcaatgg ctattctcac cagggtatcg cattctgcct cctccatctg tactacaaat 1380tacaacagag ctcaccatgc atcccagtgc gctggtcggt ctgctggcct ttgctgccgc 1440tgcctcggcc atccccgcca accccagcca taaggctcac tccgactcgg ccgtccagaa 1500
tctcaagtcg aagatcaaga atgtcgtcgt cctggtcatg gagaatcgtt ccgtggacaa 1560cctgttggga ggtcagacga tcaagggctt ggagaacccc atcaacaacg gcccctactg 1620caacccctac aacatcaccg acctctccca gggcaccgtc tgcagtgcgg ccagagacta 1680cgactcggtc accgatgatc ccgatcacgc cgtctatggc aataacatcg agttctacgg 1740caccttcacc cccgacaatg cggccatcgc ccagggcaag ctgaccccct cccagcaggg 1800gttcgtcacg gaacagctgc gcctgtacag cgccgatgcc aaccgcaccg agctgtccgt 1860gcaggtcatg aactattaca ccgagcagca ggtgcccgtg ctcacctcgc tcgtccaaaa 1920ctatgtcgtt ttcaaccatt ggcactcgga tgtgcctggt gtacgaaccc cccccttctt 1980ccccttcccc acctttcagc tggcaacttg ctaactcaga ttcagcccac caaccccaac 2040cgggctgccc tcacctctgg cacttcgtat ggtcacggaa ccaacgatga ggcctttgac 2100aaccacgcct tcccccagcg ttccatcttc cagcagctga ccgagaccgg ccactcctgg 2160atcaactact gggacacggc tggtggcact ggccccgatg ccgagttcta caactggact 2220tacacctcca acaacaccga caaggtcaag gccctggaac agttctacac ggatgccgca 2280gccggtgccc tgcctgaatt cagctacgtc aacccctcgt gctgcggtgt cggcaccaac 2340tcgatgcacc ccagtggtct gatctccgac ggcgagaagc tgatcaagaa cgtctacgac 2400gctctgcgcg ccgggcccca gtggaacgag accctcttca tcctgagctt cgacgagacc 2460ggtggcttcc acgaccatgt gcccccgccc ctcgctcccc ggccggacaa cctcacttac 2520acggccacca ccccaagcgg cgaggactac accttcaact ttaaccgtct gggtggtcgt 2580atccccactc tgctgatctc cccctgggtc ggcaagggat atgtcgagca aaagggcacc 2640agcgtcaccg gcgaaaccgt gtcttactcc gcctcctcga tcctgcgcac cctgggctac 2700ctctgggact ttgacccttt caccccgcgg gtcgagtatg cgccatcctt tgagcatctg 2760gtgcagacgc gggcccgcga taacaccccg actgccttgc cgagtccggt gccctttcgg 2820aagtaaatgg cagatattga atgcggtagt ggaaacgtct aatgcataat gaacggaggg 2880aaagtagatc tgaaaagctg agccgcgtcc gagatacaca tgtttggtca gatatttcct 2940gggcttagca cggtacagag gatgataggt catgtattat tcatgataaa gccaaaataa 3000atagtatttg taatacattg atggccatcg ctggctgttg ttggacattc cttatgatct 3060cttccacgac tattactgat tggggcccaa taacaagctg cggaagaata ttccaatcac 3120aattgacatg tcttgcggca gtttatagaa attccgtaga tttcaggctt tgcactccac 3180cctgtataca catgactttt ataacgttct tcacgcaatc tatatactgg tctacatcaa 3240cccatcctgg ctctctgaaa catggttgag caggagcagc ttgcactctg agtcctactt 3300tattttcaat ccattcctaa ataccgtgag aaaggcaggg aacctaccat tggccttgcc 3360caccaccttg tcgaagaagg tctggctcgg tcgcttcctc aacccaccga cgcctcctcc 3420cggtacctcc agggtcgact ggcccgacct tctgcacaat agattgaatg cgtgtcaaga 3480agccctccgt ctcgagctgt tccggtggcg tatttcgcag cacctgcaga gtgaccccag 3540cgagcagcac tccctcgcga ctccgttcgt aatgttcaag cgacgcgagc gccatcccga 3600caggtctata catccaagct ctgaagccgc ggattacgag ctttcccgag atgcttaagg 3660tgctacaaga tgcatagtta cggtggataa ttataggggt cctagagagc agcattcgca 3720gaagagcaac actatagggc cccttgggcc atctttgaga cta 3763<210>2<211>1365<212>DNA<213>黑曲霉
<220>
<221>CDS<222>(1)..(1365)<400>2atg cat ccc agt gcg ctg gtc ggt ctg ctg gcc ttt gct gcc gct gcc 48Met His Pro Ser Ala Leu Val Gly Leu Leu Ala Phe Ala Ala Ala Ala1 5 10 15tcg gcc atc ccc gcc aac ccc agc cat aag gct cac tcc gac tcg gcc 96Ser Ala Ile Pro Ala Asn Pro Ser His Lys Ala His Ser Asp Ser Ala20 25 30gtc cag aat ctc aag tcg aag atc aag aat gtc gtc gtc ctg gtc atg 144Val Gln Asn Leu Lys Ser Lys Ile Lys Asn Val Val Val Leu Val Met35 40 45gag aat cgt tcc gtg gac aac ctg ttg gga ggt cag acg atc aag ggc 192Glu Asn Arg Ser Val Asp Asn Leu Leu Gly Gly Gln Thr Ile Lys Gly50 55 60ttg gag aac ccc atc aac aac ggc ccc tac tgc aac ccc tac aac atc 240Leu Glu Asn Pro Ile Asn Asn Gly Pro Tyr Cys Asn Pro Tyr Asn Ile65 70 75 80acc gac ctc tcc cag ggc acc gtc tgc agt gcg gcc aga gac tac gac 288Thr Asp Leu Ser Gln Gly Thr Val Cys Ser Ala Ala Arg Asp Tyr Asp85 90 95tcg gtc acc gat gat ccc gat cac gcc gtc tat ggc aat aac atc gag 336Ser Val Thr Asp Asp Pro Asp His Ala Val Tyr Gly Asn Asn Ile Glu100 105 110ttc tac ggc acc ttc acc ccc gac aat gcg gcc atc gcc cag ggc aag 384Phe Tyr Gly Thr Phe Thr Pro Asp Asn Ala Ala Ile Ala Gln Gly Lys115 120 125ctg acc ccc tcc cag cag ggg ttc gtc acg gaa cag ctg cgc ctg tac 432Leu Thr Pro Ser Gln Gln Gly Phe Val Thr Glu Gln Leu Arg Leu Tyr130 135 140agc gcc gat gcc aac cgc acc gag ctg tcc gtg cag gtc atg aac tat 480Ser Ala Asp Ala Asn Arg Thr Glu Leu Ser Val Gln Val Met Asn Tyr145 150 155 160tac acc gag cag cag gtg ccc gtg ctc acc tcg ctc gtc caa aac tat 528Tyr Thr Glu Gln Gln Val Pro Val Leu Thr Ser Leu Val Gln Asn Tyr165 170 175gtc gtt ttc aac cat tgg cac tcg gat gtg cct ggt ccc acc aac ccc 576Val Val Phe Asn His Trp His Ser Asp Val Pro Gly Pro Thr Asn Pro180 185 190aac cgg gct gcc ctc acc tct ggc act tcg tat ggt cac gga acc aac 624Asn Arg Ala Ala Leu Thr Ser Gly Thr Ser Tyr Gly His Gly Thr Asn
195 200 205gat gag gcc ttt gac aac cac gcc ttc ccc cag cgt tcc atc ttc cag 672Asp Glu Ala Phe Asp Asn His Ala Phe Pro Gln Arg Ser Ile Phe Gln210 215 220cag ctg acc gag acc ggc cac tcc tgg atc aac tac tgg gac acg gct 720Gln Leu Thr Glu Thr Gly His Ser Trp Ile Asn Tyr Trp Asp Thr Ala225 230 235 240ggt ggc act ggc ccc gat gcc gag ttc tac aac tgg act tac acc tcc 768Gly Gly Thr Gly Pro Asp Ala Glu Phe Tyr Asn Trp Thr Tyr Thr Ser245 250 255aac aac acc gac aag gtc aag gcc ctg gaa cag ttc tac acg gat gcc 816Asn Asn Thr Asp Lys Val Lys Ala Leu Glu Gln Phe Tyr Thr Asp Ala260 265 270gca gcc ggt gcc ctg cct gaa ttc agc tac gtc aac ccc tcg tgc tgc 864Ala Ala Gly Ala Leu Pro Glu Phe Ser Tyr Val Asn Pro Ser Cys Cys275 280 285ggt gtc ggc acc aac tcg atg cac ccc agt ggt ctg atc tcc gac ggc 912Gly Val Gly Thr Asn Ser Met His Pro Ser Gly Leu Ile Ser Asp Gly290 295 300gag aag ctg atc aag aac gtc tac gac gct ctg cgc gcc ggg ccc cag 960Glu Lys Leu Ile Lys Asn Val Tyr Asp Ala Leu Arg Ala Gly Pro Gln305 310 315 320tgg aac gag acc ctc ttc atc ctg agc ttc gac gag acc ggt ggc ttc 1008Trp Asn Glu Thr Leu Phe Ile Leu Ser Phe Asp Glu Thr Gly Gly Phe325 330 335cac gac cat gtg ccc ccg ccc ctc gct ccc cgg ccg gac aac ctc act 1056His Asp His Val Pro Pro Pro Leu Ala Pro Arg Pro Asp Asn Leu Thr340 345 350tac acg gcc acc acc cca agc ggc gag gac tac acc ttc aac ttt aac 1104Tyr Thr Ala Thr Thr Pro Ser Gly Glu Asp Tyr Thr Phe Asn Phe Asn355 360 365cgt ctg ggt ggt cgt atc ccc act ctg ctg atc tcc ccc tgg gtc ggc 1152Arg Leu Gly Gly Arg Ile Pro Thr Leu Leu Ile Ser Pro Trp Val Gly370 375 380aag gga tat gtc gag caa aag ggc acc agc gtc acc ggc gaa acc gtg 1200Lys Gly Tyr Val Glu Gln Lys Gly Thr Ser Val Thr Gly Glu Thr Val385 390 395 400tct tac tcc gcc tcc tcg atc ctg cgc acc ctg ggc tac ctc tgg gac 1248Ser Tyr Ser Ala Ser Ser Ile Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Leu Trp Asp405 410 415ttt gac cct ttc acc ccg cgg gtc gag tat gcg cca tcc ttt gag cat 1296Phe Asp Pro Phe Thr Pro Arg Val Glu Tyr Ala Pro Ser Phe Glu His420 425 430ctg gtg cag acg cgg gcc cgc gat aac acc ccg act gcc ttg ccg agt 1344
Leu Val Gln Thr Arg Ala Arg Asp Asn Tnr Pro Tnr Ala Leu Pro Ser435 440 445ccg gtg ccc ttt cgg aag taa1365Pro Val Pro Phe Arg Lys450<210>3<211>454<212>PRT<213>黑曲霉<400>3Met His Pro Ser Ala Leu Val Gly Leu Leu Ala Phe Ala Ala Ala Ala1 5 10 15Ser Ala Ile Pro Ala Asn Pro Ser His Lys Ala His Ser Asp Ser Ala20 25 30Val Gln Asn Leu Lys Ser Lys Ile Lys Asn Val Val Val Leu Val Met35 40 45Glu Asn Arg Ser Val Asp Asn Leu Leu Gly Gly Gln Thr Ile Lys Gly50 55 60Leu Glu Asn Pro Ile Asn Asn Gly Pro Tyr Cys Asn Pro Tyr Asn Ile65 70 75 80Thr Asp Leu Ser Gln Gly Thr Val Cys Ser Ala Ala Arg Asp Tyr Asp85 90 95Ser Val Thr Asp Asp Pro Asp His Ala Val Tyr Gly Asn Asn Ile Glu100 105 110Phe Tyr Gly Thr Phe Thr Pro Asp Asn Ala Ala Ile Ala Gln Gly Lys115 120 125Leu Thr Pro Ser Gln Gln Gly Phe Val Thr Glu Gln Leu Arg Leu Tyr130 135 140Ser Ala Asp Ala Asn Arg Thr Glu Leu Ser Val Gln Val Met Asn Tyr145 150 155 160Tyr Thr Glu Gln Gln Val Pro Val Leu Thr Ser Leu Val Gln Asn Tyr165 170 175Val Val Phe Asn His Trp His Ser Asp Val Pro Gly Pro Thr Asn Pro180 185 190Asn Arg Ala Ala Leu Thr Ser Gly Thr Ser Tyr Gly His Gly Thr Asn195 200 205Asp Glu Ala Phe Asp Asn His Ala Phe Pro Gln Arg Ser Ile Phe Gln210 215 220Gln Leu Thr Glu Thr Gly His Ser Trp Ile Asn Tyr Trp Asp Thr Ala225 230 235 240Gly Gly Thr Gly Pro Asp Ala Glu Phe Tyr Asn Trp Thr Tyr Thr Ser
245 250 255Asn Asn Thr Asp Lys Val Lys Ala Leu Glu Gln Phe Tyr Thr Asp Ala260 265 270Ala Ala Gly Ala Leu Pro Glu Phe Ser Tyr Val Asn Pro Ser Cys Cys275 280 285Gly Val Gly Thr Asn Ser Met His Pro Ser Gly Leu Ile Ser Asp Gly290 295 300Glu Lys Leu Ile Lys Asn Val Tyr Asp Ala Leu Arg Ala Gly Pro Gln305 310 315 320Trp Asn Glu Thr Leu Phe Ile Leu Ser Phe Asp Glu Thr Gly Gly Phe325 330 335His Asp His Val Pro Pro Pro Leu Ala Pro Arg Pro Asp Asn Leu Thr340 345 350Tyr Thr Ala Thr Thr Pro Ser Gly Glu Asp Tyr Thr Phe Asn Phe Asn355 360 365Arg Leu Gly Gly Arg Ile Pro Thr Leu Leu Ile Ser Pro Trp Val Gly370 375 380Lys Gly Tyr Val Glu Gln Lys Gly Thr Ser Val Thr Gly Glu Thr Val385 390 395 400Ser Tyr Ser Ala Ser Ser Ile Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Leu Trp Asp405 410 415Phe Asp Pro Phe Thr Pro Arg Val Glu Tyr Ala Pro Ser Phe Glu His420 425 430Leu Val Gln Thr Arg Ala Arg Asp Asn Thr Pro Thr Ala Leu Pro Ser435 440 445Pro Val Pro Phe Arg Lys450<210>4<211>3692<212>DNA<213>黑曲霉<400>4tttggggttg gtcgtgtgcg tcctgtgctg tcctgtcttg aaccgaacca gactggcagg 60gactattatt ccgagtattc cccggcgaag gatggcagtg atgagacatt cggctggatt 120ggatcggacc cctgctgatc agctcgggga attctcctat tccgtgggat tgattctttt 180ctttttcttt tctattctat gctatgcaaa agacgtgatg tgtgtctggt tggcgttcca 240ggagcgaaga ttgcttttct tactatatta ttccttcttc tatgttcttg aattagctat 300gcaggtagcg gtcaatatat cctttaagca gataccttta ctcttgctat ggatatcata 360atcctagaag gtacatccac catagactac ctagtccccg gccacatcat gaaatatcac 420tggtacatta ttctccgaga accacagaac cactccatag cacaggcaca taatggcacc 480tgcccacacc cacactcacg gctcctagta ctaacccctc gtagtcccca gtactccaca 540
ggtacctaat acacttgtcc cacaccctca ccaagaccaa ctaaccacca aagctactcg 600cagatagcaa gatagtcacc tgccacaccg caactcacta acaaacgcag atcacaagcc 660taaatattcg aaccaaacct gaagaatcct ttccaaccaa cacacacacg gtatgggttg 720gaaggaaggg aaagaaagtg gggttaagca aactaactaa caaactctgc aaggtagcaa 780acgctacact aaccaaccaa actagttaaa ctaatattaa taataataat aagaagaaga 840agatgatgat gaaggagtca tcgttctccc gtccccggct tatagtacgg gatgctaagg 900ctgcaccccg cagcacggga agcccggacg ttggtggttt gcgggtgggt gactggatta 960gactagggga ctcgtaaggc agcggactag ttaaattaat tgactagtag tctgtgctgg 1020gctgggctta tctagtactg tgaagtgccg ggatgtgccg ggtgagtgaa gagttcatta 1080atgaatgatt gattgatttg cgggggtggt aggtgtagcg ttaggtaatg gaaccacttc 1140ttataattgt attactctac taactgtaaa tgtgtgtgtt ttatggggac aggagaagtt 1200aaggtagtat tgggggcggg aaaaggggat ggttgtctaa ttcagtttgt ttcaatagtt 1260tgttgaggta ttttcttgtc aaagttactt gttcagatta tgggcacgtg tacgtgctta 1320gttttcatag attgtgtgta tgtgtgtgtg tgcgcgtgcg tgctgaccca tctatagcat 1380gtatcgcggt ctgaatgtgt ataagcgctg caagtgatcg gcaaagtgac aagaagtctt 1440tctacgaccc actagttatt tgcatgtcac gaaccacaac accgccagtc acagcgacag 1500catgtgaaga agtctcagat ttcgtaacac tctcccgtct actgctctcc tacttgatag 1560actgacttac ctcggcctgt gcacatgcca tgtccctatc ccaatctact ggtccatgtg 1620cagaccacgc ctccacgttt ctccgccagt agatccttca acaccgctca tcctcagaca 1680acatctactt tatttgactt ttcggagaag accatgcttg tctacggcca gctatagcat 1740gctatagcag tccgttaatc tccaccgggc tcccgctccg aacggagatg gggccaaact 1800gccactccag ttgcgcaacg gacaggcacc gaaccggaac aaaggatgcg gaagaggaga 1860catggtgcct gattgcatgt gctggcttca tctgctatcg tgagggtgct gtgctggaga 1920aatttgttgt ctgacttacc ccgcttcttg ctttttttcc ccctgatgcc cctgatgggg 1980aattggggtg ggtaatatga tacaggtata aaagggggct cggaggtgca gttggataga 2040agcattgtgt gtgcattgca gcagtccgtt ggtctcacgt ctctggttgc ctcgattgta 2100tatatactgc aggatgttct ctggacggtt tggagtgctt ttgacggcgc tcgctgcgct 2160gagtgctgcg gcaccgacac cacttgatgt gcggagtagg tgtgcctgat ttgaagtggc 2220tggatagcac tgatgaaggt tttgaatagg tgtctcgact tccacgttgg atgagctgca 2280attgttctcg caatggtctg ccgcagctta ttgctcgaac aatatcgact cggacgactc 2340taacgtgaca tgcacggccg acgcctgtcc atcagtcgag gaggcgagca ccaagatgct 2400gctggagttt gacctgtatg ttgctccagt gaaatggata gaacacagct gattgaatag 2460gacaaataac tttggaggca cagccggttt cctggccgcg gacaacacca acaagcggct 2520cgtggtcgcc ttccgaggca gtagcaccat caagaactgg attgctgatc tcgacttcat 2580cctgcaagat aacgatgacc tctgtactgg ctgcaaggtt cacactggat tctggaaggc 2640atgggaagcc gctgcagaca atctgacgag caagatcaag tccgcgatga gcacgtattc 2700gggctatacc ctctacttca ccgggcacag cttgggcggc gcattggcta cactgggagc 2760aacggtcttg cgaaatgacg gttatagcgt tgaactggtg agtgcttcag agggtgatca 2820ttaaacagcc ggttctgaca gtcaatagta cacctatgga tgtcctcgag tcggaaacta 2880tgcgctggcc gagcacatca ccagccaggg atctggagcg aacttccgcg ttacacactt 2940gaacgacatc gtcccccggt tgccacccat ggactttgga ttcagccagc caagtccaga 3000atactggatc accagtggca ccggagccag tgtcacggcg tcggatattg aactcatcga 3060gggaatcaat tcgacggcgg ggaatgcagg cgaagcaacg gtggacgttt tggctcactt 3120gtggtacttt ttcgcaattt cagagtgtct gctatagctg gacagtccga tgaaataagt 3180
gcggagagaa agtgtaaata gtaattagta tataatcagg cagagaagca gtggtggtca 3240gagaagaaag agtgagatcc cattacgtag cagataaacc acgtgtggag gcgctgttcc 3300tccacttgca gttgcggcca tcaatcatct tcttctcctt actttcgtcc accataactc 3360tcatcctgcc agctgtcgca tccccgggtt tcaacaacag tcgcctccgg gccctccgtg 3420gttctccttt attattccat ccgccggccg acgtttcacc ctcatcctgc gccgccgcaa 3480ttctctccgg atcggtcaag tcactcgaac cgccgcccgc atcgacctca ccgacccgac 3540cgtctgcgat cgcccatccg tgcagccatg ttccctgccc cgtcactctg atttgacgct 3600caattgactt ccgtggcata catacatcca gcagcatatg atcacagctc ccccgcctcg 3660tgccagtctc gccgccgccg ccgttgccag cc 3692<210>5<211>894<212>DNA<213>黑曲霉<220>
<221>CDS<222>(1)..(894)<400>5atg ttc tct gga cgg ttt gga gtg ctt ttg acg gcg ctc gct gcg ctg 48Met Phe Ser Gly Arg Phe Gly Val Leu Leu Thr Ala Leu Ala Ala Leu1 5 10 15agt gct gcg gca ccg aca cca ctt gat gtg cgg agt gtc tcg act tcc 96Ser Ala Ala Ala Pro Thr Pro Leu Asp Val Arg Ser Val Ser Thr Ser20 25 30acg ttg gat gag ctg caa ttg ttc tcg caa tgg tct gcc gca gct tat 144Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ser Gln Trp Ser Ala Ala Ala Tyr35 40 45tgc tcg aac aat atc gac tcg gac gac tct aac gtg aca tgc acg gcc 192Cys Ser Asn Asn Ile Asp Ser Asp Asp Ser Asn Val Thr Cys Thr Ala50 55 60gac gcc tgt cca tca gtc gag gag gcg agc acc aag atg ctg ctg gag 240Asp Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Thr Lys Met Leu Leu Glu65 70 75 80ttt gac ctg aca aat aac ttt gga ggc aca gcc ggt ttc ctg gcc gcg 288Phe Asp Leu Thr Asn Asn Phe Gly Gly Thr Ala Gly Phe Leu Ala Ala85 90 95gac aac acc aac aag cgg ctc gtg gtc gcc ttc cga ggc agt agc acc 336Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe Arg Gly Ser Ser Thr100 105 ll0atc aag aac tgg att gct gat ctc gac ttc atc ctg caa gat aac gat 384Ile Lys Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Ile Leu Gln Asp Asn Asp
115 120 125gac ctc tgt act ggc tgc aag gtt cac act gga ttc tgg aag gca tgg 432Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly Phe Trp Lys Ala Trp130 135 140gaa gcc gct gca gac aat ctg acg agc aag atc aag tcc gcg atg agc 480Glu Ala Ala Ala Asp Asn Leu Thr Ser Lys Ile Lys Ser Ala Met Ser145 150 155 160acg tat tcg ggc tat acc ctc tac ttc acc ggg cac agc ttg ggc ggc 528Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly165 170 175gca ttg gct aca ctg gga gca acg gtc ttg cga aat gac ggt tat agc 576Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg Asn Asp Gly Tyr Ser180 185 190gtt gaa ctg tac acc tat gga tgt cct cga gtc gga aac tat gcg ctg 624Val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Tyr Ala Leu195 200 205gcc gag cac atc acc agc cag gga tct gga gcg aac ttc cgc gtt aca 672Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala Asn Phe Arg Val Thr210 215 220cac ttg aac gac atc gtc ccc cgg ttg cca ccc atg gac ttt gga ttc 720His Leu Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro Met Asp Phe Gly Phe225 230 235 240agc cag cca agt cca gaa tac tgg atc acc agt ggc acc gga gcc agt 768Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Thr Gly Ala Ser245 250 255gtc acg gcg tcg gat att gaa ctc atc gag gga atc aat tcg acg gcg 816Val Thr Ala Ser Asp Ile Glu Leu Ile Glu Gly Ile Asn Ser Thr Ala260 265 270ggg aat gca ggc gaa gca acg gtg gac gtt ttg gct cac ttg tgg tac 864Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Asp Val Leu Ala His Leu Trp Tyr275 280 285ttt ttc gca att tca gag tgt ctg cta tag 894Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu Leu290 295<210>6<211>297<212>PRT<213>黑曲霉<400>6Met Phe Ser Gly Arg Phe Gly Val Leu Leu Thr Ala Leu Ala Ala Leu1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Thr Pro Leu Asp Val Arg Ser Val Ser Thr Ser20 25 30Thr Leu Asp Glu Leu Gln Leu Phe Ser Gln Trp Ser Ala Ala Ala Tyr35 40 45Cys Ser Asn Asn Ile Asp Ser Asp Asp Ser Asn Val Thr Cys Thr Ala50 55 60Asp Ala Cys Pro Ser Val Glu Glu Ala Ser Thr Lys Met Leu Leu Glu65 70 75 80Phe Asp Leu Thr Asn Asn Phe Gly Gly Thr Ala Gly Phe Leu Ala Ala85 90 95Asp Asn Thr Asn Lys Arg Leu Val Val Ala Phe Arg Gly Ser Ser Thr100 105 110Ile Lys Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Ile Leu Gln Asp Asn Asp115 120 125Asp Leu Cys Thr Gly Cys Lys Val His Thr Gly Phe Trp Lys Ala Trp130 135 140Glu Ala Ala Ala Asp Asn Leu Thr Ser Lys Ile Lys Ser Ala Met Ser145 150 155 160Thr Tyr Ser Gly Tyr Thr Leu Tyr Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly165 170 175Ala Leu Ala Thr Leu Gly Ala Thr Val Leu Arg Asn Asp Gly Tyr Ser180 185 190Val Glu Leu Tyr Thr Tyr Gly Cys Pro Arg Val Gly Asn Tyr Ala Leu195 200 205Ala Glu His Ile Thr Ser Gln Gly Ser Gly Ala Asn Phe Arg Val Thr210 215 220His Leu Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro Met Asp Phe Gly Phe225 230 235 240Ser Gln Pro Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Thr Gly Ala Ser245 250 255Val Thr Ala Ser Asp Ile Glu Leu Ile Glu Gly Ile Asn Ser Thr Ala260 265 270Gly Asn Ala Gly Glu Ala Thr Val Asp Val Leu Ala His Leu Trp Tyr275 280 285Phe Phe Ala Ile Ser Glu Cys Leu Leu290 295<210>7<211>3478<212>DNA<213>黑曲霉<400>7
ttgctgtata tttggtttta ctagaagaaa gtttaattct gttagttggt gttcttgtgt 60gctctcatgt ggctgacttg agaagactca aatgttggat gtctgtcaga gtaagctgac 120gttgtttccg gcgaagtttt cctctagttg catagttacc ctgctcaccc gaagttaatt 180gcattagacc agaagttgga cacgagcgaa ccacagcaga gctgactgca gcaagccttt 240gctgcgcacc tcagccttct ggttccgtgg actccatccg tcagctccgg acccactgat 300cgctgtgaca tcagggtcct tgtgtgaatg tataccaggg cccttgcggg tctcttatcc 360ctgagtagtt gtaacgtaaa tgccttaatg cgttcaaagc aaatgattca ctcacaattg 420gtgagtacca catgggagtt ttcagaatct agcaaaaagc ctaacaagca gtgtgtcgcc 480caagatcgat cccgtgtgaa ccatcatcca tgttcggctt accaacttta atcctcagct 540actactctct gactgccagt tcagctacgg aattgccggt ttaaatcagc ctccacatgt 600agtgtcccga accatggact gcaattcaat gccatcttcg cttcagaccc tccaatcatc 660tatcaaagat ccatggttct ccagaccgca agcaacgagg tcactatgat caccaccaag 720acttcggtac cattcttaat gcttgacaag taatggcata tctactaccg aggccctcgg 780ctgcgcagca accttggtcg ggttggaaat tcgaagtggt cgctctttct tgctgtgaag 840acgtcgggga gagctgtact tcaccatccc aacccattgg cttcctctag aaaacagtag 900ccgtatatta cttgctagca tgcagtgcat agcagcttta cttgcctttg caagcatatt 960gtcaggtttg tcattgtcat ttccagtttc aatttcacca ttgcaccctt ccgcagcttc 1020cggagctggt ctaaccgcag agttccatag gcgtaagtgc tagcttcaac aatgagtacg 1080gcagacactt gatgcagcag cgcgcgctac caaatgcgcc tgatggatat acaccaacta 1140cggtcgggtg ctctgcgagt cgtcccactg tgcgcagtgc gacagcactc tcgtcgaacg 1200aatcgtcatg gctaaggact cggaggaaca atacactgtc ggccatgaga gaattcttcg 1260gtcgcgtcaa cattacagac tttgacgctg tggggtatat caatcgcatc tctagcaaca 1320cctccgattt gccgaatatt ggcattgctg tctctggtgg agggtaccgg gctctgatga 1380acggtgctgg ggcaatcaag gcttttgata atcgtacagt caattctaca agcaatggtc 1440agctgggtgg actgctgcaa tcagcaacat atctggccgg cctcagtggt ggggcatggt 1500tggtgggatc tatctacttg aataatttct ccaccatctc gtcgcttcag acctacgatc 1560ctggtgatgt ctggcagttc cagaactcga tctttgaagg ccccgacggg gatagtatcc 1620aaattataga ttctgcaacc tactacagag atatttatga cgcagtgtct ggaaaggatg 1680atgcaggttg gcagacatcc atcactgatt actggtatga gtcctagccc aattctcgcc 1740cagcagcgat actgatgccc accaggggcc gcgcgctctc ataccagctc gtcaacgcca 1800ccgccggagg aatcaactac acctggtcat ccatagctct gaccgactcc ttcaggaggg 1860cagaaatgcc aatgcccgtg ctagtcgcag acggccgata cccagacgag ctcctagtca 1920gcagcaatgc cacagtctac gaattcaacc cctgggaatt cggcaccttt gacccaacgg 1980tacacggctt cgtgcccgtt cagtatctgg gctcacgctt cgtagccgga tcccttccca 2040gcaacgaaag ctgcgtccgc gggtttgaca atggcggctt tattatggga acctcatcca 2100ccttattcaa ccaattcctt cttcaaatca acacaactag cctccccagc ttcctgaaag 2160acgcatttac aagcatccta gaagatctcg gcgaaaacag ccaagacata gcagtttaca 2220cccccaaccc gttctatctc tgggccaatt ccacctcccc atccgcaagc caaacagtcc 2280tcgacctcgt ggatggcggc gaagacctcc aaaacatccc cttacatcca ctcatccagc 2340cagagcgcca tgtggacgtc atctttgccg tggactcctc cgcagacacg cagtataact 2400ggcccaacgg caccgcatta gtcgccacct acgagcgcag cctaaactct acgggcatcg 2460gcaatgggac agctttccct gctatccccg accaaaatac ttttgtcaat gagggtctca 2520atacgcgacc aacgttcttc gggtgcaact catcgaatac cactgggcca gcaccgttag 2580ttgtttacct tcctaacttt ccgtatgtga ctttttcgaa cgtgtcgacg tttgatccga 2640
gttactcgga gtcgcagagg gatagtatta tccttaatgg gtatgatgtg gccacgatgg 2700ggaataatag tcgcgatggg gaatggtctt cttgtgttgc gtgtgctgtt ttgagtcggt 2760cttttgaacg gactaacact acggtgccgg atcagtgtag ccggtgcttt gagaggtact 2820gctgggatgg tactacgaat agttcgactc cgggtactta tgagcccagt acggtatttg 2880ataatgctgg gtatgctgta atgcctgctg ttttcgcgac tacgatggct gctgcgactg 2940tttcggcgtt tatgtaggac attttccgct gttcagggtg tatgtatagt gagattgata 3000ggaacagaaa agtcaatgca tagtaggttt atatgaagaa agtatataat tgtgcaattc 3060aaggcattcc atgaaatgca ggagtgattg acgtgctcga ctccggatga ggcagcccac 3120ttccctcacg tgtcgcgtta ccaggggaac caccgcccga tcgcccaaac aagcaagcgg 3180cacaaacagg agcgtccact cgggcgactt cgatgatcgg cctccactgc taactagtca 3240acaaccacgc caactcgacc accaccatcc cctgcttact ttaaccctgc atacaagctt 3300ccggggttaa agcaagtgat tgttcactta tcgccagtgg acgcacaatg agcacggcaa 3360ttcagtactg agtccccgct gccaccgaca caccacaaca gaagcgggac atcaacaaca 3420ccacctccga cctcccgcgc ggtagcattt accgactccg aatattgatc agcacaca 3478<210>8<211>1902<212>DNA<213>黑曲霉<220>
<221>CDS<222>(1)..(1902)<400>8atg cag tgc ata gca gct tta ctt gcc ttt gca agc ata ttg tca ggc 48Met Gln Cys Ile Ala Ala Leu Leu Ala Phe Ala Ser Ile Leu Ser Gly1 5 10 15gta agt gct agc ttc aac aat gag tac ggc aga cac ttg atg cag cag 96Val Ser Ala Ser Phe Asn Asn Glu Tyr Gly Arg His Leu Met Gln Gln20 25 30cgc gcg cta cca aat gcg cct gat gga tat aca cca act acg gtc ggg 144Arg Ala Leu Pro Asn Ala Pro Asp Gly Tyr Thr Pro Thr Thr Val Gly35 40 45tgc tct gcg agt cgt ccc act gtg cgc agt gcg aca gca ctc tcg tcg 192Cys Ser Ala Ser Arg Pro Thr Val Arg Ser Ala Thr Ala Leu Ser Ser50 55 60aac gaa tcg tca tgg cta agg act cgg agg aac aat aca ctg tcg gcc 240Asn Glu Ser Ser Trp Leu Arg Thr Arg Arg Asn Asn Thr Leu Ser Ala65 70 75 80atg aga gaa ttc ttc ggt cgc gtc aac att aca gac ttt gac gct gtg 288Met Arg Glu Phe Phe Gly Arg Val Asn Ile Thr Asp Phe Asp Ala Val85 90 95
ggg tat atc aat cgc atc tct agc aac acc tcc gat ttg ccg aat att 336Gly Tyr Ile Asn Arg Ile Ser Ser Asn Thr Ser Asp Leu Pro Asn Ile100 105 110ggc att gct gtc tct ggt gga ggg tac cgg gct ctg atg aac ggt gct 384Gly Ile Ala Val Ser Gly Gly Gly Tyr Arg Ala Leu Met Asn Gly Ala115 120 125ggg gca atc aag gct ttt gat aat cgt aca gtc aat tct aca agc aat 432Gly Ala Ile Lys Ala Phe Asp Asn Arg Thr Val Asn Ser Thr Ser Asn130 135 140ggt cag ctg ggt gga ctg ctg caa tca gca aca tat ctg gcc ggc ctc 480Gly Gln Leu Gly Gly Leu Leu Gln Ser Ala Thr Tyr Leu Ala Gly Leu145 150 155 160agt ggt ggg gca tgg ttg gtg gga tct atc tac ttg aat aat ttc tcc 528Ser Gly Gly Ala Trp Leu Val Gly Ser Ile Tyr Leu Asn Asn Phe Ser165 170 175acc atc tcg tcg ctt cag acc tac gat cct ggt gat gtc tgg cag ttc 576Thr Ile Ser Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Pro GIy Asp Val Trp Gln Phe180 185 190cag aac tcg atc ttt gaa ggc ccc gac ggg gat agt atc caa att ata 624Gln Asn Ser Ile Phe Glu Gly Pro Asp Gly Asp Ser Ile Gln Ile Ile195 200 205gat tct gca acc tac tac aga gat att tat gac gca gtg tct gga aag 672Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Arg Asp Ile Tyr Asp Ala Val Ser Gly Lys210 215 220gat gat gca ggt tgg cag aca tcc atc act gat tac tgg ggc cgc gcg 720Asp Asp Ala Gly Trp Gln Thr Ser Ile Thr Asp Tyr Trp Gly Arg Ala225 230 235 240ctc tca tac cag ctc gtc aac gcc acc gcc gga gga atc aac tac acc 768Leu Ser Tyr Gln Leu Val Asn Ala Thr Ala Gly Gly Ile Asn Tyr Thr245 250 255tgg tca tcc ata gct ctg acc gac tcc ttc agg agg gca gaa atg cca 816Trp Ser Ser Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Arg Arg Ala Glu Met Pro260 265 270atg ccc gtg cta gtc gca gac ggc cga tac cca gac gag ctc cta gtc 864Met Pro Val Leu Val Ala Asp Gly Arg Tyr Pro Asp Glu Leu Leu Val275 280 285agc agc aat gcc aca gtc tac gaa ttc aac ccc tgg gaa ttc ggc acc 912Ser Ser Asn Ala Thr Val Tyr Glu Phe Asn Pro Trp Glu Phe Gly Thr290 295 300ttt gac cca acg gta cac ggc ttc gtg ccc gtt cag tat ctg ggc tca 960Phe Asp Pro Thr Val His Gly Phe Val Pro Val Gln Tyr Leu Gly Ser305 310 315 320cgc ttc gta gcc gga tcc ctt ccc agc aac gaa agc tgc gtc cgc ggg 1008Arg Phe Val Ala Gly Ser Leu Pro Ser Asn Glu Ser Cys Val Arg Gly
325 330 335ttt gac aat ggc ggc ttt att atg gga acc tca tcc acc tta ttc aac 1056Phe Asp Asn Gly Gly Phe Ile Met Gly Thr Ser Ser Thr Leu Phe Asn340 345 350caa ttc ctt ctt caa atc aac aca act agc ctc ccc agc ttc ctg aaa 1104Gln Phe Leu Leu Gln Ile Asn Thr Thr Ser Leu Pro Ser Phe Leu Lys355 360 365gac gca ttt aca agc atc cta gaa gat ctc ggc gaa aac agc caa gac 1152Asp Ala Phe Thr Ser Ile Leu Glu Asp Leu Gly Glu Asn Ser Gln Asp370 375 380ata gca gtt tac acc ccc aac ccg ttc tat ctc tgg gcc aat tcc acc 1200Ile Ala Val Tyr Thr Pro Asn Pro Phe Tyr Leu Trp Ala Asn Ser Thr385 390 395 400tcc cca tcc gca agc caa aca gtc ctc gac ctc gtg gat ggc ggc gaa 1248Ser Pro Ser Ala Ser Gln Thr Val Leu Asp Leu Val Asp Gly Gly Glu405 410 415gac ctc caa aac atc ccc tta cat cca ctc atc cag cca gag cgc cat 1296Asp Leu Gln Asn Ile Pro Leu His Pro Leu Ile Gln Pro Glu Arg His420 425 430gtg gac gtc atc ttt gcc gtg gac tcc tcc gca gac acg cag tat aac 1344Val Asp Val Ile Phe Ala Val Asp Ser Ser Ala Asp Thr Gln Tyr Asn435 440 445tgg ccc aac ggc acc gca tta gtc gcc acc tac gag cgc agc cta aac 1392Trp Pro Asn Gly Thr Ala Leu Val Ala Thr Tyr Glu Arg Ser Leu Asn450 455 460tct acg ggc atc ggc aat ggg aca gct ttc cct gct atc ccc gac caa 1440Ser Thr Gly Ile Gly Asn Gly Thr Ala Phe Pro Ala Ile Pro Asp Gln465 470 475 480aat act ttt gtc aat gag ggt ctc aat acg cga cca acg ttc ttc ggg 1488Asn Thr Phe Val Asn Glu Gly Leu Asn Thr Arg Pro Thr Phe Phe Gly485 490 495tgc aac tca tcg aat acc act ggg cca gca ccg tta gtt gtt tac ctt 1536Cys Asn Ser Ser Asn Thr Thr Gly Pro Ala Pro Leu Val Val Tyr Leu500 505 510cct aac ttt ccg tat gtg act ttt tcg aac gtg tcg acg ttt gat ccg 1584Pro Asn Phe Pro Tyr Val Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Phe Asp Pro515 520 525agt tac tcg gag tcg cag agg gat agt att atc ctt aat ggg tat gat 1632Ser Tyr Ser Glu Ser Gln Arg Asp Ser Ile Ile Leu Asn Gly Tyr Asp530 535 540gtg gcc acg atg ggg aat aat agt cgc gat ggg gaa tgg tct tct tgt 1680Val Ala Thr Met Gly Asn Asn Ser Arg Asp Gly Glu Trp Ser Ser Cys545 550 555 560gtt gcg tgt gct gtt ttg agt cgg tct ttt gaa cgg act aac act acg 1728
Val Ala Cys Ala Val Leu Ser Arg Ser Phe Glu Arg Thr Asn Thr Thr565 570 575gtg ccg gat cag tgt agc cgg tgc ttt gag agg tac tgc tgg gat ggt 1776Val Pro Asp Gln Cys Ser Arg Cys Phe Glu Arg Tyr Cys Trp Asp Gly580 585 590act acg aat agt tcg act ccg ggt act tat gag ccc agt acg gta ttt 1824Thr Thr Asn Ser Ser Thr Pro Gly Thr Tyr Glu Pro Ser Thr Val Phe595 600 605gat aat gct ggg tat gct gta atg cct gct gtt ttc gcg act acg atg 1872Asp Asn Ala Gly Tyr Ala Val Met Pro Ala Val Phe Ala Thr Thr Met610 615 620gct gct gcg act gtt tcg gcg ttt atg tag 1902Ala Ala Ala Thr Val Ser Ala Phe Met625 630<210>9<211>633<212>PRT<213>黑曲霉<400>9Met Gln Cys Ile Ala Ala Leu Leu Ala Phe Ala Ser Ile Leu Ser Gly1 5 10 l5Val Ser Ala Ser Phe Asn Asn Glu Tyr Gly Arg His Leu Met Gln Gln20 25 30Arg Ala Leu Pro Asn Ala Pro Asp Gly Tyr Thr Pro Thr Thr Val Gly35 40 45Cys Ser Ala Ser Arg Pro Thr Val Arg Ser Ala Thr Ala Leu Ser Ser50 55 60Asn Glu Ser Ser Trp Leu Arg Thr Arg Arg Asn Asn Thr Leu Ser Ala65 70 75 80Met Arg Glu Phe Phe Gly Arg Val Asn Ile Thr Asp Phe Asp Ala Val85 90 95Gly Tyr Ile Asn Arg Ile Ser Ser Asn Thr Ser Asp Leu Pro Asn Ile100 105 110Gly Ile Ala Val Ser Gly Gly Gly Tyr Arg Ala Leu Met Asn Gly Ala115 120 125Gly Ala Ile Lys Ala Phe Asp Asn Arg Thr Val Asn Ser Thr Ser Asn130 135 140Gly Gln Leu Gly Gly Leu Leu Gln Ser Ala Thr Tyr Leu Ala Gly Leu145 150 155 160Ser Gly Gly Ala Trp Leu Val Gly Ser Ile Tyr Leu Asn Asn Phe Ser165 170 175
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Pro Gly Asp Val Trp Gln Phe180 185 190Gln Asn Ser Ile Phe Glu Gly Pro Asp Gly Asp Ser Ile Gln Ile Ile195 200 205Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Arg Asp Ile Tyr Asp Ala Val Ser Gly Lys210 215 220Asp Asp Ala Gly Trp Gln Thr Ser Ile Thr Asp Tyr Trp Gly Arg Ala225 230 235 240Leu Ser Tyr Gln Leu Val Asn Ala Thr Ala Gly Gly Ile Asn Tyr Thr245 250 255Trp Ser Ser Ile Ala Leu Thr Asp Ser Phe Arg Arg Ala Glu Met Pro260 265 270Met Pro Val Leu Val Ala Asp Gly Arg Tyr Pro Asp Glu Leu Leu Val275 280 285Ser Ser Asn Ala Thr Val Tyr Glu Phe Asn Pro Trp Glu Phe Gly Thr290 295 300Phe Asp Pro Thr Val His Gly Phe Val Pro Val Gln Tyr Leu Gly Ser305 310 315 320Arg Phe Val Ala Gly Ser Leu Pro Ser Asn Glu Ser Cys Val Arg Gly325 330 335Phe Asp Asn Gly Gly Phe Ile Met Gly Thr Ser Ser Thr Leu Phe Asn340 345 350Gln Phe Leu Leu Gln Ile Asn Thr Thr Ser Leu Pro Ser Phe Leu Lys355 360 365Asp Ala Phe Thr Ser Ile Leu Glu Asp Leu Gly Glu Asn Ser Gln Asp370 375 380Ile Ala Val Tyr Thr Pro Asn Pro Phe Tyr Leu Trp Ala Asn Ser Thr385 390 395 400Ser Pro Ser Ala Ser Gln Thr Val Leu Asp Leu Val Asp Gly Gly Glu405 410 415Asp Leu Gln Asn Ile Pro Leu His Pro Leu Ile Gln Pro Glu Arg His420 425 430Val Asp Val Ile Phe Ala Val Asp Ser Ser Ala Asp Thr Gln Tyr Asn435 440 445Trp Pro Asn Gly Thr Ala Leu Val Ala Thr Tyr Glu Arg Ser Leu Asn450 455 460Ser Thr Gly Ile Gly Asn Gly Thr Ala Phe Pro Ala Ile Pro Asp Gln465 470 475 480Asn Thr Phe Val Asn Glu Gly Leu Asn Thr Arg Pro Thr Phe Phe Gly485 490 495Cys Asn Ser Ser Asn Thr Thr Gly Pro Ala Pro Leu Val Val Tyr Leu500 505 510Pro Asn Phe Pro Tyr Val Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Phe Asp Pro515 520 525
Ser Tyr Ser Glu Ser Gln Arg Asp Ser Ile Ile Leu Asn Gly Tyr Asp530 535 540Val Ala Thr Met Gly Asn Asn Ser Arg Asp Gly Glu Trp Ser Ser Cys545 550 555 560Val Ala Cys Ala Val Leu Ser Arg Ser Phe Glu Arg Thr Asn Thr Thr565 570 575Val Pro Asp Gln Cys Ser Arg Cys Phe Glu Arg Tyr Cys Trp Asp Gly580 585 590Thr Thr Asn Ser Ser Thr Pro Gly Thr Tyr Glu Pro Ser Thr Val Phe595 600 605Asp Asn Ala Gly Tyr Ala Val Met Pro Ala Val Phe Ala Thr Thr Met610 615 620Ala Ala Ala Thr Val Ser Ala Phe Met625 630<210>10<211>2292<212>DNA<213>黑曲霉<400>10cacagctgga cagaatggct ggccttgaat gctatatgca atacaggcaa caacacctcg 60atctgaatat agtatccaga ggcttgttta acgcatgatg tcatataatt aaatatatat 120atataatgat cggtaccttc cagccataac accaacttca gcagcaacaa tttcaattct 180cttgcagtcc caaaagtctc gttgcaatgc tgtcgctttt aatatcagca gcagctgcca 240ctctcgcatc tgccctggaa cttccccagg gttattcccc ggatcctgtc tcttgcccaa 300caaatctttc atggatccga ccggcagttg gactcagcag agatgaagcg caatgggttg 360aagggcggaa gaatgtcatc ctgggctcat tagacgcata tttgaaacga ctcaacctgg 420cgacttcga cacagacgaa tacatatcgc gtctcaacaa caccagtcag accccaatca 480tgggaatggc catcagtgga ggaggtttcg gatccgccta caccgggact ggtctaatcc 540gtgctttgga tgaccgtctt cccgcagcca acgagcaacg taccggtgga cttctacaaa 600gcatgaccta tctgtctggt ttgtctggag gatcctggcc cgcagtgtcc ttcccatcat 660acaactttcc caccgcagac gagattgtcg attactggaa accggagatt gaccgattct 720tcacggtcac gaacacctct gctgaagctg ctactggaaa ggccatcttt gaacagattg 780ctacgaagta cctggctggc ttcgaggtag cgctaagtga ttatctagga cgaggatttg 840cgtacgagtt cattcccgga caatccggcg gcctaaacac cacgttttcg gggatccgga 900atctaagcaa ttttatcaat catcaaatgc cgatgcctat cattcatctg gcttcagttg 960aaccggaaga tgcagagtac tacgaccttt tggtgccgtc atctaatgga acgattgtaa 1020gtagtgcttc ttctcgataa actaccagct ccagctaacg cggtctagtt tgatttgact 1080cccttcgaat tcggcgcctg ggacggagac gtgcatgcat ttacacccac tgagtggctc 1140ggaaaccaac tatccaacgg tattcccgta aaccagagca aatgctggaa aggatttgat 1200cgatcctcgt aagtaacagt atggccccag cctcgcacgc ttctaacttc atcccagact 1260tgtcatcggc acctccgccg acgccttcaa cttctggtac ctcgaaagcg tctccaacgg 1320
aacccttggc caatttgcca aacgctccac cactcacgag tcctctctca ccaaacgatt 1380gtcccaacct gccaacctga acgcactcgt tgacgccttc caagagacct ttgatctaaa 1440cctaacccaa atctcctact cgaaattccc caacccattc accaacctat ccctctctac 1500cggtaatacc cacaaatcct caaccctaaa cctcgtcgac ggcagcgaaa caggccaaac 1560aatccccctc tggggccaga tccagcccgc gcgcaacgtc gacttcatca tagcctggga 1620cgactcccaa gacgcagacc cctacagctg gaacaacggc acaaacctct acaacacgta 1680cctcgccgcc aacgcaacag ggcttccctt tccgataatc ccaccctcca gaacaatgat 1740gaacctgaat tacactctcc atccacaatt cttcggctgc gacgccaacc tcaccaccac 1800aggcgacgac cgcgcaccta tcgtgctgta tatggctaat gcgccgtata gcgcatacac 1860gaacttctcg ttctggcaga cggagacgag tcggcagcaa atgggggaga tattcgtgaa 1920tagttttgat attgttacgc aagcgaatgg gtcgtgggat ggggagtggg cggagtgtat 1980ggggtgtgcg gctgtggaaa gaagtttggc gcgcgtgggc atggagagga cgaggcagtg 2040tcagcggtgc tttgagaggt attgttggga tgggacactt gatgagaggg atcctggggt 2100gttggatccg acgttagttt tggatccggg ggtgaagttt gggttgtgga atgctacgaa 2160tccttattga tgctggtttt ggagttacag ggggaggctg gtctgggaag gtatagtact 2220taggctttgt ggatgaaaga aatatgtgat atttggcaag ttcaccctat agacccatct 2280gatctttttt tg 2292<210>11<211>1863<212>DNA<213>黑曲霉<220>
<221>CDS<222>(1)..(1863)<400>11atg ctg tcg ctt tta ata tca gca gca gct gcc act ctc gca tct gcc 48Met Leu Ser Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ala Ala Thr Leu Ala Ser Ala1 5 10 15ctg gaa ctt ccc cag ggt tat tcc ccg gat cct gtc tct tgc cca aca 96Leu Glu Leu Pro Gln Gly Tyr Ser Pro Asp Pro Val Ser Cys Pro Thr20 25 30aat ctt tca tgg atc cga ccg gca gtt gga ctc agc aga gat gaa gcg 144Asn Leu Ser Trp Ile Arg Pro Ala Val Gly Leu Ser Arg Asp Glu Ala35 40 45caa tgg gtt gaa ggg cgg aag aat gtc atc ctg ggc tca tta gac gca 192Gln Trp Val Glu Gly Arg Lys Asn Val Ile Leu Gly Ser Leu Asp Ala50 55 60tat ttg aaa cga ctc aac ctg gac gac ttc gac aca gac gaa tac ata 240Tyr Leu Lys Arg Leu Asn Leu Asp Asp Phe Asp Thr Asp Glu Tyr Ile65 70 75 80
tcg cgt ctc aac aac acc agt cag acc cca atc atg gga atg gcc atc 288Ser Arg Leu Asn Asn Thr Ser Gln Thr Pro Ile Met Gly Met Ala Ile85 90 95agt gga gga ggt ttc gga tcc gcc tac acc ggg act ggt cta atc cgt 336Ser Gly Gly Gly Phe Gly Ser Ala Tyr Thr Gly Thr Gly Leu Ile Arg100 105 110gct ttg gat gac cgt ctt ccc gca gcc aac gag caa cgt acc ggt gga 384Ala Leu Asp Asp Arg Leu Pro Ala Ala Asn Glu Gln Arg Thr Gly Gly115 120 125ctt cta caa agc atg acc tat ctg tct ggt ttg tct gga gga tcc tgg 432Leu Leu Gln Ser Met Thr Tyr Leu Ser Gly Leu Ser Gly Gly Ser Trp130 135 140ccc gca gtg tcc ttc cca tca tac aac ttt ccc acc gca gac gag att 480Pro Ala Val Ser Phe Pro Ser Tyr Asn Phe Pro Thr Ala Asp Glu Ile145 150 155 160gtc gat tac tgg aaa ccg gag att gac cga ttc ttc acg gtc acg aac 528Val Asp Tyr Trp Lys Pro Glu Ile Asp Arg Phe Phe Thr Val Thr Asn165 170 175acc tct gct gaa gct gct act gga aag gcc atc ttt gaa cag att gct 576Thr Ser Ala Glu Ala Ala Thr Gly Lys Ala Ile Phe Glu Gln Ile Ala180 185 190acg aag tac ctg gct ggc ttc gag gta gcg cta agt gat tat cta gga 624Thr Lys Tyr Leu Ala Gly Phe Glu Val Ala Leu Ser Asp Tyr Leu Gly195 200 205cga gga ttt gcg tac gag ttc att ccc gga caa tcc ggc ggc cta aac 672Arg Gly Phe Ala Tyr Glu Phe Ile Pro Gly Gln Ser Gly Gly Leu Asn210 215 220acc acg ttt tcg ggg atc cgg aat cta agc aat ttt atc aat cat caa 720Thr Thr Phe Ser Gly Ile Arg Asn Leu Ser Asn Phe Ile Asn His Gln225 230 235 240atg ccg atg cct atc att cat ctg gct tca gtt gaa ccg gaa gat gca 768Met Pro Met Pro Ile Ile His Leu Ala Ser Val Glu Pro Glu Asp Ala245 250 255gag tac tac gac ctt ttg gtg ccg tca tct aat gga acg att ttt gat 816Glu Tyr Tyr Asp Leu Leu Val Pro Ser Ser Asn Gly Thr Ile Phe Asp260 265 270ttg act ccc ttc gaa ttc ggc gcc tgg gac gga gac gtg cat gca ttt 864Leu Thr Pro Phe Glu Phe Gly Ala Trp Asp Gly Asp Val His Ala Phe275 280 285aca ccc act gag tgg ctc gga aac caa cta tcc aac ggt att ccc gta 912Thr Pro Thr Glu Trp Leu Gly Asn Gln Leu Ser Asn Gly Ile Pro Val290 295 300aac cag agc aaa tgc tgg aaa gga ttt gat cga tcc tca ctt gtc atc 960Asn Gln Ser Lys Cys Trp Lys Gly Phe Asp Arg Ser Ser Leu Val Ile
305 310 315 320ggc acc tcc gcc gac gcc ttc aac ttc tgg tac ctc gaa agc gtc tcc 1008Gly Thr Ser Ala Asp Ala Phe Asn Phe Trp Tyr Leu Glu Ser Val Ser325 330 335aac gga acc ctt ggc caa ttt gcc aaa cgc tcc acc act cac gag tcc 1056Asn Gly Thr Leu Gly Gln Phe Ala Lys Arg Ser Thr Thr His Glu Ser340 345 350tct ctc acc aaa cga ttg tcc caa cct gcc aac ctg aac gca ctc gtt 1104Ser Leu Thr Lys Arg Leu Ser Gln Pro Ala Asn Leu Asn Ala Leu Val355 360 365gac gcc ttc caa gag acc ttt gat cta aac cta acc caa atc tcc tac 1152Asp Ala Phe Gln Glu Thr Phe Asp Leu Asn Leu Thr Gln Ile Ser Tyr370 375 380tcg aaa ttc ccc aac cca ttc acc aac cta tcc ctc tct acc ggt aat 1200Ser Lys Phe Pro Asn Pro Phe Thr Asn Leu Ser Leu Ser Thr Gly Asn385 390 395 400acc cac aaa tcc tca acc cta aac ctc gtc gac ggc agc gaa aca ggc 1248Thr His Lys Ser Ser Thr Leu Asn Leu Val Asp Gly Ser Glu Thr Gly405 410 415caa aca atc ccc ctc tgg ggc cag atc cag ccc gcg cgc aac gtc gac 1296Gln Thr Ile Pro Leu Trp Gly Gln Ile Gln Pro Ala Arg Asn Val Asp420 425 430ttc atc ata gcc tgg gac gac tcc caa gac gca gac ccc tac agc tgg 1344Phe Ile Ile Ala Trp Asp Asp Ser Gln Asp Ala Asp Pro Tyr Ser Trp435 440 445aac aac ggc aca aac ctc tac aac acg tac ctc gcc gcc aac gca aca 1392Asn Asn Gly Thr Asn Leu Tyr Asn Thr Tyr Leu Ala Ala Asn Ala Thr450 455 460ggg ctt ccc ttt ccg ata atc cca ccc tcc aga aca atg atg aac ctg 1440Gly Leu Pro Phe Pro Ile Ile Pro Pro Ser Arg Thr Met Met Asn Leu465 470 475 480aat tac act ctc cat cca caa ttc ttc ggc tgc gac gcc aac ctc acc 1488Asn Tyr Thr Leu His Pro Gln Phe Phe Gly Cys Asp Ala Asn Leu Thr485 490 495acc aca ggc gac gac cgc gca cct atc gtg ctg tat atg gct aat gcg 1536Thr Thr Gly Asp Asp Arg Ala Pro Ile Val Leu Tyr Met Ala Asn Ala500 505 510ccg tat agc gca tac acg aac ttc tcg ttc tgg cag acg gag acg agt 1584Pro Tyr Ser Ala Tyr Thr Asn Phe Ser Phe Trp Gln Thr Glu Thr Ser515 520 525cgg cag caa atg ggg gag ata ttc gtg aat agt ttt gat att gtt acg 1632Arg Gln Gln Met Gly Glu Ile Phe Val Asn Ser Phe Asp Ile Val Thr530 535 540caa gcg aat ggg tcg tgg gat ggg gag tgg gcg gag tgt atg ggg tgt 1680
Gln Ala Asn Gly Ser Trp Asp Gly Glu Trp Ala Glu Cys Met Gly Cys545 550 555 560gcg gct gtg gaa aga agt ttg gcg cgc gtg ggc atg gag agg acg agg 1728Ala Ala Val Glu Arg Ser Leu Ala Arg Val Gly Met Glu Arg Thr Arg565 570 575cag tgt cag cgg tgc ttt gag agg tat tgt tgg gat ggg aca ctt gat 1776Gln Cys Gln Arg Cys Phe Glu Arg Tyr Cys Trp Asp Gly Thr Leu Asp580 585 590gag agg gat cct ggg gtg ttg gat ccg acg tta gtt ttg gat ccg ggg 1824Glu Arg Asp Pro Gly Val Leu Asp Pro Thr Leu Val Leu Asp Pro Gly595 600 605gtg aag ttt ggg ttg tgg aat gct acg aat cct tat tga 1863Val Lys Phe Gly Leu Trp Asn Ala Thr Asn Pro Tyr610 615 620<210>12<211>620<212>PRT<213>黑曲霉<400>12Met Leu Ser Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ala Ala Thr Leu Ala Ser Ala1 5 10 15Leu Glu Leu Pro Gln Gly Tyr Ser Pro Asp Pro Val Ser Cys Pro Thr20 25 30Asn Leu Ser Trp Ile Arg Pro Ala Val Gly Leu Ser Arg Asp Glu Ala35 40 45Gln Trp Val Glu Gly Arg Lys Asn Val Ile Leu Gly Ser Leu Asp Ala50 55 60Tyr Leu Lys Arg Leu Asn Leu Asp Asp Phe Asp Thr Asp Glu Tyr Ile65 70 75 80Ser Arg Leu Asn Asn Thr Ser Gln Thr Pro Ile Met Gly Met Ala Ile85 90 95Ser Gly Gly Gly Phe Gly Ser Ala Tyr Thr Gly Thr Gly Leu Ile Arg100 105 110Ala Leu Asp Asp Arg Leu Pro Ala Ala Asn Glu Gln Arg Thr Gly Gly115 120 125Leu Leu Gln Ser Met Thr Tyr Leu Ser Gly Leu Ser Gly Gly Ser Trp130 135 140Pro Ala Val Ser Phe Pro Ser Tyr Asn Phe Pro Thr Ala Asp Glu Ile145 150 155 160Val Asp Tyr Trp Lys Pro Glu Ile Asp Arg Phe Phe Thr Val Thr Asn165 170 175
Thr Ser Ala Glu Ala Ala Thr Gly Lys Ala Ile Phe Glu Gln Ile Ala180 185 190Thr Lys Tyr Leu Ala Gly Phe Glu Val Ala Leu Ser Asp Tyr Leu Gly195 200 205Arg Gly Phe Ala Tyr Glu Phe Ile Pro Gly Gln Ser Gly Gly Leu Asn210 215 220Thr Thr Phe Ser Gly Ile Arg Asn Leu Ser Asn Phe Ile Asn His Gln225 230 235 240Met Pro Met Pro Ile Ile His Leu Ala Ser Val Glu Pro Glu Asp Ala245 250 255Glu Tyr Tyr Asp Leu Leu Val Pro Ser Ser Asn Gly Thr Ile Phe Asp260 265 270Leu Thr Pro Phe Glu Phe Gly Ala Trp Asp Gly Asp Val His Ala Phe275 280 285Thr Pro Thr Glu Trp Leu Gly Asn Gln Leu Ser Asn Gly Ile Pro Val290 295 300Asn Gln Ser Lys Cys Trp Lys Gly Phe Asp Arg Ser Ser Leu Val Ile305 310 315 320Gly Thr Ser Ala Asp Ala Phe Asn Phe Trp Tyr Leu Glu Ser Val Ser325 330 335Asn Gly Thr Leu Gly Gln Phe Ala Lys Arg Ser Thr Thr His Glu Ser340 345 350Ser Leu Thr Lys Arg Leu Ser Gln Pro Ala Asn Leu Asn Ala Leu Val355 360 365Asp Ala Phe Gln Glu Thr Phe Asp Leu ASn Leu Thr Gln Ile Ser Tyr370 375 380Ser Lys Phe Pro Asn Pro Phe Thr Asn Leu Ser Leu Ser Thr Gly Asn385 390 395 400Thr His Lys Ser Ser Thr Leu Asn Leu Val Asp Gly Ser Glu Thr Gly405 410 415Gln Thr Ile Pro Leu Trp Gly Gln Ile Gln Pro Ala Arg Asn Val Asp420 425 430Phe Ile Ile Ala Trp Asp Asp Ser Gln Asp Ala Asp Pro Tyr Ser Trp435 440 445Asn Asn Gly Thr Asn Leu Tyr Asn Thr Tyr Leu Ala Ala Asn Ala Thr450 455 460Gly Leu Pro Phe Pro Ile Ile Pro Pro Ser Arg Thr Met Met Asn Leu465 470 475 480Asn Tyr Thr Leu His Pro Gln Phe Phe Gly Cys Asp Ala Asn Leu Thr485 490 495Thr Thr Gly Asp Asp Arg Ala Pro Ile Val Leu Tyr Met Ala Asn Ala500 505 510Pro Tyr Ser Ala Tyr Thr Asn Phe Ser Phe Trp Gln Thr Glu Thr Ser515 520 525
Arg Gln Gln Met Gly Glu Ile Phe Val Asn Ser Phe Asp Ile Val Thr530 535 540Gln Ala Asn Gly Ser Trp Asp Gly Glu Trp Ala Glu Cys Met Gly Cys545 550 555 560Ala Ala Val Glu Arg Ser Leu Ala Arg Val Gly Met Glu Arg Thr Arg565 570 575Gln Cys Gln Arg Cys Phe Glu Arg Tyr Cys Trp Asp Gly Thr Leu Asp580 585 590Glu Arg Asp Pro Gly Val Leu Asp Pro Thr Leu Val Leu Asp Pro Gly595 600 605Val Lys Phe Gly Leu Trp Asn Ala Thr Asn Pro Tyr610 615 620<210>13<211>3637<212>DNA<213>黑曲霉<400>13ccggatgaaa atgagacatg gctaaggtga tcggatacaa taagattgat tgtggaggaa 60agtcgtcgga tcattgcttg aagccagaaa gccccggact cggcagaatc tgaccgcccg 120cgctgcagct ccaatcgtag ttttctcaat cattgacagc tccattcatt gcttctctag 180ccattactcc tgtcacttcc agaagtattc actttgatgc ctggtgttca atgatttttc 240ctattattga atcaaatatt ttgtgctata gctataacat cgctcatatt ttcccggtag 300gatgttaata caccacatca gtcctcccaa gtcgcttctg cacaatttca tggctaatga 360catgagctgt catctggacc ataacatgct gcttggcaac tgtagaaata gcatccatct 420gacttcatct cgcttcagcg tgtagtgatt ctaactgttc tcccggatgc caagtttctg 480actgtcggta gcgaacctaa tccggtagct tttcccggcg tgaagtctgt tgctgttcct 540acgccaataa cggctaagtc gcggccaata acttcctgct agcggatttc attcgttcat 600atcacgcccg actaggggaa atgaaccata ttagataatt ggaactggtg cagttgcctg 660attgagggtc tccactccgg ccttgttgat gatgcaggct tggcagccag caatccggcc 720tcgttgctcc gagaaccccg tggtttgcgc aggatatgcg atgggtgaaa tattcagtgg 780ctgtgctgga ccattaacgt cttgtcatat ttccacccgg ggccgttgta gaggttgagt 840tccgaaggtt tacctaaaca gtgtttttcg tttgggaacg cggaagggtc taagtttcgg 900gctgccccat agggctgagc ctatgccatt ccagttggaa ccctgactgc acaggaggat 960actattttgg atcgcctcaa tattattctg ctgcctggca ccaccttcca atcgggtacc 1020cccgtttcat agaccctgac tggggtttct gcactagctt agttgaacga gacacaatgc 1080aatcacaata gggtcctcaa taatatctca ggcaccacaa actcagggcc gaggatgtct 1140acatgctgcg ccttgcctgg cttggccctg ccacctcaga ttttgctgtg ctccatttat 1200gcattcggag attttggtac gcaggaatca gtaagctcta atagtgtggt ccgctcgtca 1260atttcttata aatcaccctg gggcaccctc actcccaatg cactgagtct gtgttatgct 1320agacgtgtca cttggtgcaa cccaaagcag acatgaagtt caatgcactc ttaacgaccc 1380tcgcggcgct ggggtatatc caaggtatat ttccgatctt gaaactcatc atgcagcact 1440
aactcatgct gacccgccca taggaggcgc cgcggttcct acaaccgtcg acctcacata 1500tgcagacata tcacctcgcg cactggataa tgcccctgat ggttataccc cgagcaatgt 1560atcctgtcct gcaaacagac cgacgattcg cagcgcgtca accctgtcat cgaacgagac 1620ggcatgggtg gacgtccggc gtaagcagac tgtctcagcg atgaaagacc ttttcggcca 1680tatcaacatg agctcatttg acgctatttc gtacatcaac agccattcat caaatatcac 1740caacataccc aacatcggta ttgccgtgtc cggcggtggc tacagagccc tgaccaacgg 1800cgcgggagca ctcaaggcat tcgacagtcg aacggaaaac tcaacccata atggacagct 1860cggtggtctt ctgcagtcag ccacatacct gtccggtctc tccggaggtg gctggctcct 1920gggctcaatc tacatcaaca acttcaccac cgtctccaat ctgcaaacct acaaagaggg 1980cgaagtctgg cagttccaga attcaatcac gaaaggccca aagaccaacg gcttgcaagc 2040ttgggataca gccaagtact accgcgatct ggccaaggtg gtcgctggca agaaggacgc 2100gggcttcaac acttccttca cggactactg gggtcgcgca ctctcctacc agctgattaa 2160cgcgaccgac ggaggcccag gctacacctg gtcatcgatc gctttaaccc aggacttcaa 2220gaacggaaac atgcccatgc cgctccttgt cgccgacggc cgcaacccag gcgagaccct 2280aatcggcagc aactcgaccg tgtatgagtt caacccctgg gaattcggca gttttgatcc 2340gtccatcttc ggcttcgctc ccctcgaata cctcggatcc tactttgaga acggcgaagt 2400cccatccagc cgatcctgcg tccgcggctt cgataacgca ggcttcgtca tgggaacctc 2460ctccagtctc ttcaaccaat tcatcctgaa gctcaacacc accgacatcc catcaaccct 2520caaaacggtc atcgccagca tcctagaaga actaggcgac cgcaacgacg acatcgccat 2580ctactctccc aaccccttct acgggtaccg caacgcgaca gtttcatacg aaaagacccc 2640ggacctgaac gtcgtcgacg gtggcgaaga caaacagaac ctccccctcc atcctctcat 2700ccaacccgcc cgcaacgtgg acgtcatctt cgccgtcgac tcctcagcca gtacctcgga 2760caactggccc aacggaagtc ctctcgtcgc gacttacgaa cgtagtctca actcaaccgg 2820tatcggaaac ggcaccgcgt tccctagcat cccggacaag agcaccttca ttaacctggg 2880cttgaacacc cgtccgactt tcttcggctg caatagttcc aatatcacag gccatgcacc 2940cctggttgtc tacctcccca actaccccta cacaaccctc tccaacaagt cgaccttcca 3000gctcaagtac gagatcttgg agcgtgatga gatgatcacc aatggctgga acgtggttac 3060tatgggtaat ggatcaagga agtcttacga ggattggccg acttgtgcgg gctgcgctat 3120tctgagtcgc tcgtttgatc ggactaatac ccaggtgccg gatatgtgct cgcagtgttt 3180tgacaagtat tgctgggatg gaacgaggaa tagtacgacg ccggcggcgt atgagccgaa 3240ggtattgatg gctagtgcgg gtgtgagggg tatttcgatg tcgaggttgg ttttgggtct 3300ctttccggtg gtggttgggg tttggatgat gtgagtggag gttgggatct gaatgttggg 3360atgtgtatgc taggtgatct tatgagaatg agtttacgac agtcctgata tacttcagaa 3420gtagatccag taaagatgtg ttacttacat agaaagcagg aatggattgg atgtaatgct 3480tattcagtta gacgtaaaag gaactcaagt ccaatactac tgcggtacag catcaccacc 3540aaatcccact gacatccaat aaatcaagtg caaaactcct tctttctcat ccctctccag 3600ttgatctccc tggaagtttc cttcataaga aacgcat 3637<210>14<211>1923<212>DNA<213>黑曲霉
<220>
<221>CDS<222>(1)..(1923)<400>14atg aag ttc aat gca ctc tta acg acc ctc gcg gcg ctg ggg tat atc 48Met Lys Phe Asn Ala Leu Leu Thr Thr Leu Ala Ala Leu Gly Tyr Ile1 510 15caa gga ggc gcc gcg gtt cct aca acc gtc gac ctc aca tat gca gac 96Gln Gly Gly Ala Ala Val Pro Thr Thr Val Asp Leu Thr Tyr Ala Asp20 25 30ata tca cct cgc gca ctg gat aat gcc cct gat ggt tat acc ccg agc 144Ile Ser Pro Arg Ala Leu Asp Asn Ala Pro Asp Gly Tyr Thr Pro Ser35 40 45aat gta tcc tgt cct gca aac aga ccg acg att cgc agc gcg tca acc 192Asn Val Ser Cys Pro Ala Asn Arg Pro Thr Ile Arg Ser Ala Ser Thr50 55 60ctg tca tcg aac gag acg gca tgg gtg gac gtc cgg cgt aag cag act 240Leu Ser Ser Asn Glu Thr Ala Trp Val Asp Val Arg Arg Lys Gln Thr65 70 75 80gtc tca gcg atg aaa gac ctt ttc ggc cat atc aac atg agc tca ttt 288Val Ser Ala Met Lys Asp Leu Phe Gly His Ile Asn Met Ser Ser Phe85 90 95gac gct att tcg tac atc aac agc cat tca tca aat atc acc aac ata 336Asp Ala Ile Ser Tyr Ile Asn Ser His Ser Ser Asn Ile Thr Asn Ile100 105 110ccc aac atc ggt att gcc gtg tcc ggc ggt ggc tac aga gcc ctg acc 384Pro Asn Ile Gly Ile Ala Val Ser Gly Gly Gly Tyr Arg Ala Leu Thr115 120 125aac ggc gcg gga gca ctc aag gca ttc gac agt cga acg gaa aac tca 432Asn Gly Ala Gly Ala Leu Lys Ala Phe Asp Ser Arg Thr Glu Asn Ser130 135 140acc cat aat gga cag ctc ggt ggt ctt ctg cag tca gcc aca tac ctg 480Thr His Asn Gly Gln Leu Gly Gly Leu Leu Gln Ser Ala Thr Tyr Leu145 150 155 160tcc ggt ctc tcc gga ggt ggc tgg ctc ctg ggc tca atc tac atc aac 528Ser Gly Leu Ser Gly Gly Gly Trp Leu Leu Gly Ser Ile Tyr Ile Asn165 170 175aac ttc acc acc gtc tcc aat ctg caa acc tac aaa gag ggc gaa gtc 576Asn Phe Thr Thr Val Ser Asn Leu Gln Thr Tyr Lys Glu Gly Glu Val180 185 190tgg cag ttc cag aat tca atc acg aaa ggc cca aag acc aac ggc ttg 624Trp Gln Phe Gln Asn Ser Ile Thr Lys Gly Pro Lys Thr Asn Gly Leu195 200 205
caa gct tgg gat aca gcc aag tac tac cgc gat ctg gcc aag gtg gtc 672Gln Ala Trp Asp Thr Ala Lys Tyr Tyr Arg Asp Leu Ala Lys Val Val210 215 220gct ggc aag aag gac gcg ggc ttc aac act tcc ttc acg gac tac tgg 720Ala Gly Lys Lys Asp Ala Gly Phe Asn Thr Ser Phe Thr Asp Tyr Trp225 230 235 240ggt cgc gca ctc tcc tac cag ctg att aac gcg acc gac gga ggc cca 768Gly Arg Ala Leu Ser Tyr Gln Leu Ile Asn Ala Thr Asp Gly Gly Pro245 250 255ggc tac acc tgg tca tcg atc gct tta acc cag gac ttc aag aac gga 816Gly Tyr Thr Trp Ser Ser Ile Ala Leu Thr Gln Asp Phe Lys Asn Gly260 265 270aac atg ccc atg ccg ctc ctt gtc gcc gac ggc cgc aac cca ggc gag 864Asn Met Pro Met Pro Leu Leu Val Ala Asp Gly Arg Asn Pro Gly Glu275 280 285acc cta atc ggc agc aac tcg acc gtg tat gag ttc aac ccc tgg gaa 912Thr Leu Ile Gly Ser Asn Ser Thr Val Tyr Glu Phe Asn Pro Trp Glu290 295 300ttc ggc agt ttt gat ccg tcc atc ttc ggc ttc gct ccc ctc gaa tac 960Phe Gly Ser Phe Asp Pro Ser Ile Phe Gly Phe Ala Pro Leu Glu Tyr305 310 315 320ctc gga tcc tac ttt gag aac ggc gaa gtc cca tcc agc cga tcc tgc 1008Leu Gly Ser Tyr Phe Glu Asn Gly Glu Val Pro Ser Ser Arg Ser Cys325 330 335gtc cgc ggc ttc gat aac gca ggc ttc gtc atg gga acc tcc tcc agt 1056Val Arg Gly Phe Asp Asn Ala Gly Phe Val Met Gly Thr Ser Ser Ser340 345 350ctc ttc aac caa ttc atc ctg aag ctc aac acc acc gac atc cca tca 1104Leu Phe Asn Gln Phe Ile Leu Lys Leu Asn Thr Thr Asp Ile Pro Ser355 360 365acc ctc aaa acg gtc atc gcc agc atc cta gaa gaa cta ggc gac cgc 1152Thr Leu Lys Thr Val Ile Ala Ser Ile Leu Glu Glu Leu Gly Asp Arg370 375 380aac gac gac atc gcc atc tac tct ccc aac ccc ttc tac ggg tac cgc 1200Asn Asp Asp Ile Ala Ile Tyr Ser Pro Asn Pro Phe Tyr Gly Tyr Arg385 390 395 400aac gcg aca gtt tca tac gaa aag acc ccg gac ctg aac gtc gtc gac 1248Asn Ala Thr Val Ser Tyr Glu Lys Thr Pro Asp Leu Asn Val Val Asp405 410 415ggt ggc gaa gac aaa cag aac ctc ccc ctc cat cct ctc atc caa ccc 1296Gly Gly Glu Asp Lys Gln Asn Leu Pro Leu His Pro Leu Ile Gln Pro420 425 430gcc cgc aac gtg gac gtc atc ttc gcc gtc gac tcc tca gcc agt acc 1344Ala Arg Asn Val Asp Val Ile Phe Ala Val Asp Ser Ser Ala Ser Thr
435 440 445tcg gac aac tgg ccc aac gga agt cct ctc gtc gcg act tac gaa cgt 1392Ser Asp Asn Trp Pro Asn Gly Ser Pro Leu Val Ala Thr Tyr Glu Arg450 455 460agt ctc aac tca acc ggt atc gga aac ggc acc gcg ttc cct agc atc 1440Ser Leu Asn Ser Thr Gly Ile Gly Asn Gly Thr Ala Phe Pro Ser Ile465 470 475 480ccg gac aag agc acc ttc att aac ctg ggc ttg aac acc cgt ccg act 1488Pro Asp Lys Ser Thr Phe Ile Asn Leu Gly Leu Asn Thr Arg Pro Thr485 490 495ttc ttc ggc tgc aat agt tcc aat atc aca ggc cat gca ccc ctg gtt 1536Phe Phe Gly Cys Asn Ser Ser Asn Ile Thr Gly His Ala Pro Leu Val500 505 510gtc tac ctc ccc aac tac ccc tac aca acc ctc tcc aac aag tcg acc 1584Val Tyr Leu Pro Asn Tyr Pro Tyr Thr Thr Leu Ser Asn Lys Ser Thr515 520 525ttc cag ctc aag tac gag atc ttg gag cgt gat gag atg atc acc aat 1632Phe Gln Leu Lys Tyr Glu Ile Leu Glu Arg Asp Glu Met Ile Thr Asn530 535 540ggc tgg aac gtg gtt act atg ggt aat gga tca agg aag tct tac gag 1680Gly Trp Asn Val Val Thr Met Gly Asn Gly Ser Arg Lys Ser Tyr Glu545 550 555 560gat tgg ccg act tgt gcg ggc tgc gct att ctg agt cgc tcg ttt gat 1728Asp Trp Pro Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ile Leu Ser Arg Ser Phe Asp565 570 575cgg act aat acc cag gtg ccg gat atg tgc tcg cag tgt ttt gac aag 1776Arg Thr Asn Thr Gln Val Pro Asp Met Cys Ser Gln Cys Phe Asp Lys580 585 590tat tgc tgg gat gga acg agg aat agt acg acg ccg gcg gcg tat gag 1824Tyr Cys Trp Asp Gly Thr Arg Asn Ser Thr Thr Pro Ala Ala Tyr Glu595 600 605ccg aag gta ttg atg gct agt gcg ggt gtg agg ggt att tcg atg tcg 1872Pro Lys Val Leu Met Ala Ser Ala Gly Val Arg Gly Ile Ser Met Ser610 615 620agg ttg gtt ttg ggt ctc ttt ccg gtg gtg gtt ggg gtt tgg atg atg 1920Arg Leu Val Leu Gly Leu Phe Pro Val Val Val Gly ValTrp Met Met625 630 635 640tga 1923<210>15<211>640<212>PRT<213>黑曲霉
<400>15Met Lys Phe Asn Ala Leu Leu Thr Thr Leu Ala Ala Leu Gly Tyr Ile1 5 10 15Gln Gly Gly Ala Ala Val Pro Thr Thr Val Asp Leu Thr Tyr Ala Asp20 25 30Ile Ser Pro Arg Ala Leu Asp Asn Ala Pro Asp Gly Tyr Thr Pro Ser35 40 45Asn Val Ser Cys Pro Ala Asn Arg Pro Thr Ile Arg Ser Ala Ser Thr50 55 60Leu Ser Ser Asn Glu Thr Ala Trp Val Asp Val Arg Arg Lys Gln Thr65 70 75 80Val Ser Ala Met Lys Asp Leu Phe Gly His Ile Asn Met Ser Ser Phe85 90 95Asp Ala Ile Ser Tyr Ile Asn Ser His Ser Ser Asn Ile Thr Asn Ile100 105 110Pro Asn Ile Gly Ile Ala Val Ser Gly Gly Gly Tyr Arg Ala Leu Thr115 120 125Asn Gly Ala Gly Ala Leu Lys Ala Phe Asp Ser Arg Thr Glu Asn Ser130 135 140Thr His Asn Gly Gln Leu Gly Gly Leu Leu Gln Ser Ala Thr Tyr Leu145 150 155 160Ser Gly Leu Ser Gly Gly Gly Trp Leu Leu Gly Ser Ile Tyr Ile Asn165 170 175Asn Phe Thr Thr Val Ser Asn Leu Gln Thr Tyr Lys Glu Gly Glu Val180 185 190Trp Gln Phe Gln Asn Ser Ile Thr Lys Gly Pro Lys Thr Asn Gly Leu195 200 205Gln Ala Trp Asp Thr Ala Lys Tyr Tyr Arg Asp Leu Ala Lys Val Val210 215 220Ala Gly Lys Lys Asp Ala Gly Phe Asn Thr Ser Phe Thr Asp Tyr Trp225 230 235 240Gly Arg Ala Leu Ser Tyr Gln Leu Ile Asn Ala Thr Asp Gly Gly Pro245 250 255Gly Tyr Thr Trp Ser Ser Ile Ala Leu Thr Gln Asp Phe Lys Asn Gly260 265 270Asn Met Pro Met Pro Leu Leu Val Ala Asp Gly Arg Asn Pro Gly Glu275 280 285Thr Leu Ile Gly Ser Asn Ser Thr Val Tyr Glu Phe Asn Pro Trp Glu290 295 300Phe Gly Ser Phe Asp Pro Ser Ile Phe Gly Phe Ala Pro Leu Glu Tyr305 310 315 320Leu Gly Ser Tyr Phe Glu Asn Gly Glu Val Pro Ser Ser Arg Ser Cys325 330 335
Val Arg Gly Phe Asp Asn Ala Gly Phe Val Met Gly Thr Ser Ser Ser340 345 350Leu Phe Asn Gln Phe Ile Leu Lys Leu Asn Thr Thr Asp Ile Pro Ser355 360 365Thr Leu Lys Thr Val Ile Ala Ser Ile Leu Glu Glu Leu Gly Asp Arg370 375 380Asn Asp Asp Ile Ala Ile Tyr Ser Pro Asn Pro Phe Tyr Gly Tyr Arg385 390 395 400Asn Ala Thr Val Ser Tyr Glu Lys Thr Pro Asp Leu Asn Val Val Asp405 410 415Gly Gly Glu Asp Lys Gln Asn Leu Pro Leu His Pro Leu Ile Gln Pro420 425 430Ala Arg Asn Val Asp Val Ile Phe Ala Val Asp Ser Ser Ala Ser Thr435 440 445Ser Asp Asn Trp Pro Asn Gly Ser Pro Leu Val Ala Thr Tyr Glu Arg450 455 460Ser Leu Asn Ser Thr Gly Ile Gly Asn Gly Thr Ala Phe Pro Ser Ile465 470 475 480Pro Asp Lys Ser Thr Phe Ile Asn Leu Gly Leu Asn Thr Arg Pro Thr485 490 495Phe Phe Gly Cys Asn Ser Ser Asn Ile Thr Gly His Ala Pro Leu Val500 505 510Val Tyr Leu Pro Asn Tyr Pro Tyr Thr Thr Leu Ser Asn Lys Ser Thr515 520 525Phe Gln Leu Lys Tyr Glu Ile Leu Glu Arg Asp Glu Met Ile Thr Asn530 535 540Gly Trp Asn Val Val Thr Met Gly Asn Gly Ser Arg Lys Ser Tyr Glu545 550 555 560Asp Trp Pro Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ile Leu Ser Arg Ser Phe Asp565 570 575Arg Thr Asn Thr Gln Val Pro Asp Met Cys Ser Gln Cys Phe Asp Lys580 585 590Tyr Cys Trp Asp Gly Thr Arg Asn Ser Thr Thr Pro Ala Ala Tyr Glu595 600 605Pro Lys Val Leu Met Ala Ser Ala Gly Val Arg Gly Ile Ser Met Ser610 615 620Arg Leu Val Leu Gly Leu Phe Pro Val Val Val Gly Val Trp Met Met625 630 635 640
权利要求
1.分离的多核苷酸，它能与选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的多核苷酸杂交。
2.根据权利要求1的分离的多核苷酸，它能在高度严紧的条件下与选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的多核苷酸杂交。
3.根据权利要求1或2的分离的多核苷酸，它来自丝状真菌。
4.根据权利要求3的分离的多核苷酸，它来自黑曲霉。
5.分离的多核苷酸，它编码含有选自SEQ ID NO3、6、9、12和15或其功能等价物的氨基酸序列的磷脂酶。
6.分离的多核苷酸，它编码含有选自SEQ ID NO3、6、9、12和15或其功能等价物的氨基酸序列的磷脂酶的至少一个功能结构域。
7.分离的多核苷酸，它包含选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14或其功能等价物的核苷酸序列。
8.分离的多核苷酸，它选自SEQ ID NO1、2、4、5、7、8、10、11、13和14。
9.载体，它包含根据权利要求1到8的多核苷酸序列。
10.根据权利要求9的载体，其中根据权利要求1-8的所述多核苷酸序列与适合在适当宿主细胞中表达所述多核苷酸序列的调节序列有效连接。
11.根据权利要求10的载体，其中所述合适的宿主细胞是丝状真菌。
12.制造根据权利要求1-8的多核苷酸或权利要求9-11的载体的方法，包括步骤培养被所述多核苷酸或所述载体转化的宿主细胞，并从所述宿主细胞中分离所述多核苷酸或所述载体。
13.分离的磷脂酶，它具有选自SEQ ID NO3、6、9、12和15或其功能等价物的氨基酸序列。
14.根据权利要求13的分离的磷脂酶，它来自黑曲霉。
15.分离的磷脂酶，其可通过在适当的宿主细胞，如黑曲霉，中表达根据权利要求1-8的多核苷酸或权利要求9-11的载体而获得。
16.重组磷脂酶，它包含根据权利要求13到15的任何磷脂酶的功能结构域。
17.制造根据权利要求13到16中任一项的磷脂酶的方法，包括步骤用权利要求1-8的分离的多核苷酸或权利要求9-11的载体转化适当的宿主细胞，在允许表达所述多核苷酸的条件下培养所述细胞，以及可选地从所述细胞或培养基中纯化编码的多肽。
18.重组宿主细胞，它包含根据权利要求1-8的多核苷酸或权利要求9-11的载体。
19.重组宿主细胞，它表达根据权利要求13-16的多肽。
20.与根据权利要求13-16的磷脂酶反应的纯化的抗体。
21.包含根据权利要求13-16的磷脂酶序列的融合蛋白质。
22.生产生面团的方法，包括加入根据权利要求13-16中任一项的磷脂酶。
23.从权利要求22的方法制备的生面团生产烘焙产品的方法。
24.根据权利要求13-16中任一项的磷脂酶在制备生面团和/或其烘焙产品中的用途。
全文摘要
本发明涉及新鉴定的多核苷酸序列，它包含分离自黑曲霉(Aspergillus niger)的新磷脂酶基因。本发明提供了新基因的全长核苷酸序列、包含新磷脂酶全长编码序列的cDNA序列及功能蛋白质和它的功能等价物的全长氨基酸序列。本发明也涉及这些酶在工业流程和诊断真菌感染中的使用方法。本发明还包括用本发明多核苷酸转化的细胞和经遗传修饰后增加或降低本发明磷脂酶活力和/或表达水平的细胞。
文档编号C12N15/86GK1659277SQ03813517
公开日2005年8月24日 申请日期2003年5月21日 优先权日2002年5月21日
发明者K·阿尔贝斯曼, W·克姆纳, E·金佩尔, D·迈尔, F·斯普雷亚菲科, A·施托克, C·瓦格纳, D·L·伯尔, R·B·迈玛 申请人:Dsm Ip资产有限公司