胰岛素控释制剂及其方法

专利名称：胰岛素控释制剂及其方法
技术领域：
本发明涉及一种胰岛素控释制剂及其方法，更具体的讲，涉及一种含有微粒的胰岛素控释制剂及其方法，所述微粒通过用可生物降解的聚合材料将胰岛素的均匀微晶微囊化而获得。
尽管DDS尚未被完整定义，但从广义上讲，DDS指设计用以控制药物的体内行为的多种配方，包括靶向系统和化学传递系统(chemical delivery system)，而从狭义上讲，DDS指控释系统。
自从20世纪70年代以来，药物控释方法已经在药学领域得到快速发展。医药领域中通常采用微分子控释系统，而且它主要用于将药品传递至人体的特定部位。
控释系统以各种形式存在，包括用于口服给药的胶囊剂、基片剂(matrix)、用于口服给药或注射的微囊剂、微球、微粒、毫微粒以及脂质体和植入物(J.Kost，1995)。微囊化微囊化是控释制剂中最重要的技术。在这一领域中，随着毫微技术在药学领域中与药物传递系统开发的结合，微粒的生产得以快速发展。
例如，用水包油(O/W)分散或共溶剂方法、水包油包水(W/O/W)多乳液方法或乳剂-溶剂蒸发方法，将可溶性药品，盐酸伪麻黄碱包埋于聚合微球中的实验已经公开了可以负载适量药物(R.Bodmeier等，1991)。微囊剂指具有位于中心核的固体或液体药物的球形粒子，而微球指其中固体或液体药物分散在聚合材料的多重核。微粒包括微囊剂和微球，它指使用微粒如聚合物基质或脂质作为药物载体的微粒药物载体。除非特别说明，在本说明书中这些术语具有如上所述的含义。
微粒可以被生产成具有范围为0.1μm至几百微米(μm)的各种直径。在那些微粒中，直径为1μm或1μm以下的微粒称为毫微球(或毫微粒)。通常以固相保存而在使用时将其悬浮的大多数微球已经被常规地用作放射诊断试剂，进来则作为药物载体倍受关注。药物载体用于控释系统的物理载体包括各种类型的合成及天然高分子。其中，可生物降解的聚合物是白蛋白、明胶、胶原、血纤蛋白原、聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、聚β-羟基丁酸(PHB)、聚己酸内酯、聚酐、聚原酸酯和这些物质的共聚物聚(交酯-共-乙醇酸交酯)(PLGA)等。自从在20世纪60年代开发出这些聚合物作为外科用缝合线以来，从20世纪70年代开始对这些聚合物作为缓释制剂如类固醇、抗疟药、麻醉药抑制剂或制癌物质的系统进行了各种研究。在Tice等公开了可以通过从微球制剂产生水溶性化合物，例如抗生素和促黄体素释放素(LHRH)类似物而实现缓释之后，上述可生物降解的聚合物已受到更多关注(Tice，T.R.(1984)Pharm.Tech.8，26-36)。PLGA为了用共聚物实现肽的微囊化，必须符合以下要求1) 肽必须由可生物降解的聚合物形成；2) 在加工过程中不能发生肽的变性；3) 包囊效率必须足够高。
目前，对肽和蛋白质微囊化的主要研究是使用聚乳酸(PLA)或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的水包油包水(W/O/W)溶剂蒸发技术，PLGA是PLA和聚乙醇酸(PGA)的共聚物。
PLGA和PLA是被毒理学和临床数据完全支持的聚合物，它们是无毒、生物相容的、可生物降解的聚合物，已被FDA授权用于人体。从这些材料分解(denature)的乙醇酸和乳酸通过体内代谢除去。那些聚合物的水解速度取决于温度、催化剂的存在、pH的明确变化，没有观察到取决于体内位置的分解速度的变化。这满足适用于药物传递配方的要求。分解速度由聚合物的分子量和结晶度以及PLGA的交酯∶乙醇酸交酯比。由于乳酸具有不对称碳原子，所以它有两种光学异构体。因此，聚合物由L，D-和D，L-乳酸组成。L，D-聚合物是晶体形式，而D，L-聚合物是无定型形式，而且这些聚合物快速分解。(Patrick Convreur，Maria Jose，Blanco-Prieto，Francis Puisienx，BemardReques，Elias Fattal，Multiple emulsion technology for the design ofmicrospheres containing peptides and oligopeptide，Advanced DrugDelivery Review 28(1997)85-96)。
PLGA用于水溶性和非水溶性药品的微囊化。在将牛血清白蛋白(BSA)用作模型蛋白，通过油包油(O/O)、水包油(O/W)、水包油包水(W/O/W)乳液方法生产微球的情况中，发现注入配方介质的总蛋白的50-70％包含在微球中，且其粒度分别为500μm、25-100μm和10-20μm。BSA的释放类型根据不同生产方法而不同。在通过W/O/W乳液方法生产后真空干燥的微球的情况中，释放量大。在通过O/W方法生产的含有carbopol-R 951的微球的情况中，初始释放量大。释放持续时间分别为54天、36天和34天。
另外，据报道，在通过双乳液方法从PLGA生产微球的情况中，将微球生产成适于肺传递的大小。据报道，在用CNTF(Ciliaryneurotrophic fact)和PLGA混合比为30∶70生产的微球的情况中，(D.Maysinger等，1996)，通过相分析得到微球的平均粒度为1.76±0.0186μm。胰岛素胰岛素是研究最活跃的控释制剂的目标之一。目前，最经常使用的胰岛素是注射剂和泵形式的。40、80、100IU/ml的Zn-胰岛素悬浮液或中性溶液通常具有速效，它们被广泛使用，而且在使用中100IU/ml是优选的。溶液状态的胰岛素倾向于表现出快速功效，结晶状态则不然，但溶液状态的胰岛素药效持续时间短。所以，患者大多在饭前或睡前使用注射剂形式的胰岛素。根据活动，分别给予速效胰岛素和长效胰岛素。由于需要频繁给予胰岛素，这些现有的胰岛素制剂可能给患者的日常生活带来不便。在错过给药时间的情况中，可能发生血清葡萄糖浓度急剧下降或低血糖的显著危险。
已知胰岛素晶体比胰岛素溶液具有更长的药效，当给予它们时，其药效保持约36小时。这是因为胰岛素晶体使胰岛素在体内缓慢溶解，这可以被有利地用于延长胰岛素在血中的活性，其方式类似于从人体的胰产生并分泌胰岛素。基于这一事实，在1956年，Schlichtkrull试图生产小到足以用于治疗糖尿病的胰岛素晶体。之后，在药学领域中不断研究制备胰岛素或胰岛素衍生物微晶的结晶方法，以使胰岛素晶体在体内缓慢溶解。迄今为止，报道了很多胰岛素结晶方法，且大部分报导利用胰岛素溶液的pH变化(美国专利第3,719,655和第4,959,351号)。但是，这些常规结晶方法都存在一个问题，就是难以以高收率获得适于通过肺给药的10μm或10μm以下的微细胰岛素晶体。
同时在进行各种胰岛素控释制剂的研究，所述制剂能够在给药后在体内长时间连续降低血清葡萄糖浓度，在这些制剂中，几种胰岛素控释制剂已经显示出显著的改善。目前正在研究的大部分胰岛素传递系统基于结合在药物传递系统(DDS)的聚合物中的葡萄糖氧化酶和存在于血中的葡萄糖的反应。如果葡萄糖和葡萄糖氧化酶之间的反应导致DDS的微环境中pH下降，则聚合物系统膨胀，从而增加释放的胰岛素的量。这里使用的聚合物系统包括甲基丙烯酸N，N-二甲氨基乙酯和聚丙烯酰胺。
或者，为了使用于口服的胰岛素免于在消化系统内被分解，可以生产毫微球。根据这一方法，通过聚合物基质阻止在肠M细胞吸收之前的蛋白质变性，并小尺寸的聚合物基质允许通过膜屏障的渗透。从便于给药的角度而言，这种方法有有点。但是，这一方法的传递效果只是腹腔传递效果的11％(Gerardo P.Carino，Jules S.Jacob，Edith Mathiowitz，Nanosphere based oral insulin delivery，Journalof controlled release 65(2000)261-269)。
肺传递是目前研究最活跃的领域之一。与鼻传递相比，肺传递提供与大网球场一样大的相对大的表面积，例如100m2，而且它允许通过存在于薄的上皮细胞壁的大量血管迅速吸收。根据在美国糖尿病协会会议上发表的几家公司进行的临床试验结果，可以获得与注射胰岛素相同的效果。已知目前正在进行III期临床试验，其中约1000名患者作为临床试验的受试者。利用肺传递的蛋白质药品传递系统的开发预期将提出容易且方便地给予通常只通过注射提供的蛋白质药品的途径。本发明提供有效的胰岛素控释制剂用于胰岛素肺传递。蛋白质药品的稳定性在小肽的情况中，即使其分解很少发生，其稳定性也是关键问题。在微粒的生产过程中，给蛋白质或肽施加过度的应力。所以，蛋白质药品的微囊化过程中必须没有过量的热和剪应力、pH的急剧变化、有机溶剂和过度的冷冻和干燥。即使是在保存期间，微囊化的蛋白质也可能被水合，而且在这种环境下蛋白质倾向于变性和聚集。当给药后聚合物开始分解时，聚合物内部和周围由于分解的酸性单体二产生高浓缩酸性微环境。在这种环境下，蛋白质倾向于聚集、水解和化学变化。最后，可能导致蛋白质和聚合物的可逆或不可逆分割，从而影响药物传递速度，最终导致蛋白质的变性、聚集和失活。
在以治疗为目的的肽中，胰岛素不仅成为核酸酶的靶，而且倾向于在溶液或悬浮液中化学、物理变性(J.Brange，L.Andersen，E.D.Laursen，G.Meyn，E.Rasmussen，Toward understanding insulinfibrillation，J.Pharm.Sci.86(1997)517-525)。
在液相溶液中由于胰岛素的化学分解可能生成脱酰胺的产物，例如在酸性介质这的脱酰胺基A21、中性溶液中的脱酰胺基B3。另外，通过转酰胺基作用可能形成具有共价键的胰岛素二聚体(R.T.Darrington，B.D.Anderson，Evidence for a common intermediate ininsulin deamidation and covalent dimer formation；effects of pH andaniline trapping in dilute acidic solutions，J.Pharm.Sci.84(1995)274-282)。
象其他球状蛋白质一样，胰岛素具有通过折叠或者各种分子的组装而使疏水性表面隐藏在内部的三级结构。另外，其天然构象的变化可能受各种因素的影响。具体而言，热、物理力以及暴露于疏水性表面导致蛋白质的结构变化，从而导致蛋白质聚集和产生不溶性沉淀(B.V.Fisher，P.B.Porter，Stability ofbovine insulin，J.Pharm.Pharmacol.33(1981)203-206)。
蛋白质药品的变性导致免疫原性或抗原性，伴随抗体的生成，妨碍所注射的蛋白质的活化，影响人体内自然生成的相同蛋白的作用，这是非常有害的。
因此，从配方和生产角度而言，必须考虑药品稳定性。本发明涉及保留配方中所含胰岛素的稳定性的微囊化方法。
由于胰岛素在微囊化过程中容易变性，其容易生成脱酰胺产物，发生全部蛋白质的约50％的损失。此外，在干燥微粒时由于蛋白质表面上的分割而发生的初始释放可能导致降血糖作用。
因此，本发明的第一个目的是提供一种胰岛素控释制剂及其方法，所述制剂使胰岛素的蛋白质变性最小化，并能够提高在微囊化过程中的稳定性。
为了实现上述目的，本发明提供一种胰岛素控释制剂，其中用聚合物载体将胰岛素微粒微囊化。本发明的控释制剂可以制造成适于肺吸入给药、注射、口服给药、经皮吸入等的各种形式。特别地，微粒的大小为10μm或10μm以下，优选为5μm或5μm以下，从而适于肺传递。本发明的胰岛素控释制剂是缓释制剂，由于其持续表现药效因而可以减少胰岛素的给药次数。而且，根据本发明，可以控制胰岛素的初始释放量，从而防止血清葡萄糖浓度的急速降低。
本发明的另一个目的是提供胰岛素的提高的包囊效率和优化。
用于微囊化的可生物降解的聚合物根据其物理性质和成分的不同，其分解速度不同，但完全分解需要相当的时间。以对人体的安全性已得到认证的PLGA为例，尽管PLGA的分解速度根据其成分而不同，但其分解一般需要约50天至约100天。所以，如果连续给予使用可生物降解的聚合物作为载体的微囊化制剂，则可能发生聚合物在体内的蓄积。因此，配方技术的目的是在微囊化中用相同量的聚合物载体包埋更大量的药物。
在液态药物的微囊化的情况中，药物的溶解度决定能包埋在微粒中的药物浓度。如果药物的溶解度低，则只有少量药物得以包埋。在这种情况下，为了传递适量药物，则需要将更大量微粒给予活体。
这一问题在肺传递中比较严重。一般而言，通过肺传递的物质经历内吸收。不吸收的物质通过使用巨噬细胞的清除过程除去。清除过程在气道中在24小时内被除去，而在囊胚中则需要更长的时间(Camner，P.1994)。另外，有文章报道，在肺中存在的物质越多，清除过程进行得越缓慢。
因此，特别地，当通过肺给予药物时，需要通过提高药物对高分子载体的比例来减少给予机体的聚合物物质的量。在本发明中，提供一种胰岛素控释制剂，其中通过使用胰岛素的均匀微粒生产微粒，从而根据需要调节包含在微粒内的胰岛素的含量。
本发明的另一目的是提供一种方法，所述方法用于保存液相胰岛素微粒，从而解决使用微囊化的胰岛素的不便，即微囊化的胰岛素应该再次分散在溶液中。
通常冻干微粒进行保存，并在使用前将微粒分散。但是，在蛋白质药品的情况中，在冻干过程中可能发生变性。并且，在干燥过程中，由于药物微粒的表面分割可能发生初始释放。因此，为了方便给药并防止初始释放，本发明提供不用冻干胰岛素微粒制剂，而利用等电点保存溶液中的胰岛素微粒制剂的方法。
或者，本发明提供一种胰岛素控释制剂及其方法，其中通过在制剂中包含速效胰岛素部分和胰岛素晶体微粒，在一次给药能够同时获得速效和延长的作用。
本发明的其他目的和优点将在下面加以描述，并且通过本发明的实施方案将更为清楚。
为了用胰岛素均匀微晶生产微粒，需要找到能以高收率生产胰岛素微晶的胰岛素结晶方法。本发明的发明人在在先申请中提出了通过调节胰岛素溶液的溶解度，形成可以起到晶核作用的胰岛素微粒，降低胰岛素溶液的溶解度以进行结晶，从而以高收率生产10μm或10μm以下，优选为5μm或5μm以下的胰岛素微晶的方法(韩国专利申请第99-14957号)。在本发明中，发明人实现了通过采用所提出的胰岛素结晶方法制成的胰岛素微晶的微囊化。
现在描述获得胰岛素均匀微晶的方法。将在等电点或等电点以下pH水平的酸性胰岛素溶液的pH调至约9至约10.5，此时形成能够在胰岛素溶液中作为种子发挥作用的微粒，然后降低该胰岛素溶液的溶解度，从而获得10μm或10μm以下，优选5μm或5μm以下的胰岛素微晶。
一般而言，微粒如下生产将基质聚合物与药物一起乳化，并通过加热变性；用福尔马林化学交联；或者用辐射聚合硬化并在水中干燥。粒度是决定药物的体内行为的重要因素，通过选择制备条件可以调节粒度。
当肽的N-和C-末端未被环形成、酰胺化或酯化所保护时，其具有亲水性。因此，肽和蛋白质由于亲水性而难以在由疏水性聚合物组成的聚合物基质中被微囊化。因为这些性质，已经开发了采用W/W/W溶剂蒸发方法生产微粒的方法。
多重乳化溶剂蒸发方法包括内水相(IWP)和有机溶剂(OS)，所述内水相是溶解在蒸馏水或缓冲溶液中的药物，所述有机溶剂是溶解在与水不混溶的高挥发性有机溶剂的聚合物溶液。将IWP在OS中乳化，从而制备第一乳液(W/O)，然后搅拌下将该乳液倾入含有乳化剂的外水相(OWP)中，从而获得第二乳液(W/O/W)。连续搅拌所得的多重乳液以蒸发OS，导致聚合物沉淀，从而形成负载药物的微粒。
存在于OWP中的乳化剂在矩形微粒的形成中发挥重要作用。乳化剂在除去OS的过程中起到防止微粒聚沉的作用。聚乙烯醇(PVA)一般用作乳化剂，可用的乳化剂包括聚乙烯吡咯烷酮、藻酸盐、甲基纤维素、明胶等。
OS的除去在正常压力或者减压下进行。OS的彻底除去可以通过如下三种方法进行1)中断方法在室温下进行蒸发，将部分硬化的微粒转移至低浓度乳化剂溶液或无乳化剂的溶液中继续蒸发；2)连续方法在室温下进行连续搅拌，直到OS被完全除去；以及3)旋转蒸发用旋转蒸发仪在约30℃下除去OS。
除去OS之后，通过过滤或离心分离硬化的微囊，洗涤数次以除去乳化剂，然后真空干燥或冷冻干燥。
在本发明中，微囊化优选通过双乳液方法进行，并使用可生物降解的聚合物。可生物降解的聚合物包括白蛋白、明胶、胶原、血纤蛋白原；羟基酸如聚交酯(PLA)和聚乙醇酸交酯(PGA)；聚(交酯-共-乙醇酸交酯)(PLGA)、PEG、聚β-羟基丁酸(PHB)、聚己酸内酯、聚酐、聚原酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丁酸、聚戊酸、聚(交酯-共-己内酯)，及它们的衍生物，以及它们的共聚物和混合物。本文所用的术语“衍生物”包括具有化学基例如烷基或亚烷基取代、加成、羟基化、氧化及本领域技术人员以常规方式做出的其他修饰的聚合物。一般而言，可生物降解的聚合材料通过非酶促和酶促水解以及表面或体侵蚀而在体内分解。可用的聚合材料优选是聚(交酯-供-乙醇酸交酯)(PLGA)。
以下详细描述采用双重乳化溶剂蒸发工艺的本发明的微囊化。
首先，按上述方式获得胰岛素微晶并将其悬浮在处于胰岛素等电沉淀区的pH为4.5-6.5的溶液中，然后使用。
这里，可用的悬浮液包括从1％乙酸盐溶液制成的脱乙酰壳多糖溶液并pH调节到4.5至6.5，也就是处于等电沉淀区，在此pH胰岛素晶体不溶解。这里，可以使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)代替脱乙酰壳多糖。另外，也可以使用结晶过程中以溶液状态获得的胰岛素晶体的上清液。
将在上述方法中制备的胰岛素悬浮液加入聚合物溶液中，例如PLGA/DCM溶液，制成第一乳液。然后将第一乳液缓慢加入乳化剂，例如1％PVA溶液中，制成第二乳液，然后，搅拌使其凝固。然后，通过离心回收颗粒，用蒸馏水洗涤三次并冷冻干燥，从而获得本发明的微粒。
常规乳化剂如聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸盐、甲基纤维素、明胶等可以用作乳化剂。
通过上述方法制备的本发明的微粒具有体积平均直径10μm或10μm以下，优选0.1μm或0.1μm以上的小且均匀的粒度分布。特别地，在用于肺给药的配方的情况中，微粒的直径优选为5μm或5μm以下。粒度不受包含在微粒内的胰岛素晶体的量的影响。
在以下实施例中，对通过胰岛素晶体的微囊化和胰岛素溶液的微囊化制备的本发明的微粒进行了比较。所用的胰岛素溶液通过将胰岛素溶解于乙酸溶液中而制备。
各种比较例的结果显示在将胰岛素晶体微囊化的情况中，形成药物位于中心核的微囊，称为“晶体/PLGA”，而在将液相胰岛素溶液微囊化情况中，形成药物分散在聚合材料中的微球，称为“溶液/PLGA”(参见

图1)。基于配方结构，与溶液/PLGA相比，本发明的晶体/PLGA显示更小、更均匀的粒度分布(参见图3和图4)。
另外，在按照本发明将胰岛素晶体微囊化的情况中，与有机溶剂之间的接触面减小，这抑制在加工过程中可能发生的蛋白质变性，从而大大提高了配方的稳定性(参见图6和图7)。
另外，晶体/PLGA比溶液/PLGA显示更高的微囊化效率(参见图8)，还降低了在硬化过程中可能发生的蛋白质损失。
本发明者的实验结果显示，胰岛素在0.1N乙酸溶液(pH2.0)中溶解约254IU/0.3ml。相反，由于胰岛素晶体没有溶解度的限制，所以，可以将超过约425IU/0.3ml的胰岛素微囊化。晶体/PLGA显示约79％的包囊效率，并显示随胰岛素含量增加的药物含量线性增加。在另一方面，虑胰岛素的溶解度，溶液/PLGA显示最大3％的药物含量，而且随胰岛素浓度增加包囊效率减降低。因此，证实了在用胰岛素晶体进行微囊化的情况中，通过提高药物对聚合物载体的比来减少给入体内的聚合物化合物的量，可以降低肺清除过程的负担。
另外，本发明提供一种以液相形式保存胰岛素微粒制剂的方法，其中将微粒制剂保存在等电缓冲溶液中，利用胰岛素的等电点，而不对微粒制剂进行冷冻干燥。证实了当在胰岛素的等电沉淀区，即pH4.5至6.5的等电缓冲溶液中保存胰岛素晶体的微粒制剂时，即使经过15小时之后，在微粒中依然存在96％的胰岛素。由于液相形式的胰岛素微粒制剂在使用时无需在溶液中进行分散，而可以直接给如患者体内，因而方便了给药。而且，由于没有在冷冻干燥过程中可能发生的蛋白质变性，因此当将胰岛素微粒制剂给入体内时，初始释放显著降低。
证实体内显示药效的动物试验显示，晶体/PLGA比未微囊化的胰岛素晶体更长时间维持更低水平的血清葡萄糖浓度，同时以更稳定的方式在体内保持延长的药效(参见图11)。
通过将胰岛素微晶微囊化而制备的本发明的微粒用作胰岛素控释制剂，其可以连续保持胰岛素药效。
胰岛素控释制剂可以进一步包含药学可接受的稀释剂、载体或添加剂。
优选地，本发明的胰岛素控释制剂可以制成适于肺吸入给药、注射、口服给药、经皮吸入等的各种形式。肺吸入给药形式是最优选的。
可以使用现有配方技术生产本发明的胰岛素控释制剂，从而通过在制剂中包含速效胰岛素部分和胰岛素晶体微粒而同时获得速效和长效。这里，可用的速效胰岛素部分可以包括胰岛素溶液、现有速效胰岛素制剂等。
以下将通过各种实施例更详细地描述本发明。但是，本发明的范围并不限于这些实施例，在如权利要求中所述的本发明的实质内，可以对其做出其他和进一步的修饰和改变。实施例1胰岛素晶体的微囊化(1)将胰岛素粉末溶解于pH2.0的乙酸盐溶液中，用1N NaOH和10N NaOH改变所得溶液的酸度。然后，当pH达到4.5时，聚集体开始形成。当pH进一步升高到6.0时，产生65％以上的直径为5μm或5μm以下的胰岛素晶体。若将pH9.0至10.5的胰岛素溶液的pH水平急剧降低至pH6，则在几秒至约2分钟的时间内生成90％以上的直径为5μm或5μm以下的胰岛素微晶。以这种方式，制备了以溶液相形式存在的胰岛素晶体。
(2)将制备的溶液相胰岛素微晶在4500rpm下离心15分钟，以除去上清溶液并分离胰岛素微晶。
(3)将分离的胰岛素微晶用蒸馏水洗涤，以除去存在于溶液中的胰岛素分子，然后悬浮在0.3ml上述步骤(2)中分离的上清溶液中。
(4)将悬浮液倾入玻璃试管内的4ml PLGA/CH2Cl2溶液中，用组织粉碎机制成乳液。
(5)将上述乳液慢慢倾入50ml 1％的PVP溶液中，制成双重乳液。
(6)将双重乳液搅拌3小时，从而除去CH2Cl2，在2300rpm下离心5分钟，以除去上清溶液，然后用蒸馏水洗涤三次，获得本发明的微粒，即微囊样晶体/PLGA。实施例2胰岛素溶液的微囊化除了用溶解在0.1N乙酸溶液中的胰岛素溶液代替胰岛素微晶之外，以与实施例1中相同的方式制备本发明的胰岛素溶液微粒，即微球样溶液/PLGA。实施例3测量胰岛素微粒的大小用倒置显微镜(CK2型，Olympus，日本东京)观察在实施例1和2中制备的微粒，观察结果显示在图1中，用扫描电子显微镜(SEM)观察微粒表面，观察结果显示在图2中。此外，还测量了在实施例1和2中制备的微粒的大小，测量结果显示在图3中。分析了在实施例1(1)中制备的胰岛素晶体和在实施例1中制备的微粒(晶体/PLGA)的粒度，分析结果显示在图4中。
图1A及1C是由倒置显微镜拍摄的照片，显示在实施例2中制备的溶液/PLGA(×400和×200)，图1B和1D是由倒置显微镜拍摄的照片，显示在实施例1中制备的晶体/PLGA(×400和×200)。如图1中所证实，生成了均匀的矩形微粒。
参见图2，在实施例1中制备的晶体/PLGA在其表面上显示更少的孔，且具有其中具有胰岛素微晶的微囊形状。在另一方面，在实施例2中制备的溶液/PLGA在其表面上显示更多孔，且具有其中具有多核的微球形状。
参见图3，在实施例1中制备的晶体/PLGA具有比在实施例2中制备的溶液/PLGA更小的粒度。参见显示胰岛素晶体和微囊化的胰岛素晶体的比较结果的图4，微囊化的胰岛素晶体的粒度比未微囊化的稍大。尽管不同实验组之间有轻微差异，但是在实施例1中制备的微粒的平均体积直径为5.09±0.92μm，其对于肺传递是足够大三。特别地，约60％的微粒的体积直径为适于通过肺给药的5μm或5μm以下，而约99％的微粒具有适宜的数-直径。实施例4稳定性试验将在实施例1中制备的晶体/PLGA和在实施例2中制备的溶液/PLGA分散在pH7.4的PBS溶液中，并在37℃下释放。释放7天之后，离心所得的液体，从而回收上清溶液，并用RP-HPLC进行分析，结果显示在图5C和5D中。
如图5A至图5D所证实，在实施例4和5中均观察到脱酰胺的产物。为了得到更准确的结果，计算相对于总胰岛素峰面积的比，并比较未冻干的样品与冻干的样品，比较结果显示在以下表1中。
表1

如表1所示，在实施例1中制备的晶体/PLGA具有比在实施例2中制备的溶液/PLGA低得多的脱酰胺化量，脱酰胺化量在英国药典或美国药典中规定为小于3％。
因此，微囊化的胰岛素晶体的稳定性显著高于微囊化的胰岛素溶液，甚至在冷冻干燥后稳定性也得以保持。实施例6胰岛素的加工损失在实施例1和2的微粒生产过程中，在除去CH2Cl2的步骤中，以固定时间间隔取样并分离为微粒和OWP。将微粒溶解在CH2Cl2中，向其中加入0.1N乙酸溶液，然后提取包埋在内部的胰岛素。将OWP的pH水平降低到2从而溶解可能残留在内部的胰岛素微晶。这些都通过Bradford测定而测量，其结果显示在图6和图7中。
溶液/PLGA显示药物含量降低，而晶体/PLGA不显示药物含量降低(图6)。
溶液/PLGA向OWP释放的胰岛素的量连续增加，3小时后，加入整个系统内的胰岛素的9％左右释放到外部(图7)。
所以，可以理解，微囊化的胰岛素晶体的加工损失显著低于微囊化的胰岛素溶液。实施例7微粒中的药物含量和包囊效率从以与实施例1(1)相同的方式制备的胰岛素悬浮液取预订的量，以给出3mg、6mg、10.5mg、15mg胰岛素晶体。将样品离心并分散在0.3ml结晶汤中，弃去上清液。然后，以与实施例2中相同的方式生产微粒。将所得微粒冷冻干燥，分别取约5mg各样品，然后以与实施例6中相同的方式提取包含于其中的胰岛素，以测定药物含量和包囊效率。结果显示在图8和表2中。
表2溶液/PLGA和晶体/PLGA的包囊效率

(S.D标准偏差；S.E标准误差)以上表2显示三次实验结果数据的平均值。
晶体/PLGA显示约79％的恒定包囊效率，随胰岛素含量增加药物含量线性增加。另一方面，考虑胰岛素的溶解度，溶液/PLGA显示最大3％的药物含量，且包囊效率随胰岛素浓度增加而降低。因此，证实了在将胰岛素微晶微囊化的情况中，与其中将胰岛素溶液包囊的常规方法相比，微粒中的药物含量增加，同时加工损失也降低，导致包囊效率提高。实施例8释放试验为了评价有关胰岛素释放的微囊化的影响，将胰岛素晶体微囊化，一部分冷冻干燥，而其余部分不进行冷冻干燥。然后，用胰岛素晶体进行释放试验。将胰岛素晶体(●)、在实施例1中制备的冻干微囊(○)以及在实施例1中制备的未冻干微囊()与0.4ml pH7.4的PBS溶液混合，然后在37℃下释放。以恒定的时间间隔进行离心，回收上清溶液，并补充新的溶液。通过Bradford测定测量所释放的胰岛素的量，其结果显示在图9中。
如图9所示，胰岛素显示双相释放现象，即，初始释放和零级释放相。尽管胰岛素晶体的释放量约为28％，但微囊化且冻干的胰岛素晶体(晶体/PLGA)的释放量为36％，也就是，增加了约8％。相反，未冻干微粒(晶体/PLGA)的初始释放为约24％，也就是，比胰岛素晶体减少了约4％，比冻干微粒减少了约12％。总之，释放量可能受聚合物层控制。
在胰岛素微晶的情况中，大量所释放的胰岛素连续释放，直到4小时后完全释放，没有胰岛素微晶剩余。但是，在微囊化的胰岛素晶体的情况中，初始阶段释放大量胰岛素，然后连续释放少量胰岛素。即使是胰岛素开始释放4小时后，未冻干胰岛素微晶的38％和冻干胰岛素微晶的18％仍保留在微粒内。
结果，证实了未冻干和微囊化可以显著降低胰岛素的初始释放。特别地，在未冻干和微囊化的情况中，与胰岛素晶体的情况相比，更长久地连续释放均匀量的胰岛素。实施例9利用等电点的保存试验以其中在实施例1中制备的微囊未冷冻干燥的状态，以与实施例8中相同的方式，在胰岛素可以完全溶解的pH3的PBS溶液中(●)、在胰岛素等电沉淀区pH6的PBS溶液中(○)，以及pH7.4的PBS溶液中()进行释放试验，结果显示在图10中。
试验结果显示，在pH6的溶液中(○)，4小时后总胰岛素的约20％释放，也就是，80％的胰岛素保留，在pH3(●)和pH7.4()的溶液中，分别有15％和38％的胰岛素保留。结果，小量胰岛素在pH6缓慢释放，不同于pH3或pH7.4的情况。
此外，当将样品保存在4℃、pH6的PBS溶液中时，即使15小时后，仍有96％的胰岛素保留在微粒中。实施例10胰岛素配方的初步临床试验将溶解在pH7.2的PBS溶液中的胰岛素溶液、在实施例1中使用的胰岛素微晶以及在实施例1中制备的微囊腹腔注射入SD大鼠内。使胰岛素溶液完全溶解在pH2.14的PBS溶液中，然后用NaOH和HCl将其pH水平调到7.2。选择各制剂的最佳适量，然后给予大鼠。在胰岛素溶液的情况中，将2IU/kg的胰岛素溶液给入9只SD大鼠的腹腔。在平均粒度为4.16μm的胰岛素微晶的情况中，收率为94.25％，将5IU/kg的胰岛素微晶给入9只大鼠的腹腔。将20IU/kg的微囊化的胰岛素微晶给入8只SD大鼠的腹腔。作为比较，将pH7.2的PBS溶液给入9只SD大鼠对照组。根据每只大鼠的重量，每只大鼠的剂量以胰岛素悬浮液计算是相同的。其结果显示在图11中。
证实了与对照组(●)相比，在注射胰岛素的大鼠(○、、)中观察到的血清葡萄糖浓度显著降低。在胰岛素溶液(○)的情况中，其药效仅持续6小时左右，在胰岛素晶体()的情况中，其药效持药效仅持续6小时左右，在胰岛素晶体()的情况中，其药效持续约8小时。在晶体/PLGA()的情况中，其药效持续约12小时。
而且，证实了微囊化的晶体/PLGA()比胰岛素晶体()更长久地维持更低的血清葡萄糖浓度。
换句话说，胰岛素溶液(○)在2小时过去时显示最低血清葡萄糖浓度水平，同样的情况也适用于胰岛素晶体()。胰岛素微囊()在3小时过去时显示最低血清葡萄糖浓度水平。因为可以从血清葡萄糖浓度的模型推出胰岛素的释放模式，所以当血清葡萄糖浓度处于最低水平时，可以判断胰岛素的最大释放量。
在2小时过去时，在胰岛素溶液(○)和胰岛素晶体()的情况中均显示血清葡萄糖浓度的最低水平，此后血清葡萄糖水平在6至8小时后恢复到正常水平。另一方面，在3小时过去时的基础上，胰岛素微囊()的血清葡萄糖水平直到12小时过去后仍未恢复到正常水平。这说明微囊在体内缓慢释放胰岛素，从而增加药效的持续时间。
如果给予超过5IU/kg的胰岛素溶液，或者给予超过10IU/kg的胰岛素微晶，大鼠因低血糖而死亡。但是，在胰岛素微囊()的情况中，即使给予20IU/kg的剂量，血清葡萄糖水平下降，然后仍缓慢恢复至正常水平。这表明，聚合物材料在体内缓慢释放药物，以延长表现药效的时间，从而有效地防止糖尿病患者死于休克，或者因低血糖导致的休克而死亡。
表3显示剂量、血浆葡萄糖的最小降低(MRPG)、最小血清葡萄糖浓度的时间、血清葡萄糖浓度-时间曲线下的面积(AUC)、总血浆葡萄糖减少(TRPG)。也就是说，可以从表3了解胰岛素的体内行为。
表3

AUC血清葡萄糖浓度-时间曲线下的面积；MRPG血浆葡萄糖浓度的最低减少；TRPG总血浆葡萄糖减少；％TRPG100×[1-(AUC/时间×最大点)工业实用性如上述实施例所证实，其中将胰岛素微晶微囊化的本发明的胰岛素控释制剂可以减少微囊化过程中发生的胰岛素变性，而且可以提高制剂的稳定性，从而减少在活体内的胰岛素初始释放，并防止低血糖的危险。此外，根据本发明，获得了适于肺传递的小而均匀的微粒。此外，微囊化效率，即药物对聚合物载体的比得以提高，其适于通过肺或注射给药。由于本发明的胰岛素控释制剂在活体内连续长时间地显示稳定的药效，因此可能以更稳定的方式调节糖尿病患者的血清葡萄糖浓度，同时减少给药次数。
权利要求
1.一种胰岛素控释制剂，所述制剂含有体积平均直径为10μm或10μm以下的微粒，所述微粒通过使用双乳液方法微囊化而获得，其中将在等电点或等电点以下pH水平的酸性胰岛素溶液的pH调至约9至约10.5，此时形成能够在胰岛素溶液中作为种子发挥作用的微粒，降低该胰岛素溶液的溶解度，从而获得体积平均直径为10μm或10μm以下的胰岛素微晶，将该胰岛素微晶悬浮于处于等电沉淀区pH为4.5-6.5的溶液中，将其加入可生物降解的聚合物中，从而制备第一乳液，向所得第一乳液中加入乳化剂，从而制备第二乳液，然后搅拌第二乳液。
2.根据权利要求1所述的胰岛素控释制剂，其中所述微粒保存在pH4.5-6.5的等电缓冲溶液中。
3.根据权利要求1或2所述的胰岛素控释制剂，其中所述可生物降解的聚合物选自白蛋白、明胶、胶原、血纤蛋白原；羟基酸如聚交酯(PLA)和聚乙醇酸交酯(PGA)；聚(交酯-共-乙醇酸交酯)(PLGA)、PEG、聚β-羟基丁酸(PHB)、聚己酸内酯、聚酐、聚原酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丁酸、聚戊酸、聚(交酯-共-己内酯)，及它们的衍生物，以及它们的共聚物和混合物。
4.根据权利要求3所述的胰岛素控释制剂，其中所述聚合物是聚(交酯-共-乙醇酸交酯)(PLGA)。
5.根据权利要求1或2所述的胰岛素控释制剂，其中用于悬浮胰岛素晶体的溶液是以下溶液之一从1％乙酸盐溶液制成的脱乙酰壳多糖溶液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液以及结晶过程中以溶液状态得到的胰岛素晶体的上清液。
6.根据权利要求1或2所述的胰岛素控释制剂，其中所述制剂具有用于肺吸入给药、注射、口服给药和经皮吸入的配方中的一种配方。
7.根据权利要求1或2所述的胰岛素控释制剂，其中所述微粒的体积平均直径为5μm或5μm以下，且所述微粒是肺吸入给药的形式。
8.根据权利要求1或2所述的胰岛素控释制剂，其进一步包含药学可接受的稀释剂、载体和添加剂。
9.根据权利要求1或2所述的胰岛素控释制剂，其中还包括速效性胰岛素部分。
10.一种控释制剂的生产方法，所述方法包括以下步骤(a)将在等电点或等电点以下pH水平的酸性胰岛素溶液的pH调至约9至约10.5，此时形成能够在胰岛素溶液中作为种子发挥作用的微粒，降低该胰岛素溶液的溶解度，从而获得体积平均直径为10μm或10μm以下的胰岛素微晶；(b)将步骤(a)中得到的胰岛素微晶悬浮于处于等电沉淀区pH为4.5-6.5的溶液中，将该悬浮液加入可生物降解的聚合物中，从而制备第一乳液，向所得第一乳液中加入乳化剂，从而制备第二乳液，然后搅拌第二乳液，从而获得体积平均直径为10μm或10μm以下的微粒；以及(c)通过向在步骤(b)中得到的微粒中加入药学可接受的辅助成分或添加剂，通过常规药学方法制备配方。
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(c)包括在pH4.5-6.5的等电缓冲溶液中保存所述微粒的步骤。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述乳化剂是聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸盐、甲基纤维素和明胶中的一种。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其中用于悬浮所述胰岛素晶体的溶液是以下溶液之一从1％乙酸盐溶液制成的脱乙酰壳多糖溶液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液以及结晶过程中以溶液状态得到的胰岛素晶体的上清液。
全文摘要
本发明提供一种胰岛素控释制剂及其方法。该胰岛素控释制剂含有通过可生物降解的聚合物材料将胰岛素的均匀微晶微囊化而获得的微粒。由于减少了在微囊化过程中可能发生的胰岛素变性，所以制剂的稳定性可以得到提高。同时，增加了胰岛素对聚合物载体的比例，这适于肺传递。此外，该胰岛素控释制剂可以在体内以稳定的方式长时间地连续显示药效。
文档编号A61P5/50GK1438881SQ01811821
公开日2003年8月27日 申请日期2001年6月25日 优先权日2000年6月27日
发明者金缵和, 权宰铉, 崔诚熙 申请人:株式会社Mi Tech