甲状旁腺激素和甲状旁腺激素相关蛋白的受体的调节剂的制作方法

专利名称：甲状旁腺激素和甲状旁腺激素相关蛋白的受体的调节剂的制作方法
本申请要求2001年2月6日申请的美国临时申请第60/266,673号、2000年6月28日申请的美国临时申请第60/60/214,860号和2000年4月27日申请的美国临时申请第60/200,053号的权益，所述申请通过引用结合到本文。
背景技术：
甲状旁腺激素(PTH)和甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)分别在钙体内稳态和发育中起重要的生理学作用。由于钙在细胞代谢中的重要作用，血液中的钙浓度受严格调节。PTH是一种对血清钙水平降低作出反应而从甲状旁腺分泌的内分泌激素。PTH直接起作用，以增加骨吸收和刺激肾的钙重吸收，因而增加或保存循环钙的贮藏。PTH也通过刺激维生素D在肾中的羟基化，间接增加肠中钙的吸收。
原发性和继发性甲状旁腺机能亢进都是与循环甲状旁腺激素水平过高相关的病症。PTH水平过高，通过上述途径可以引起高钙血和骨质稀少。骨吸收抑制剂例如二膦酸(bisphosphonates)和OPG可以有效地保护骨，并且可以抑制血钙过多对骨骼的影响。然而，目前可利用的疗法不能解决甲状旁腺机能亢进对肾和肠的钙血效应的问题。
PTHrP由许多细胞类型产生，在调节骨骼发育方面起重要作用。出生后，PTHrP的作用不太明确。PTHrP的循环水平在正常的健康成体中基本上检测不到。然而，各种各样胚胎来源的许多肿瘤产生并分泌足以引起血钙过高的量的PTHrP。事实上，恶性肿瘤的体液高钙(HHM)是最为常见的副肿瘤综合征，是造成显著的患者病死率的原因。
目前，HHM通过盐水水合然后用骨吸收抑制剂例如二膦酸治疗。这种治疗方案通常需要3-4天，以达到血清钙的显著降低，并且其效应的持续时间相对短(不足一个月)。对于循环PTHrP水平高的患者，当前治疗选择的效应更加没有多大作用。常规疗法的重复给予常常使效力进行性地降低。当前疗法的这些限制显著强烈地表明，医学上仍需要快速有效且长效的HHM疗法。
当前HHM疗法益处有限的一个主要原因是不能直接抑制已被充分确定为HHM的主要病理生理因子的PTHrP。骨吸收抑制剂例如二膦酸仅抑制骨吸收，而PTHrP对肾和肠也具有显著的钙血效应。完全中和PTHrP会是治疗HHM的理想的辅佐疗法。
PTH和PTHrP都与PTH-1受体相互作用，这是造成其大多数已知效应的原因。Mannstadt等(1999)，Am.J.Physiol.277.5Pt2.F665-75(1999)。仅PTH与新发现的PTH-2受体相互作用。出处同上。然而，PTHrP可以通过将两个残基变为PTH中那些位置上的残基，而变为PTH-2受体激动剂。Gardella等(1996)，J.Bil.Chem.271(33)19888-93。
PTH的N末端片段已经用作治疗药。间断给予天然的PTH-(1-84)显示出成骨特性，数十年来一直认为这些特性可以用C末端截短的片段PTH-(1-34)完全实现。这两种肽以相似的亲和性结合且激活PTH-1受体，引起腺苷酸环化酶(AC)以及磷脂酶C(PLC)的活化。通过PTH-1受体的AC活化产生cAMP，而通过PTH-1受体的PLC活化产生PKC和胞内钙暂留(transients)。PTH-(1-34)可以最大激活AC和PLC途径。已经证明，PTH-(1-34)的合成作用需要短间断(每日)的暴露Dobnig(1998)，Endocrinol.1384607-12。在绝经后妇女的人体试验中，表明每日皮下注射低剂量的PTH-(1-34)导致令人印象深刻的脊柱和股骨颈中骨生成，显著降低脊椎骨折的发生率。这些临床数据揭示，PTH是所测试的骨质疏松的最有效的药物之一。
截短的PTH片段的AC/cAMP活化减弱，其合成代谢活性同样减弱。Rixon等(1994)，J.Bone Min.Res.91179-89；Hilliker等(1996)，Bone19469-477；Lane等(1996)，J.Bone Min.Res.11614-25。这类截短的PTH片段的这种活性减弱(Rixon等(1994)；Hilliker等(1996)；Lane等(1996))，即使它们保留对PKC的全部激动作用。Rixon等，(1994)。这些观测结果导致提出AC/cAMP途径对于PTH的骨合成代谢特性是重要的，而PLC/PKC途径在这一方面却不是必要的。Rixon等，(1994)；Wbitfield等(1996)，Calcified Tissue International5381-7。
一种相反但不是相互排斥的理论提出，PLC的活化(除激活AC外)也可能是合成代谢PTH片段的一个重要的特性。Takasu(1998)，Endocrinol.1394293-9。表面上缺乏某些合成代谢的C末端截短PTH肽对PLC活化，可能是测定方法不灵敏以及受体结合较低的人为现象。Takasu(1998)。从PTH-(1-34)的C末端渐进截短，导致对PTH1R的结合亲和性逐步降低。Takasu(1998)。通过PTH-1受体的PKC活化看来对结合亲和性以及对受体密度非常敏感(Guo等(1995)，Endocrinol1363884-91)，而cAMP活化对这些变量却不大敏感。因此，与hPTH-(1-34)相比，hPTH-(1-31)对PTH-1受体的亲和性略微降低(1-6倍)，而hPTH-(1-30)的亲和性显著降低(10-100倍)。Takasu(1998)。也许由于这种降低的PTH-1受体亲和性，PTH-(1-30)是通过大鼠PTH-1受体激活PLC的弱且不完全的激动剂。
与PTH-(1-34)相比，PTH-(1-31)的合成潜能(Rixon等(1994)；Whitfield等(1996)，Calcified Tissue International5381-7；Whitfield等(1996)，Calcified Tissue International65143-7)、对PTH1R的结合亲和性以及cAMP诱导(Takasu(1998))相似或略微降低。PTH-(1-31)的PLC激活也略微降低。Takasu(1998)。在健康人体中，输注PTH-(1-31)和PTH-(1-34)对血浆和尿cAMP浓度有相似的刺激效应，但与PTH-(1-34)不同，PTH-(1-31)不能升高血清钙、血浆1，25(OH)2D3或尿N-TX水平。Fraher等(1999)，J.Clin.Endocrin.Met.842739-43。这些数据提示，PTH-(1-31)诱导骨吸收和刺激维生素D合成的能力减弱，这对于骨合成代谢药是合适的分布型(profile)。
PTH-(1-30)最初表明缺乏合成特性。Whitfield等(1996)，CalcifiedTissue International5381-7。然而，最近已经证明，PTH-(1-30)当以非常高剂量(400-2,000μg/kg，而PTH-(1-34)为80μg/kg)给予时是一种合成代谢药。根据其对PTH-1受体的结合亲和性较低、对cAMP的活化减弱和/或其对PKC的活化大大减弱，可以预测PTH-(1-30)的功效较低。Takasu(1998)。有待确定PTH-(1-30)的表观骨吸收活性是否相似或甚至更为理想地降低。
PTH-(1-28)是所报道的完全激活cAMP的最小片段。Neugebauer等(1995)，Biochem.348835-42。然而，最初报道hPTH-(1-28)在OVX大鼠中没有成骨效应。Miller等(1997)，J.Bone Min.Res.12S320(Abstact(摘要))。最近，表明非常高剂量的PTH-(1-28)(1,000μg/kg天)在OVC大鼠中具有合成代谢活性，而200μg/kg/天无效。Whitfield等(2000)，J.Bone Min.Res.15964-70。某些截短的PTH片段的合成作用减弱或缺乏已经归因于在体内被快速清除。Rixon等(1994)。
重组和经修饰的蛋白质是刚出现的一类治疗药。蛋白治疗药的有用修饰包括与抗体的“Fc”区结合以及与诸如聚乙二醇(PEG)和葡聚糖之类的聚合物连接。这类修饰在美国顺序号为09/428,082、PCT申请号为WO99/25044的题为“Modified Peptides as Therapeutic Agents，”的专利申请有详细的讨论，该文献通过引用全部结合到本文。
研制治疗药的一种相当不同的方法是肽文库筛选。蛋白配体与其受体的相互作用通常发生在相对大的界面上。然而，正如人生长激素及其受体所表现的，在界面上仅少数关键残基影响大部分结合能。Clackson等(1995)，Science267383-6。大多数蛋白配体仅以适当的拓扑结构展示结合表位，或者用于与结合无关的功能。因此，仅“肽”长度(2-40个氨基酸)的分子可以与特定大蛋白配体的受体蛋白结合。这类肽可以模拟所述大蛋白配体的生物活性(“肽激动剂”)，或者通过竞争性结合，抑制所述大蛋白配体的生物活性(“肽拮抗剂”)。
噬菌体展示肽文库作为鉴定这类肽激动剂和拮抗剂的有效方法出现。参见例如Scott等(1990)，Science249386；Devlin等(1990)，Science249404；1993年6月29日授予的美国专利第5,223,409号；1998年3月31号授予的美国专利第5,733,731号；1996年3月12日授予的美国专利第5,498,530号；1995年7月11日授予的美国专利第5,432,018号；1994年8月16日授予的美国专利第5,338,665号；1999年7月13日授予的美国专利第5,922,545号；1996年12月19日公布的WO96/40987；以及1998年4月16日公布的WO98/15833(每篇文献通过引用全部结合到本文)。在这类文库中，随机肽序列通过与丝状噬菌体的外壳蛋白融合而被展示出来。通常，将已展示的肽从受体的抗体固定化胞外域中亲和洗脱下来。通过连续多轮的亲和纯化和重新繁殖，可以富集所保留的噬菌体。可以对最佳结合肽进行测序，以鉴定一个或多个结构相关肽家族内的关键残基。参见例如Cwirla等(1997)，Science2761696-9，其中鉴定出两个不同的家族。所述肽序列也提示哪些残基可以通过丙氨酸扫描或通过诱变在DNA水平上被安全取代。可以构建诱变文库，并对其进行筛选以进一步优化所述最佳结合物的序列。Lowman(1997)，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26401-24。
蛋白质-蛋白质相互作用的结构分析也可以用来提示模拟大蛋白配体结合活性的肽。在这种分析中，晶体结构可以提示大蛋白配体中关键残基的身份和相对取向，据此可以设计肽。参见例如Takasaki等(1997)，Nature Biotech.151266-70。这些分析方法也可以用来研究受体蛋白和通过噬菌体展示选择的肽之间的相互作用，这可以提示可提高结合亲和性的肽的进一步修饰。
其它方法在肽的研究方面与噬菌体展示竞争。可以将肽文库与lac阻抑蛋白的羧基末端融合，并在大肠杆菌中表达。另一种基于大肠杆菌的方法允许通过与肽聚糖相关脂蛋白(PAL)融合而展示在细胞外膜上。此后，这些方法和相关方法被统称为“大肠杆菌展示”。在另一种方法中，在核糖体释放之前停止随机RNA的翻译，产生仍连接有其相关RNA的多肽的文库。此后，这种方法和相关方法被统称为“核糖体展示”。其它方法利用与RNA结合的肽；例如PROfusion technology，Phylos，Inc。参见例如Roberts和Szostak(1997)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9412297-303。此后，这种方法和相关方法被统称为“RNA-肽筛选”。已经开发了化学衍生肽文库，其中肽被固定化在稳定的非生物材料上，例如在聚乙烯棒或溶剂可渗透的树脂上。另一种化学衍生肽文库利用光刻法扫描固定在载玻片上的肽。此后，这种方法和相关方法被统称为“化学-肽筛选”。化学-肽筛选的优势可能在于，它允许应用D-氨基酸和其它非天然类似物以及非肽成分。生物法和化学法都在Wells和Lowman(1992)，Curr.Opin.Biotechnol.3355-62中有综述。在概念上，人们可以利用噬菌体展示、RNA-肽筛选以及其它上述方法发现任何蛋白质的肽模拟物。
发明概述本发明涉及调节PTH和PTHrP活性的治疗药。按照本发明，PTH和PTHrP的调节剂包含a)一个PTH/PTHrP调节结构域，最好是PTH和/或PTHrP的PTH/PTHrP调节结构域的氨基酸序列，或是通过噬菌体展示、RNA-肽筛选或其它上述技术由其衍生的序列；和b)一个载体，例如聚合物(例如PEG或葡聚糖)或优选Fc区；其中所述载体与所述PTH/PTHrP调节结构域的羧基末端共价连接。优选的载体是Fc区，优选的Fc区是IgG Fc区。优选PTH/PTHrP调节结构域包含下文描述的PTH和PTHrP衍生氨基酸序列。其它PTH/PTrP调节结构域可以通过噬菌体展示、RNA-肽筛选和本文所述的其它技术构建。这类肽通常是PTH和PTHrP两者的拮抗剂，虽然这类技术可以用来构建用作选择性抑制剂(例如PTH的抑制剂，而非PTHrP的抑制剂)的肽序列。
按照本发明的再一方面是制备PTH和PTHrP调节剂的方法，所述方法包括a)选择至少一种与PTH-1或PTH-2受体结合的肽；和b)将所述肽与载体共价连接。优选的载体是Fc区。步骤(a)最好通过从下文的表1和表2中的肽序列中选择、或者用噬菌体展示、RNA-肽筛选或本文所述的其它技术来进行。
本发明的化合物可以用标准合成法、重组DNA技术或制备肽和融合蛋白的任何其它方法来制备。包括非肽部分的本发明的化合物除适用时用标准肽化学反应合成外，还可以通过标准有机化学反应来合成。
本发明化合物的设想的主要用途是作为治疗药或预防药。所述载体连接的肽可以具有与所述肽所模拟的天然配体相当或甚至更高的活性。
本发明的化合物可以通过用合适的药用载体材料配制，并且给予患者例如有其需要的人类(或其它哺乳动物)有效量的所述化合物，用于治疗目的或预防目的。其它相关方面也包括在本发明中。
在本发明中特别感兴趣的是包含PTH C末端序列缩短的PTH/PTHRP调节结构域例如PTH-(1-28)或(1-34)的分子。现有技术没有介绍采用持续给予这类C末端截短的PTH片段的合成代谢研究。虽然现有技术没有提示这一点，但包含较小片段的分子例如PTH-(1-30)-Fc可以独自合成代谢。尽管它们对PLC的激动作用弱(参见发明背景部分)，但hPTH-(1-30)在刺激cAMP方面几乎与hPTH-(1-34)一样有效。虽然不希望受理论的限制，但本发明人注意到，PTH片段的合成代谢特性可能选择性地与其cAMP激活相关，而非与PLC激活相关，使得受体亲和性降低的PTH片段将具有有利的合成代谢分布型。与Fraher等(1999)已经在人体中证明的连续暴露于PTH-(1-34)或PTH-(1-84)相比，有可能连续暴露于截短的PTH片段对骨有不同的更为有利的效应。
考虑附图和发明详述，本发明的许多其它方面和优点将变得显而易见。
附图简述

图1显示示例性的Fc二聚体，所述Fc二聚体可以来源于IgG1抗体。图中的“Fc”代表本文“Fc区”含义中的任何Fc变异体。“X1”和“X2”代表下文定义的肽或接头-肽组合。具体的二聚体如下A单二硫键结合的二聚体。IgG1抗体通常在恒定区和可变区之间的铰链区有两个二硫键。图1A中的Fc区可以通过在所述两个二硫键位点之间截短、或者通过用非反应性残基(例如丙氨酰)取代半胱氨酰残基来形成。在图1A中，Fc区连接于所述肽的C末端。
B双二硫键结合的二聚体。这种Fc区可以通过截短母体抗体以保留F区链中的两个半胱氨酰残基、或者通过从包含编码这种Fc区的序列的构建体表达来形成。在图1B中，Fc区连接于所述肽的C末端。
C非共价二聚体。这种Fc区可以通过或者截短或者取代消除所述半胱氨酰残基而形成。人们可能希望消除所述半胱氨酰残基，以避免由于所述半胱氨酰残基与宿主细胞中存在的其它蛋白的半胱氨酰残基之间反应而生成杂质。所述Fc区的非共价结合足以使所述二聚体保持在一起。其它二聚体可以通过利用得自不同类型抗体(例如IgG2，IgM)的Fc区来形成。
图2显示了本发明其它化合物的结构。图2A显示了一种单链分子，也可以代表所述分子的DNA构建体。图2B显示了一种二聚体，其中所述接头-肽部分仅存在于所述二聚体的一条链中。图2C显示了一种在两条链上都具有肽部分的二聚体。图2C的二聚体在编码图3所示单链的DNA构建体表达时，在某些宿主细胞中自发形成。在其它宿主细胞中，可以将细胞置于适合于形成二聚体的条件下，或者可以在体外形成所述二聚体。
图3显示了可以用于本发明的示例性的人IgG1 Fc核酸序列和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO1和2)。
图4显示正常小鼠对PTH-(1-34)和对PTH-(1-34)-Fc的钙血反应。小鼠用溶媒(PBS，-X-)或PTH-(1-34)(空心符号)或PTH-(1-34)-Fc(实心符号)攻击。剂量为156nmo/kg(圆形)、469nmol/kg(三角形)或1,560nmol/kg(方形)。数据代表组的平均值，n＝6只小鼠/组。
图5表明，[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc抑制正常小鼠对PTHrP的钙血反应。给正常雄性小鼠皮下注射溶媒(PBS，圆形)、或0.5mg/kg人PTHrP-(1-34)(方形)。然后立即给PTHrP攻击的小鼠皮下注射10mg/kg(三角形)或30mg/kg(菱形)[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc。数据代表组的平均值，n＝6只小鼠/组。
图6显示[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc对PTH-(1-34)-Fc诱发的慢性高钙血的效应。正常雄性小鼠通过皮下注射PTH-(1-34)-Fc(30mg/kg)(空心圆形)或溶媒(PBS，空心方形)进行攻击。某些PTH-(1-34)-Fc攻击的小鼠在攻击时用10(实心三角形)、30(实心圆形)或100mg/kg(实心方形)的[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc治疗一次。所有剂量的[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc都引起对PTH-(1-34)-Fc介导的高钙血的显著抑制。数据代表平均值±SEM，n＝5只小鼠/组。
图7显示ROS 17/2.8大鼠成骨细胞样细胞中的cAMP积累。培养物用磷酸二酯酶抑制剂IBMX处理，然后用各种PTH片段攻击15分钟。通过ELISA测定cAMP。
图8显示单一疗法对临床化学的影响。每日在一次皮下注射所示化合物后获取外周血达3天。图8A显示总血清钙；图8B，碱性磷酸酶(AP)，一种成骨细胞活性标记；图8C，酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRAP)，一种破骨细胞活性标记；和图8D，AP∶TRAP比值，一种相对成骨细胞破骨细胞活性的指标。
图9显示PTH构建体对骨盐密度的影响。在第0天、第5天和第10天注射PTH构建体后，在第15天对小鼠近端胫骨干骺端进行外周定量计算机体层摄影(pQCT)。
图10显示每周两次PTH-(1-34)-Fc相对于每日PTH-(1-34)对胫骨小梁和皮质骨盐密度(BMD)的影响。每日给予80μg/kg/天(20nmol/kg/天)PTH[PTH-(1-34)]。
图11显示每周两次治疗对年老卵巢切除(OVX)大鼠BMD和血清钙的影响。OVX后11个月，大鼠每周两次用磷酸缓冲盐溶液(PBS，溶媒)或APD(0.5mg/kg)或PTH-(1-34)-Fc(50nmol/kg)治疗。每周进行DEXA。第二次每周注射后24小时取血，此时PTH-Fc的钙血效应通常最大。
图12显示给OVX猕猴一次皮下注射PTH-(1-34)-Fc的效应。给猴子注射1-30μg/kg(n＝1/组)或100-1000μg/kg(n＝2/组)剂量的PTH-(1-34)-Fc。分析血清中的总钙。虚线表示高钙血阈值，该阈值基于在两个或多个连续时间点高于正常平均值三个标准偏差的钙升高。
发明详述术语的定义在本说明书中使用的术语如下定义，除非在具体情况下另有限定。
术语“包含”是指化合物可以在给定序列的N末端或C末端或这两端包含额外的氨基酸。当然，这些额外的氨基酸应该不会显著干扰所述化合物的活性。
术语“酸性残基”是指其侧链包含酸性基团的D型或L型氨基酸残基。示例性的酸性残基包括D和E。
术语“芳族残基”是指其侧链包含芳族基团的D型或L型氨基酸残基。示例性的芳族残基包括F、Y和W。
术语“碱性残基”是指其侧链包含碱性基团的D型或L型氨基酸残基。示例性的碱性残基包括H、K和R。
术语“亲水性残基”和“Haa”是指其侧链包含至少一个亲水性官能团或极性基团的D型或L型氨基酸残基。示例性的亲水性残基包括C、D、E、H、K、N、Q、R、S和I。
术语“亲脂性残基”和“Laa”是指其侧链包含不带电脂族或芳族基团的D型或L型氨基酸残基。示例性的亲脂性侧链包括F、I、L、M、V、W和Y。丙氨酸(A)是两亲性的-它能够用作亲水性或亲脂性残基。因此，丙氨酸既包括在“亲脂性残基”的定义中，也包括在“亲水性残基”的定义中。
术语“非官能性残基”是指其侧链缺乏酸性、碱性或芳族基团的D型或L型氨基酸残基。示例性的非官能性氨基酸残基包括M、G、A、V、I、L和异亮氨酸(Nle)。
术语“载体”是指防止治疗蛋白降解和/或增加其半寿期、降低其毒性、降低其免疫原性或提高其生物活性的分子。示例性的载体包括Fc区(这是优选的)以及线性聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、聚赖氨酸、葡聚糖等)；支链聚合物(参见例如1981年9月15日授予Denkenwalter等的美国专利第4,289,872号；1993年7月20日授予Tam的5,229,490；1993年10月28日公布的Frechet等的WO 93/21259)；脂质；胆固醇基团(例如类固醇)；糖类或寡糖(例如葡聚糖)；人血清白蛋白(HSA)和相关分子；甲状腺素运载蛋白(transtheratin)(TTR)和相关分子；或与补救受体结合的任何天然或合成蛋白质、多肽或肽。载体在下文中有进一步的描述。
术语“天然Fc”是指包含通过消化全抗体产生的非抗原结合片段序列的分子或序列，无论是单体形式还是多聚体形式。天然Fc的原始免疫球蛋白来源最好来源于人类，可以是任何免疫球蛋白，虽然优选IgG1和IgG2。天然Fc由单体多肽构成，可以通过共价连接(即二硫键)和非共价连接将其连接为二聚体或多聚体形式。天然Fc分子单体亚单位之间的分子间二硫键数目范围1-4，取决于类别(例如IgG，IgA，IgE)或亚类(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgAl，IgGA2)。天然Fc的一个实例是通过木瓜蛋白酶消化IgG产生的二硫键连接的二聚体(参见Ellison等(1982)，Nucleic Acids Res.104071-9)。本文所用的术语“天然Fc”一般为单体、二聚体和多聚体形式。
术语“Fc变异体”是指由天然Fc经修饰、但仍包含所述补救受体FcRn的结合部位的分子或序列。国际申请WO97/34631(1997年9月25日公布)和WO96/32478描述了示例性的Fc变异体以及与补救受体的相互作用，所述文献通过引用全部结合到本文中。因此，术语“Fc变异体”包括由非人类天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可以被除去的位点，因为这些位点提供的结构特征或生物活性并非本发明融合分子所需的。因此，术语“Fc变异体”包括缺乏影响或涉及以下特性的一个或多个天然Fc位点或残基的分子或序列(1)二硫键形成，(2)与所选宿主细胞不匹配，(3)在所选宿主细胞中表达时的N末端异质性，(4)糖基化，(5)与补体相互作用，(6)与非补救受体的Fc受体结合，或(7)抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。Fv变异体在下文中有进一步的详细描述。
术语“Fc区”包括以上限定的天然Fc和Fc变异体分子和序列。对于Fc变异体和天然Fc，术语“Fc区”包括单体或多聚体形式的分子，无论它是通过全抗体消化而来还是用其它方法生产的。
用于Fc区或包含Fc区的分子的术语“多聚体”是指具有共价、非共价或共价和非共价相互作用两者结合的两条或更多条多肽链的分子。IgG分子通常形成二聚体；IgM，五聚体；IgD，二聚体；以及IgA，单体、二聚体、三聚体或四聚体。通过利用Fc的天然Ig源的序列以及所得活性，或通过将这种天然Fc衍生化(如上限定的)，可以形成多聚体。
用于Fc区包含Fc区的分子的术语“二聚体”是指具有共价或非共价结合的两条多肽链的分子。因此，本发明范围内的示例性二聚体示于图1和图2。
术语“衍生化”和“衍生的”或“衍生化的”分别包括方法和所得的化合物，其中(1)所述化合物具有一个环部分；例如所述化合物内半胱氨酰残基之间的交联；(2)所述化合物是交联的或者具有一个交联位点；例如，所述化合物具有一个半胱氨酰残基，并且因此在培养中或在体内形成交联二聚体；(3)一个或多个肽键被非肽键取代；(4)N末端被-NRR1、NRC(O)R1、-NRC(O)OR1、-NRS(O)2R1、NHC(O)NHR、琥珀酰亚胺基、或者取代或未取代的苄酯基-NH-取代，其中R和R1以及所述环取代基如下文定义；(5)C末端被-C(O)R2或-NR3R4取代，其中R2、R3和R4如下文定义；和(6)其中各个氨基酸部分通过用能够与所选侧链或末端残基反应的试剂处理而修饰的化合物。衍生物在下文有进一步的描述。
术语“肽”是指具有1-85个氨基酸的分子，优选具有5-34个氨基酸的分子。示例性的肽可以包含天然存在的分子的PTH/PTHrP调节结构域或者包含随机化序列。
用于指肽序列的术语“随机化”是指完全随机的序列(例如通过噬菌体展示法或RNA-肽筛选选择的)和其中天然存在的分子的一个或多个残基被在所述天然存在分子中的该位置中不存在的氨基酸残基所取代的序列。用于鉴定肽序列的示例性方法包括噬菌体展示、大肠杆菌展示、核糖体展示、RNA-肽筛选、化学筛选等等。
术语“PTH/PTHrP调节结构域”是指与PTH-1受体和/或PTH-2受体结合、并且包含天然存在的序列或随机化序列的任何氨基酸序列。示例性的PTH/PTHrP调节结构域可以如表1和表2中所列文献中描述的方法鉴定或衍生化，所述文献通过引用全部结合到本文中。
术语“PTH激动剂”是指与PTH-1或PTH-2受体结合并且如全长天然人甲状旁腺激素一样提高或降低一种或多种PTH活性测定参数的分子。一种示例性的PTH活性测定公开于实施例1中。
术语“PTH拮抗剂”是指与PTH-1或PTH-2受体结合并且阻断或阻止全长天然人甲状旁腺激素对那些参数的正常影响的分子。一种示例性的PTH活性测定公开于实施例2中。
术语“骨吸收抑制剂”是指通过WO97/23614的实施例4和实施例11的测定确定的这类分子；所述文献通过引用全部结合到本文中。示例性的骨吸收抑制剂包括OPG和OPG-L抗体，所述抗体分别在WO97/23614和WO98/46751中有描述，所述文献通过引用全部结合到本文中。
另外，本发明化合物的生理上可接受的盐也包括在此中。所谓“生理上可接受的盐”是指已知或者以后被发现为药学上可接受的任何盐。某些具体实例是乙酸盐；三氟乙酸盐；氢卤酸盐，例如盐酸盐和氢溴酸盐；硫酸盐；柠檬酸盐；酒石酸盐；乙醇酸盐；和草酸盐。
化合物的结构一般概述.PTH和PTHrP受体结合氨基酸序列描述于表1和表2中。关于PTH和PTHrP的其它信息可在Mannstadt等(1999)，Am.J.Physiol.277.5Pt 2F66575；和Gardella(1996)，J.Biol.Chem.271(33)19888-93中找到。这些文献中的每篇通过引用全部结合到本文中。
根据上述序列，本发明人鉴定了由PTH和PTHrP衍生的特别优选的序列。这些序列可以通过将一个或多个氨基酸改变而保留或甚至改进所述肽的结合亲和性的上述技术来随机化。
在按照本发明制备的主题组合物中，可以将所述肽通过所述肽的C末端与载体连接。因此，本发明的载体-肽分子可以用以下式I描述IP1-(L1)a-F1及其多聚体，其中F1是载体(优选Fc区)并且连接于P1-(L1)a的C末端；P1是PTH/PTHrP调节结构域序列；L1是接头；且a是0或1。
肽.任何数目的肽都可以与本发明结合使用。肽可以包含天然存在的蛋白质序列的一部分，可以是由所述天然存在的蛋白质序列衍生的随机化序列，或者可以是全随机化序列。噬菌体展示和RNA-肽筛选尤其可用于产生可供用于本发明的肽。
特别感兴趣的PTH/PTHrP调节结构域序列是式II的序列IIXNX8HX10X11X12KX14X15X16X17X18X19RX21X22X23X24X25X26X27X28XC(SEQ ID NO3)其中XN不存在或为X3X4X5X6X7、X2X3X4X5X6X7、X1X2X3X4X5X6X7，或YX1X2X3X4X5X6X7；X1为一个氨基酸残基(优选非官能性、亲水性或芳族残基；优选A、S或Y)；X2为一个氨基酸残基(优选非官能性残基，最优选V)；X3为一个氨基酸残基(优选亲水性残基，最优选S)；X4为一个氨基酸残基(优选酸性残基，最优选E)；X5为一个氨基酸残基(优选非官能性或碱性残基，最优选H或I)；X6为一个氨基酸残基(优选酸性或亲水性残基，最优选Q或E)；X7为一个氨基酸残基(优选非官能性或芳族残基，最优选L或F)；X8为一个氨基酸残基(优选非官能性残基，最优选M或Nle)；X10为一个氨基酸残基(优选酸性或亲水性残基，最优选N或D)；X11为一个氨基酸残基(优选非官能性或碱性残基，最优选L、R或K)；X12为一个氨基酸残基(优选非官能性或芳族残基，最优选G、F或W)；X14为一个氨基酸残基(优选碱性或亲水性残基，最优选H或S)；X15为一个氨基酸残基(优选非官能性残基，最优选L或I)；X16为一个氨基酸残基(优选非官能性或亲水性残基，最优选Q、N、S或A)；X17为一个氨基酸残基(优选酸性、亲水性或非官能性残基，最优选S、D或L)；
X18为一个氨基酸残基(优选非官能性残基，最优选M、L、V或Nle)；X19为一个氨基酸残基(优选酸性或碱性残基，最优选E或R)；X21为一个氨基酸残基(优选非官能性残基或碱性残基；最优选V、M、R或Nle)；X22为一个氨基酸残基(优选亲水性、酸性或芳族残基，最优选E或F)；X23为一个芳族或亲脂性残基(优选W或F)；X24为一个亲脂性残基(优选L)；X25为一个氨基酸残基(优选亲水性或碱性残基，最优选R或H)；X26为一个氨基酸残基(优选亲水性或碱性残基，最优选K或H)；X27为一个氨基酸残基(优选亲脂性、碱性或非官能性残基，最优选K或L)；X28为一个氨基酸残基(优选亲脂性或非官能性残基，最优选L或I)；XC不存在或为X29、X29X30、X29X30X31、X29X30X31X32、X29X30X31X32X33、X29X30X31X32X33X34、X29X30X31X32X33X34X35或X29X30X31X32X33X34X35X36；X29为一个氨基酸残基(优选亲水性或非官能性残基，最优选Q或A)；X30为一个氨基酸残基(优选亲水性或酸性残基，最优选D或E)；X31为一个氨基酸残基(优选亲脂性或非官能性残基，最优选V或I)；X32为一个氨基酸残基(优选碱性残基，最优选H)；X33为一个氨基酸残基(优选亲水性残基，最优选N或T)；X34为一个氨基酸残基(优选非官能性或芳族残基，最优选A、F或Y)；X35为一个氨基酸残基(优选酸性残基，最优选E)；且
X36为一个氨基酸残基(优选芳族残基，最优选Y)。
一种优选的PTH/PTHrP调节结构域序列分子式为IIIJNJ7J8HNLJ12KHLJ16SJ18J19RJ21EWLRKKLJc(SEQ ID NO4)其中JN不存在或选自J1J2J3J4J5J6、J2J3J4J5J6、J3J4J5J6；J1为一个氨基酸残基(优选非官能性、亲水性或芳族残基；最优选A、S或Y)；J2为一个氨基酸残基(优选非官能性残基，最优选V)；J3为一个氨基酸残基(优选亲水性残基，最优选S)；J4为一个氨基酸残基(优选酸性残基，最优选E)；J5为一个氨基酸残基(优选非官能性残基，最优选I)；J6为一个氨基酸残基(优选碱性残基，优选Q)；J7为一个氨基酸残基(优选非官能性或芳族残基，最优选L或F)；J8为一个氨基酸残基(优选非官能性残基，最优选M或Nle)；J12为一个氨基酸残基(优选非官能性或芳族残基，最优选G或W)；J16为一个氨基酸残基(优选非官能性或亲水性残基，最优选N、S或A)；J18为一个氨基酸残基(优选非官能性残基，最优选M、Nle、L或V)；J19为一个酸性或碱性残基(优选E或R)；J21为一个氨基酸残基(优选非官能性残基，最优选V、M或Nle)；Jc不存在或为J29、J29J30、J29J30J31、J29J30J31J32、J29J30J31J32J33或J29J30J31J32J33J34；J29为一个氨基酸残基(优选亲水性或非官能性残基，最优选Q或A)；
J30为一个氨基酸残基(优选亲水性或酸性残基，最优选D或E)；J31为一个氨基酸残基(优选亲脂性或非官能性残基，最优选V或I)；J32为一个氨基酸残基(优选碱性残基，最优选H)；J33为一个氨基酸残基(优选酸性残基，最优选N)；J34为一个氨基酸残基(优选芳族残基，最优选F或Y)。
从SEQ ID NO4的式中，最优选以下表1中出现的肽。
另一种优选的PTH/PTHrP调节结构域序列为IVONLHO10O11O12KSIO15O16LRRRFO23LHHLIOC(SEQ ID NO5)其中ON不存在或为YO1O2O3O4O5O6O7、O1O2O3O4O5O6O7、O2O3O4O5O6O7、O3O4O5O6O7、O4O5O6O7、O5O6O7、O6O7或O7；O1为一个氨基酸残基(优选非官能性残基，最优选A)；O2为一个氨基酸残基(优选非官能性残基，最优选V)；O3为一个氨基酸残基(优选亲水性残基，最优选S)；O4为一个氨基酸残基(优选酸性残基，最优选E)；O5为一个氨基酸残基(优选碱性或非官能性残基，优选H或I)；O6为一个氨基酸残基(优选亲水性残基，最优选Q)；O7为一个氨基酸残基(优选非官能性残基，最优选L)；O10为一个氨基酸残基(优选酸性或亲水性残基，最优选N或D)；O11为一个氨基酸残基(优选碱性或非官能性残基，最优选K或L)；O12为一个氨基酸残基(优选芳族或非官能性残基，最优选G、F或W)；O15为一个氨基酸残基(优选亲水性或非官能性残基，最优选I或S)；
O16为一个氨基酸残基(优选亲水性残基，最优选Q或N)；O17为一个氨基酸残基(优选酸性或非官能性残基，最优选D或L)；O23为一个氨基酸残基(优选芳族残基，最优选F或W)；OC不存在或为O29，O29O30，O29O30O31，O29O30O31O32，O29O30O31O32O33、O29O30O31O32O33O34，O29O30O31O32O33O34O35或O29O30O31O32O33O34O35O36；且O29-O36分别独立地为氨基酸残基。
根据SEQ ID NO5的分子式，最优选以下表2中出现的肽。
本发明的示例性肽序列示于以下表1和表2中。这些肽可以如所引用的参考文献中或美国专利第4,423,037、4,968,669、5,001,22和6,051,686号中所述的方法制备，每篇所述文献通过引用全部结合到本文中。掺入这些肽序列的本发明的分子可以通过本领域已知的方法制备。使用单字母氨基酸缩写。任何这些肽可以与接头串连(即顺序)连接或不与接头连接。含有半胱氨酰残基的任何肽可以与另一含Cys肽交联，两者中的一个或两个可以与载体连接。具有不止一个Cys残基的任何肽也可以形成肽内二硫键。任何这些肽可以如下文所述衍生化。
表1-基于PTH的PTH/PTHrP调节结构域
1Hendy等(1981)，Prpc.Natl.Acad.Sci USA787365；Kimura等(1983)，Biovhem.Biophys.Res.Commun.114493；Zanelli等(1985)，Endocrinology1171962；Wingender等(1985)，J.Biol.Chem.2644367。
2Heinrich等(1984)，J.Biol.Chem.2593320.3Bachem Catalogue(1999).4Doppelt等(1981)，Calcif.Tissue Int.33649；Podbesek等(1983)Endocrinology1121000；Kent等(1985)，Clin.Sci.68171；McKee和Caulfield(1989)，Peptide Rse.2161；Lee和Russell(1989)；Biopolymers281115；Reeve等(1990)，Br.Med.J.301314；Neugebauer等(1994)，Int.J.Peptide Protein Res.43555.5Nakamura等(1981)；Proc.Soc.Exp.Biol.Med.168168；Law等(1983)，J.Clin.Endocrinol.Metab.561335；Wang等(1984)，Eur.J.Pharmacol.97，209；Sham等(1986)，Gen.Comp.Endocrinol.61148；Smith等(1987)，Arch.Biochem.Biophvs.25381.6基于Coltrera等(1981)，J.Biol.Chem.25610555；Bergeron等(1981)，Endocrinology1091552.7Jouishomme等(1994)，J.Bone Miner.Res.9943；Whitfield和Morlev；TIPS163828BARbier等(1997)，J.Med.Chem.401373.9基于Schipani等(1993)，Endocrinology1322157-65.10Scharla等(1991)，Horm.Metab.Res.2366-9；McGowan等(1983)，Science21967；Lowik等(1985)，Cell Calcium6311.11基于Jobert等(1997)，Endocrinology1385282；Schipani等(1993)；Rosenblatt等(1977)，J.Biol.Chem.2525847；Segre等(1979)，J.Biol.Chem.2546980；
Nussbaum等(1980)，J.Biol.Chem.22510183；Gray等(1980)，Br.J.Pharmac.76259.12Nissenson等(1999)，Endocrinology1401294-1300.13Jueppner等(1996)，Endocrinology.14Horiuchi等(1983)，Science2201053.15Schipani等(1993)；Holick等(1995)，Bone16140S(abstract 223，Conference，Melbourne，February 1995).16基于Dresner-Pollak等(1996)，JBMR111061-5.17Goldman等(1988)，Endocrinology1232597.
表2-基于PTHrP的PTH/PTHrP调节结构域
18Moseley等(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA845048；Suva等(1987)，Science237893；Kemp等(1987)，Science2381568；Paspaliaris等(1995)，Bone16141S(abstract 225，Conference，Melbourne 1995).19基于JP 07316195，May25，1994(Nippon Kayaku).20Nagasaki等(1989)，Biochem.Biophys.Res.Commun.1581036；Nutt等；Endocrinology127，491(1990).21Williams等(1998)，J.Reproduction & Fertility11259-67.22Gardella等(1996)，Endocrinol.1373936-41；Fukayama等(1998)，Am.J.Physiol.274E297-E303.23Li等(1996)，Endocrinology.
24掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO26。25掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO28。26掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO29。27掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO30。28掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO26。29掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO5。
30基于得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NOS8，931掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO1032掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO1133掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO1234掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO1235掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO1436掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO1537掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO1638掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO17和1839掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO1940掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO2041掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO2142掺入得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO2243由得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO23修饰而来
44由得自美国专利第6,051,686号的SEQ ID NO24修饰而来
另一种有用的PTH/PTHrP调节结构域具有称为TIP39的肽序列SLALADDAAFRERARLLAALERRHWLNSYMHKLLVLDAP(SEQ ID NO160)TIP39描述于Usdin等(1999)，Nature Neurosci.2(11)941-3；Usdin等(1996)，Endocrinology137(10)4285-97；Usdin等(1995)，J.Biol.Chem.270(26)15455-8；Usdin等(1999)，Enddocrinol.140(7)3363-71。
其它有用的PTH/PTHrP调节结构域序列可以通过SEQ ID NO3、4、5、TIP39的氨基酸序列或表1和表2中所列序列的保守和/或非保守修饰而产生。
保守修饰将产生其功能特性和化学特性与由其进行这类修饰的PTH或PTHrP肽相似的肽。相反，通过选择在对保持以下特性的影响显著不同的氨基酸序列中的取代(a)取代区中分子骨架的结构，例如为折叠片或螺旋的构象，(b)所述分子的靶位点的电荷或疏水性，或(c)所述分子的大小，可以完成所述肽的功能特性和/或化学特性的显著修饰。
例如，“保守氨基酸取代”可以涉及用非天然残基取代一个天然氨基酸残基，使得对该位置的氨基酸残基的极性或电荷影响很小或没有影响。此外，所述多肽中的任何天然残基也都可以用丙氨酸取代，正如先前关于“丙氨酸扫描诱变”所述的(参见例如MacLennan等，1998，Acta Physiol.Scand.Suppl.64355-67；Sasaki等，1998，Adv.Biophys.351-24，所述文献讨论了丙氨酸扫描诱变)。
所需的氨基酸取代(无论是保守的还是非保守的)可以由本领域技术人员在需要这类取代时决定。例如，氨基酸取代可以用来鉴定所述肽序列中的重要残基，或提高或降低所述肽或本文所述载体-肽分子的亲和性(参见前述分子式)。示例性的氨基酸取代示于表3中。
表3-氨基酸取代
在某些实施方案中，保守氨基酸取代也包括非天然存在的氨基酸残基，所述氨基酸残基通过化学肽合成掺入，而非通过在生物系统中合成而掺入。
如以上“术语的定义”一节中所述，天然存在的残基可以根据可用于序列修饰的共同侧链特性分为多个类别。例如，非保守取代可能涉及这些类别之一的一个成员交换为另一类别的一个成员。可以将这类取代的残基引入所述分子中与非人类直向同源物同源的肽区域中，或者引入所述分子的非同源区中。另外，人们也可以用P或G进行修饰，以影响链的取向。
在制备这类修饰时，可以考虑氨基酸的疏水指数。每种氨基酸根据其疏水性和电荷特性被赋予一个疏水指数，这些是异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域理解所述氨基酸疏水指数对于赋予蛋白质相互作用生物功能方面的重要性。Kyte等，J.Mol.Biol.，157105-131(1982)。已知某些氨基酸可以被取代为具有相似疏水指数或分值的其它氨基酸，但仍保留相似的生物活性。在基于疏水指数进行改变时，优选疏水指数在±2之内的氨基酸取代，特别优选疏水指数在±1之内的氨基酸取代，更特别优选疏水指数在±0.5之内的氨基酸取代。
在本领域也明白，类似氨基酸的取代可以根据亲水性来有效地进行。由其相邻氨基酸的亲水性决定的蛋白质的最高局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性即所述蛋白质的生物学特性相关。
以下亲水性数值赋予氨基酸残基精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于相似亲水性数值进行改变时，优选亲水性数值在±2之内的氨基酸取代，特别优选亲水性数值在±1之内的氨基酸取代，甚至更特别优选亲水性数值在±0.5之内的氨基酸取代。人们也可以根据亲水性从一级氨基酸序列鉴定表位。这些区域也称为“表位核心区”。
本领域技术人员能够采用众所周知的技术，确定如前述序列中所示多肽的合适变异体。为了鉴定所述分子中可以被改变而不破坏活性的合适区域，本领域技术人员可以靶向据认为对于活性不重要的区域。例如，当已知有得自同一物种或其它物种的活性相似的相似多肽时，本领域技术人员可以将肽的氨基酸序列与相似肽的序列进行比较。通过这种比较，人们可以鉴定出在相似多肽中保守的残基和分子部分。人们会认识到，肽中相对于这类相似肽不保守的区域的改变不大可能负面影响所述肽的生物活性和/或结构。本领域技术人员也知道，即使在相对保守的区域中，人们也可以用化学上相似的氨基酸取代天然存在的残基，而保留其活性(保守的氨基酸残基取代)。因此，即使对于生物活性或结构重要的区域也可以进行保守氨基酸取代，而不会破坏所述生物活性，或者不会负面影响所述肽的结构。
另外，本领域技术人员可以考察鉴定相似肽中对于活性或结构重要的残基的结构-功能研究。根据这种比较，人们可以预测肽中与相似肽中对于活性或结构重要的氨基酸残基相对应的氨基酸残基有重要性。本领域技术人员可以选择所述肽中这类预测重要的氨基酸残基的化学相似氨基酸取代。
本领域技术人员也可以分析与相似多肽中结构有关的三维结构和氨基酸序列。根据该信息，本领域技术人员可以预测一种肽的氨基酸残基在其三维结构中的排列。本领域技术人员可以选择不对预测位于所述蛋白质表面的氨基酸残基的基团改变，因为这类残基可能参与与其它分子的重要相互作用。此外，本领域技术人员可以产生在每个所需氨基酸残基上含单氨基酸取代的试验变异体。然后所述变异体可以用本领域技术人员已知的活性测定来筛选。这种数据可以用来综合关于合适变异体的信息。例如，如果人们发现对特定氨基酸残基的改变导致被破坏的、不希望有地被降低的或不合适的活性，则应该避免具有这种改变的变异体。换句话说，根据从这类常规实验综合而来的信息，本领域技术人员可以容易地确定应该单独或结合其它突变避免进一步取代的氨基酸。
许多科学出版物致力于二级结构的预测。参见Moult J.，Curr.Op.in Biotech.，7(4)422-427(1996)，Chou等，Biochemistry，13(2)222-245(1974)；Chou等，Biochemistry，113(2)211-222(1974)；Chou等，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.，4745-148(1978)；Chou等，Ann.Rev.Biochem，47251-276以及Chou等，Biophys.J.，26367-384(1979)。此外，目前可利用计算机程序辅助预测二级结构。一种预测二级结构的方法是基于同源性建模。例如，序列同一性高于30％、或相似性高于40％的两种多肽或蛋白质常常具有相似的结构拓扑结构。最近蛋白质结构数据库(PDB)的增长提供了对二级结构可预测性的加强，包括多肽或蛋白质结构内的潜在折叠数。参见Holm等，Nucl.Acid.Res.，27(1)244-247(1999)。已经提出(Brenner等，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3)369-376(1997))，在给定多肽或蛋白质中折叠数目有限，并且一旦分辨出关键的结构数目，则将显著达到精确的结构预测。
预测二级结构的其它方法包括“穿线(threading)”(Jones，D.，Curr.Opin.Struct.Biol.，7(3)377-87(1997)；Sippl等，Structure，4(1)15-9(1996))、“轮廓分析(profile analysis)”(Bowie等，Science，253164-170(1991)；Gribskov等，Meth.Enzym.，183146-159(1990)；Gribskov等，Proc.Nat.Acad.Sci.，84(13)4355-8(1987))，和“进化连锁(evolutionarylinkage)”(参见Home，见上文，和Brenner，见上文)。
载体.本发明需要存在至少一种通过C末端或所述氨基酸残基之一侧链与肽连接的载体(F1)。也可以使用多种载体；例如在C末端使用Fc而在侧链使用PEG基团。
Fc区是优选的载体。Fc区可以融合于所肽的C末端。
如上所述，Fc变异体是本发明范围内的合适载体。天然Fc可以被广泛修饰，而形成按照本发明的Fc变异体，条件是保持与所述补救受体的结合；参见例如WO97/34631和WO96/32478。在这类Fc变异体中，人们可以除去天然Fc中提供本发明融合分子不需要的结构特征或功能活性的一个或多个位点。人们可以通过例如取代或缺失残基、在该位点中插入残基或截短含所述位点的部分，除去这些位点。所插入或取代的残基也可以是经改变的氨基酸，例如肽模拟物或D-氨基酸。Fc变异体由于多种原因可能是需要的，下文描述了其中某些原因。示例性的Fc变异体包括这样的分子和序列，其中1.除去参与二硫键形成的位点。这种除去可以避免与用来生产本发明分子的宿主细胞中存在的其它含半胱氨酸蛋白质反应。为此，可以在N末端截短所述含半胱氨酸的区段，或者可以缺失半胱氨酸残基或用其它氨基酸(例如丙氨酰或丝氨酰)取代。特别是，人们可以截短SEQ ID NO2的N末端20个氨基酸的区段，或缺失或取代SEQ ID NO2中位置7和10的半胱氨酸残基。即使除去半胱氨酸残基，所述单链Fc区仍可以形成非共价保持在一起的二聚Fc区。
2.修饰天然Fc，使其与所选宿主细胞更为匹配。例如，人们可以除去典型天然Fc N末端附近的PA序列，该序列在大肠杆菌中被例如脯氨酸亚氨基肽酶的消化酶所识别。人们也可以添加一个N末端甲硫氨酸残基，尤其是当所述分子在细菌细胞例如大肠杆菌中重组表达时。SEQ ID NO2的Fc区是一种这样的Fc变异体。
3.除去天然Fc N末端的一部分，以在所选宿主细胞中表达时防止N末端异质性。为此，人们可以缺失N末端前20个氨基酸残基中的任何残基，特别是位置1、2、3、4和5的残基。
4.除去一个或多个糖基化位点。通常被糖基化的残基(例如天冬酰胺)可能赋予溶细胞反应。这类残基可以缺失或者用非糖基化残基(例如丙氨酸)取代。
5.除去参与与补体相互作用的位点，例如C1q结合部位。例如，人们可以缺失或取代人IgG1的EKK序列。补体募集对于本发明的分子可能并不有利，因此这种Fc变异体可以避免这类位点。
6.除去影响与非补救受体的Fc受体结合的位点。天然Fc可能具有与某些白细胞相互作用的位点，这些位点对于本发明的融合分子并不需要，因此除去这类位点。
7.除去ADCC位点。ADCC位点是本领域已知的；参见例如Molec.Immunol.29(5)633-9(1992)关于IgG1中的ADCC位点的内容。这些位点也是本发明融合分子不需要的，因此可以将其除去。
8.当所述天然Fc来源于非人类抗体时，可以将所述天然Fc人源化。通常，为了将天然Fc人源化，人们会用正常在人类天然Fc中存在的残基取代在所述非人类天然Fc中的所选残基。用于抗体人源化的技术是本领域众所周知的。
优选Fc变异体包括以下变异体。在SEQ ID NO2(图4)中，位置15的亮氨酸可以用谷氨酸取代；位置99的谷氨酸可以用丙氨酸取代；且位置101和103的赖氨酸可以用丙氨酸取代。另外，可以用苯丙氨酸残基取代一个或多个酪氨酸残基。
一种替代的载体可以是蛋白质、多肽、肽、抗体、抗体片段或能够与补救受体结合的小分子(例如肽模拟化合物)。例如人们可以使用1998年4月14日授予Presta等的美国专利第5,739,277号中描述的多肽作为载体。也可以通过噬菌体展示或RNA-肽筛选，选择与FcRn补救受体结合的肽。这种补救受体结合化合物也包括在“载体”含义中，并且在本发明的范围内。这类载体应该根据半寿期增加(例如通过避免被蛋白酶识别的序列)和免疫原性降低(例如通过给予非免疫原性序列，如在抗体人源化中发现的)来选择。
如上所述，也可以使用供F1和F2用的聚合物载体。目前可利用用于连接可用作载体的化学部分的各种方法，参见例如专利合作条约(“PCT”)国际公开说明书WO96/11953，题为“N末端化学修饰的蛋白质组合物和方法”，该文献通过引用全部结合到本文中。该PCT公开说明书其中公开了水溶性聚合物与蛋白质N末端的选择性连接。
一种优选的聚合物载体是聚乙二醇(PEG)。PEG基团可以具有任何方便的分子量，可以是直链或支链的。PEG的平均分子量的范围优选为约2千道尔顿(“KD”)至约100kD，更优选为约5 kD至约50kD，最优选为约5kD至约10kD。PEG基团一般通过酰化或还原烷基化通过PEG部分上的反应基(例如醛、氨基、硫羟基或酯基)连接于本发明化合物上的反应基(例如醛、氨基或酯基)，而与本发明化合物连接。
将合成肽PEG化的一个有用的策略包括通过在溶液中形成缀合连接使分别带有一个相互反应的特殊官能团的肽和PEG部分化合。所述肽可以容易地用常规固相合成法制备。所述肽用合适的官能团在特定位点“预活化”。前体在与PEG部分反应之前进行纯化和全面表征。所述肽和PEG的连接通常发生在水相中，并且可以容易地通过反向分析型HPLC监测。PEG化肽可以容易地通过制备型HPLC纯化，并且通过分析型HPLC、氨基酸分析和激光解附吸谱法来表征。
多糖聚合物是另一种类型的水溶性聚合物，它们可以用于蛋白修饰。葡聚糖是由单独的葡萄糖亚单位组成的多糖聚合物，所述葡萄糖主要通过α1-6键合连接。葡聚糖本身可有多种分子量范围，容易得到分子量为约1kD至约70kD的葡聚糖。葡聚糖是在本发明中本身可用作载体或者结合其它载体(例如Fc)用作载体的合适的水溶性聚合物。参见例如WO96/11953和WO96/05309。与治疗性或诊断性免疫球蛋白缀合的葡聚糖的应用已有报道；参见例如欧洲专利公布号0 315456，该文献通过引用全部结合到本文中。当葡聚糖用作按照本发明的载体时，优选约1kD至约20kD的葡聚糖。
接头.可随意选择任何“接头”基团。当存在接头时，其化学结构并不重要，因为它主要用作间隔区。所述接头最好由通过肽键连接在一起的氨基酸组成。因此，在优选实施方案中，所述接头由通过肽键连接的1-20个氨基酸组成，其中所述氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。这些氨基酸中的某些可以被糖基化，正如本领域技术人员众所周知的。在一个更优选实施方案中，所述1-20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。甚至更优选接头由大部分为非位阻的氨基酸例如甘氨酸和丙氨酸组成。因此，优选的接头为聚甘氨酸(特别是(Gly)4、(Gly)5)，聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。接头的其它具体实例为(Gly)3Lys(Gly)4(SEQ ID NO6)；(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQ ID NO7)；(Gly)3Cys(Gly)4(SEQ ID NO8)；和GlyProAsnGlyGly(SEQ ID NO9)。为了解释上述命名，例如(Gly)3Lys(Gly)4是指Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly。也优选Gly和Ala的组合。本文所示的接头是示例性的；本发明范围内的接头可以长得多，并且可以包括其它残基。
非肽类接头也是可行的。例如可以使用烷基接头如-NH-(CH2)s-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基接头可以用任何非位阻基团例如低级烷基(例如C1-C6)低级酰基、卤素(例如Cl，Br)、CN、NH2、苯基等进一步取代。一个示例性的非肽类接头为PEG接头， 其中n使得所述接头的分子量为100-5000kD，优选100-500kD。可以以与上述相同的方式改变所述肽接头，以形成衍生物。
衍生物.本发明人也考虑了将所述化合物的肽和/或载体部分衍生化。这类衍生物可以改进所述化合物的溶解性、吸收、生物半寿期等。所述部分或者可以消除或减弱所述化合物的不希望有的副作用等。示例性的衍生物包括这样的化合物，其中1.所述化合物或其某一部分是环状的。例如，所述肽部分可以经修饰，以含有两个或更多个Cys残基(例如在接头中)，所述Cys残基可以通过形成二硫键而环化。
2.所述化合物是分子间交联的或者使其能够在分子间交联。例如可以修饰所述肽部分，以含有一个Cys残基，从而能够与类似的分子形成分子间二硫键。所述化合物也可以通过其C末端交联，如在以下所示的分子中。 3.一个或多个肽键[-C(O)NR-]被非肽键取代。示例性的非肽键为-CH2-氨基甲酸酯[-CH2-OC(O)NR-]膦酸酯、-CH2-氨磺酰[-CH2-S(O)2NR-]脲[-NHC(O)NH-]-CH2-仲胺和烷基化肽[-C(O)NR6-，其中R6为低级烷基]。
4.将N末端衍生化。通常，可以将N末端酰化或修饰为取代胺。示例性的N末端衍生基团包括-NRR1(不是-NH2)、-NRC(O)R1、-NRC(O)OR1、-NRS(O)2R1、-NHC(O)NHR1、琥珀酰亚胺或苄酯基-NH-(CBZ-NH-)，其中R和R1各自独立地为氢或低级烷基，并且所述苯环可以用1-3个选自C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、氯和溴的取代基取代。
5.将游离C末端衍生化。通常，将C末端酯化或酰胺化。示例性的C末端衍生基团包括例如-C(O)R2，其中R2是低级烷氧基或-NR3R4，其中R3和R4独立地为氢或C1-C8烷基(最好是C1-C4烷基)。
6.一个二硫键用另一个、最好是更稳定的交联部分(例如亚烷基)取代。参见例如Bhatnagar等(1996)，J.Med.Chem.393814-9；Alberts等(1993)Thirteenth Am.Pep.Symp.，357-9。
7.对一个或多个单个氨基酸残基进行修饰。已知各种衍生化试剂与所选侧链或末端残基特异性地反应，如以下详述的。
赖氨酰残基和氨基末端残基可以与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应，这逆转了赖氨酰残基的电荷。用于将含α-氨基的残基衍生化的其它合适试剂包括亚氨酸酯，例如甲基吡啶亚氨酸甲酯(methylpicolinimidate)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯代氢硼化物(chloroborohydride)；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮；和转氨酶催化与乙醛酸的反应。
精氨酰残基可以通过与几种常规试剂中的任一种或组合反应来修饰，所述常规试剂包括苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酰残基的衍生化要求所述反应在碱性条件下进行，因为胍官能团的pKa高。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团以及精氨酸的ε-氨基反应。
酪氨酰残基的具体修饰已有广泛的研究，特别感兴趣的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应，将光谱标记引入酪氨酰残基中。最为常见的是，分别用N-乙酰咪唑和四硝基甲烷来生成O-乙酰酪氨酰种类和3-硝基衍生物。
羧基侧链基团(天冬氨酰或谷氨酰)可以通过与碳二亚胺(R’-N＝C＝N-R’)例如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺反应，选择性地修饰。此外，可以通过与铵离子反应，将天冬氨酰和谷氨酰残基转化为天冬酰胺酰残基和谷氨酰胺酰残基。
可以将谷氨酰胺酰残基和天冬酰胺酰残基脱酰氨基为相应的谷氨酰残基或天冬氨酰残基。或者，可以将这些残基在温和的酸性条件下脱酰氨基。任一种形式的这些残基落在本发明范围内。
半胱氨酰残基可以被或者消除二硫键或者相反稳定交联的氨基酸残基和其它部分取代。参见例如Bhatnagar等(1996)，J.Med.Chem.393814-9。
用双官能试剂衍生化可用于将所述肽或其官能衍生物与水不溶性支持基质或其它大分子载体交联。常用的交联剂包括例如1，1-双(叠氮乙酰)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯例如与4-叠氮水杨酸形成的酯、同双官能亚氨酸酯(包括二琥珀酰亚胺酯，例如3，3′-二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)和双官能马来酰亚胺(例如双-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷)。衍生化剂例如甲基-3-[(p-叠氮苯基)二硫代]丙亚胺酸酯产生能够在光存在下形成交联的光活化中间体。或者，使用美国专利第3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；和4,330,440号中所述的反应性水不溶性基质例如溴化氰活化的糖类和反应性底物进行蛋白质固定化。
糖类(寡糖)基团可以方便地连接于蛋白质中已知被糖基化的位点。一般而言，O联寡糖连接于丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基，而当天冬酰胺残基作为序列Asn-X-Ser/Thr(其中X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸)的一部分时，N联寡糖连接于天冬酰胺(Asn)残基。X最好是除脯氨酸之外的19种天然存在的氨基酸之一。N联寡糖和O联寡糖的结构以及在每种类型中发现的糖残基是不同的。在两种类型中共同存在的一种类型的糖是N-乙酰神经氨酸(也称为唾液酸)。唾液酸一般是N联和O联寡糖中的末端残基，借助其负电荷，可以赋予糖基化化合物酸性特性。这类位点可以掺入到本发明化合物的接头中，并且最好在所述多肽化合物的重组生产(例如在哺乳动物细胞例如CHO、BHK、COS中)期间被细胞糖基化。然而，这类位点可以通过本领域已知的合成法或半合成法进一步糖基化。
其它可能的修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化；Cys中硫原子的氧化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α-氨基的甲基化。Creighton，ProteinsStructure and MoleculeProperties(W.H.Freeman & Co.，San Francisco)，pp.79-86(1983)。
本发明化合物也可以在DNA水平上改变。所述化合物任何部分的DNA序列可以改变为与所选宿主细胞更匹配的密码子。对于作为优选的宿主细胞的大肠杆菌而言，优化的密码子是本领域已知的。密码子可以被取代，以消除限制位点或以包括沉默的限制位点，这可能有助于所述DNA在所选宿主细胞中的加工。所述载体、接头和肽DNA序列可以经修饰，以包括任何上述序列改变。
制备方法本发明化合物主要可以采用重组DNA技术，在转化宿主细胞中生产。为此，制备编码所述肽的重组DNA分子。制备这类DNA分子的方法是本领域众所周知的。例如，可以用合适的限制性酶，从DNA切下编码所述肽的序列。或者，可以采用化学合成技术，例如亚磷酰胺法，合成所述DNA分子。此外，可以使用这些技术的组合。
本发明也包括能够在合适的宿主中表达所述肽的载体。所述载体包含与合适的表达控制序列有效连接的编码所述肽的DNA分子。在将所述DNA分子插入所述载体之前或之后实施这种有效连接的方法是众所周知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵基因、核糖体结合部位、起始信号、终止信号、加帽信号、聚腺苷酸化信号和涉及转录或翻译控制的其它信号。
用具有所述DNA分子的所得载体转化合适的宿主。这种转化可以采用本领域众所周知的方法来进行。
许多可利用且熟知的宿主细胞中的任一种可以用来实施本发明。具体宿主的选择取决于本领域熟知的多种因素。这些因素包括例如与所选表达载体的匹配、所述DNA分子编码的肽的毒性、转化率、所述肽回收的容易程度、表达特性、生物安全性和成本。这些因素必须取得平衡，由于人们理解，不是所有的宿主都可以同样有效地表达特定DNA序列。在这些通用指南中，有用的微生物宿主包括细菌(例如大肠杆菌菌种)、酵母(例如酵母属菌种(Saccharomyces sp.)和其它真菌、昆虫、植物、培养中的哺乳动物(包括人类)细胞或本领域已知的其它宿主。
下一步，培养转化宿主，并且进行纯化。宿主细胞可以在常规发酵条件下培养，使得所需化合物得以表达。这类发酵条件是本领域众所周知的。最后，用本领域熟知的方法，从培养物中纯化所述肽。
所述化合物也可以通过合成法制备。例如，可以使用固相合成技术。合适的技术是本领域众所周知的，包括描述于以下文献中的技术Merrifield(1973)，Chem.Polypeptides，pp.335-61(Katsoyannis和Panayotis编著)；Merrifield(1963)，J.Am.Chem.Soc.852149；Davis等(1985)，Biochem.Intl.10394-414；Stewart和Young(1969)，Solid PhasePeptide Synthesis；美国专利第3,941,763号；Finn等(1976)，The Proteins(3rd ed.)2105-253；和Erickson等(1976)，The Proteins(3rd ed.)2257-527。固相合成是制备各种肽的优选技术，因为它是制备小肽的最经济成效的方法。
含有衍生肽或者含有非肽基团的化合物可以通过众所周知的有机化学技术来合成。
所述化合物的应用本发明化合物由于其与PTH-1受体或PTH-2受体相互作用而具有药理活性。Mannstadt等(1999)，Am.J.Physiol.277.5Pt 2.F665-75。PTH及其激动剂增加骨吸收、增加肾的钙重吸收、减少表皮增殖并且减少毛发生长。Holick等(1994)Proc.Natl.Sci.USA91(17)8014-6；Schilli等(1997)，J.Invest.Dermatol.108(6)928-32。因此，PTH-1受体和/或PTH-2受体的拮抗剂可用于治疗●原发性和继发性甲状旁腺机能亢进；●高钙血，包括由实体瘤(乳房、肺和肾)引起的高钙血和血液恶性肿瘤(多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病)；特发性高钙血以及与甲状腺机能亢进和肾功能障碍相关的高钙血；●肿瘤转移瘤，特别是转移至骨的转移瘤，尤其是与乳癌和前列腺癌相关的转移瘤；●恶病质和食欲缺乏，特别是与癌症相关的恶病质和食欲缺乏；●与异常PTH受体信号相关或因异常PTH受体行信号恶化的骨质稀少，包括各种形式的骨质疏松，例如-原发性骨质疏松；-绝经后和年龄相关性骨质疏松；-内分泌性骨质疏松(甲状腺机能亢进、甲状旁腺机能亢进、
库欣综合征(Cushing’s syndrome)和肢端肥大症)；-遗传性和先天性骨质疏松(例如成骨不全、高胱氨酸尿、门克士综合征(Menkes′syndrome)和赖利-戴综合征(Riley-Daysyndrome)；-由于肢端固定术引起的骨质疏松；-其它疾病继发的骨质疏松，其它疾病例如血色素沉着、血促乳素过多、神经性食欲缺乏、甲状腺毒症、糖尿病、腹腔疾病、炎性肠病、原发性胆汁性肝硬化、类风湿性关节炎、关节强硬性脊椎炎、多发性骨髓瘤、淋巴组织增生性疾病和系统性肥大细胞增生病；-手术(例如胃切除术)或药疗(例如化疗、抗惊厥疗法、免疫抑制疗法和抗凝剂疗法)继发的骨质疏松；-糖皮质类固醇疗法继发性骨质疏松，所述疗法用于诸如以下的疾病类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、一过性动脉炎、脉管炎、慢性阻塞性肺病、风湿性多肌痛、多肌炎、慢性间质性肺病；-在器官移植例如肾、肝、肺、心脏移植后防止器官排斥的糖皮质类固醇和/或免疫调节疗法继发的骨质疏松；-由于受到微重力(microgravity)作用引起的骨质疏松，例如在太空旅行期间观察到的；-与恶性疾病例如乳癌、前列腺癌相关的骨质疏松；●成人和青少年骨佩吉特病(Paget′s disease)(畸形性骨炎)●骨髓炎或导致骨丢失的骨中传染性病灶●由于给予类固醇诱发的以及小肠和大肠疾病和慢性肝病和肾病相关的术后骨质稀少。
●与外伤性损伤或与以下病症相关的非外伤性坏死相关的骨坏死或骨细胞死亡戈谢病(Gaucher′s disease)、镰状细胞性贫血、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、牙周病、溶骨性转移瘤和其它病症；●脱发(头发生长缺陷或者头发部分或完全丧失)，包括雄激素性脱发(男性型脱发(male pattern baldness))、中毒性脱发、老年脱发、斑形脱发、斑秃(alopecia pelada)和拔毛发癖等等。
有患者可以从PTH或PTHrP活性获益的其它病症。对于这些适应症，PTH受体激动剂可用作治疗性疗法。具体地说，这类适应症包括骨折修复(包括骨不连合性骨折的愈合)、骨质稀少包括各种形式的骨质疏松，例如-原发性骨质疏松；-绝经后和年龄相关性骨质疏松；-内分泌性骨质疏松(甲状腺机能亢进、库欣综合征(Cushing’s syndrome)和肢端肥大症)；-遗传性和先天性骨质疏松(例如成骨不全、高胱氨酸尿、门克士综合征(Menkes′syndrome)和赖利-戴综合征(Riley-Daysyndrome)；-由于肢端固定术引起的骨质疏松；-其它疾病继发的骨质疏松，其它疾病例如血色素沉着、血促乳素过多、神经性食欲缺乏、甲状腺毒症、糖尿病、腹腔疾病、炎性肠病、原发性胆汁性肝硬化、类风湿性关节炎、关节强硬性脊椎炎、多发性骨髓瘤、淋巴组织增生性疾病和系统性肥大细胞增生病；-手术(例如胃切除术)或药疗(例如化疗、抗惊厥疗法、免疫抑制疗法和抗凝剂疗法)继发的骨质疏松；-糖皮质类固醇疗法继发性骨质疏松，所述疗法用于诸如以下的疾病RA、SLE、哮喘、一过性动脉炎、脉管炎、慢性阻塞性肺病、风湿性多肌痛、多肌炎、慢性间质性肺病；-在器官移植例如肾、肝、肺、心脏移植后防止器官排斥的糖皮质类固醇和/或免疫调节疗法继发的骨质疏松；
-由于受到微重力作用引起的骨质疏松，例如在太空旅行期间观察到的；-与恶性疾病例如乳癌、前列腺癌相关的骨质疏松；半寿期延长的PTH激动剂(例如与Fc区连接的PTH激动剂)可以与骨吸收抑制剂一起使用。骨吸收抑制剂包括OPG和OPG衍生物、OPG-L(RANKL)抗体、降钙素(例如Miacalcin，Calcimar)、二膦酸(例如APD、阿仑膦酸、利塞膦酸、依替膦酸、帕米膦酸、替鲁膦酸、氯膦酸、奈立膦酸、ibandronate、zoledronate)、雌激素(例如Premarin，Estraderm、Prempro、Alora、Climara、Vivelle、Estratab、Ogen)、选择性雌激素受体调节剂(例如雷洛昔芬、屈洛昔芬、lasofoxifene)、替勃龙等等。示例性骨吸收抑制剂描述于WO98/46751和WO97/23614，所述文献通过引用全部结合到本文中。
本发明化合物作为治疗骨质疏松的单一疗法可能是合适的，有可能将抗吸收药加入PTH-Fc疗法中将增加其功效和治疗窗。PTH和PTH-Fc都引起骨生成和骨吸收两者的增加。抗吸收药阻断破骨细胞反应的能力可能限制PTH-Fc的高钙血效应，也可能增加骨量。
药用组合物一般介绍.本发明也提供使用本发明化合物的药用组合物的方法。这类药用组合物可以注射给予，或口服、经肺、鼻、经皮或其它给药形式给予。一般而言，本发明包括包含有效量本发明化合物与药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、辅料和/或载体的药用组合物。这类组合物包括各种缓冲剂含量(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)，pH和离子强度的稀释剂；添加剂，例如去垢剂和增溶剂(例如Tween 80、Polysorbate 80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)和填充物质(例如乳糖、甘露醇)；将所述物质加入到聚合化合物例如聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制剂中或者加入到脂质体中。透明质酸也可以使用，这可能具有增进在循环中持续作用时间的效应。这类组合物可能影响本发明蛋白质和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除率。参见例如Remington′sPharmaceutical Sciences，18th Ed.(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA18042)第1435-1712页，所述文献通过引用全部结合到本文中。所述组合物可以以液体形式制备，或者可以以干粉例如冻干形式制备。也考虑了植入型缓释制剂和经皮制剂。
在增加啮齿动物成骨细胞数目、骨体积和骨盐密度方面，每周两次给予本发明化合物，优于每日注射PTH(1-34)。在成年小鼠中，与每日给予PTH-(1-34)相比，每周两次给予PTH-(1-34)-Fc引起骨密度和骨体积的增加更大。(参见图10)。在骨质疏松的老年OVX大鼠模型中，每周两次给药能够逆转超过50％的由于一年缺乏雌激素诱发的骨丢失。当与二膦酸(APD)联合时，在老年大鼠模型中观测到的效应甚至更强。在大鼠中，一次皮下注射PTH-(1-34)-Fc(340nmol/kg)引起持续72小时的高血钙反应(图8)。这种持续时间与PTH-(1-34)-Fc从血清中的清除率一致，与大鼠中最佳的每周两次给药方案一致。
灵长类的最佳给药的频率可能低于大鼠或小鼠。根据OVX猕猴对一次皮下注射PTH-(1-34)-Fc(10-34nmol/kg)持续约168小时的高钙血反应的观测结果(图11)，每周一次(或更低的频率)给药在灵长类中可能是最佳的。这一观测结果提示，在灵长类中一次皮下注射PTH-(1-34)-Fc在约1周内被清除，这也可能代表合成代谢效应所需的最大给药频率。
口服剂型.此中考虑可供应用的是口服固体剂型，所述剂型在Remington′s Pharmaceutical Sciences((1990)，18th Ed.，Mack PublishingCo.Easton PA 18042)的第89章中有全面的描述，该文献通过引用全部结合到本文中。固体剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、糖锭或锭剂、扁囊剂或小糖丸。此外，脂质体或类蛋白包封也可以用来配制本发明的组合物(例如美国专利第4,925,673号中报道的类蛋白微球)。可以使用脂质体包封，脂质体可以用各种聚合物衍生化(例如美国专利第5,013,556号)。在Marshall，K.，Modern Pharmaceutics((1979)，G.S.Banker和C.T.Rhodes编著)的第10章中给出了关于所述治疗药可能的固体剂型的描述，该文献通过引用全部结合到本文中。一般而言，所述制剂将包括本发明的化合物和提供抵抗胃环境的保护以及在肠中释放所述生物活性物质的惰性成分。
也具体考虑了上述本发明化合物的口服剂型。如有必要，所述化合物可以经化学修饰，使得口服给药是有效的。一般而言，所考虑的化学修饰是将至少一个部分连接于所述化合物分子本身，其中所述部分使得可以(a)抑制蛋白水解；和(b)从胃或肠中被摄入到血流中。也需要提高所述化合物的总体稳定性和增加在机体中的循环时间。在本发明中可用作共价连接载体的部分也可以用于此目的。这类部分的实例包括PEG、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。参见例如Abuchowski和Davis，Soluble Polymer-Enzyme Adducts，Enzymes as Drugs(1981)，Hocenberg和Roberts编著，Wiley-Interscience，New York，NY，，pp.367-83；Newmark等(1982)，J.Appl.Biochem.4185-9。可以使用的其它聚合物是聚-1，3-二氧戊环和聚-1，3，6-tioxocane。如上所述，优选用于药物应用的是PEG部分。
对于口服给药剂型，使用经修饰的脂族氨基酸(例如N-(8-[2-羟基苯甲酰基]氨基)辛酸钠(SNAC))作为载体以增强本发明治疗化合物吸收也是可行的。应用SNAC的肝素制剂的临床功效已经在EmisphereTechnologies进行的II期试验中得到证实。参见美国专利第5,792,451号，“Oral drug delivery composition and methods”。
本发明的化合物可以作为粒径约1mm的颗粒或颗粒状物形式的细微多粒子包括在所述制剂中。用于胶囊给药的所述物质的制剂也可以为散剂、轻压的塞状物或甚至片剂。所述治疗药可以通过压制制备。
着色剂和矫味剂可以全都包括在内。例如，可以配制(例如通过脂质体或微球包封)所述蛋白(或衍生物)，然后进一步包含在食用制品例如冷藏的含着色剂和矫味剂的饮料中。
人们可以用惰性材料稀释本发明化合物或增加本发明化合物的体积。这些稀释剂可以包括糖类，尤其是甘露醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。某些无机盐也可以用作填充剂，包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。某些市售的稀释剂是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。
在将所述治疗药配制为固体剂型时可以包括崩解剂。用作崩解剂的材料包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商业崩解剂Explotab。淀粉羟基乙酸钠、Amberlite、羧甲基纤维素钠、超微支链淀粉、藻酸钠、明胶、橙皮、酸性羧甲基纤维素(acid carboxymethyl cellulose)、天然海绵和膨润土全都可以使用。另一种形式的崩解剂是不溶性阳离子交换树脂。粉状树胶可以用作崩解剂和粘合剂，这些可以包括粉状树胶，例如琼脂、梧桐胶或西黄蓍胶。藻酸及其钠盐也可用作崩解剂。
粘合剂可以用来将所述治疗药保持在一起，以形成硬片剂，包括得自天然产物的材料，例如阿拉伯胶、西黄蓍胶、淀粉和明胶。其它粘合剂包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)都可以用于醇溶液中，以将所述治疗药制粒。
抗摩擦剂可以包括在所述治疗药制剂中，以在配制过程中防止附着。润滑剂可以用作所治疗药和模壁之间的层，这些可以包括但不限于硬脂酸包括其镁盐和钙盐、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。可溶性润滑剂也可以使用，例如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、各种分子量的聚乙二醇Carbowax 4000和6000。
可以加入能够改进配制期间药物流动特性并且有助于压片期间重排的助流剂。所述助流剂可以包括淀粉、滑石粉、热解硅胶和水合硅铝酸盐。
为了有助于本发明化合物溶解于水性环境中，可以加入表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可以包括阴离子去垢剂，例如十二烷基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。可以使用阳离子去垢剂，阳离子去垢剂可以包括苯扎氯铵或苄索氯铵。可以作为表面活性剂包括在所述制剂中的潜在的非离子去垢剂一览表是lauromacrogol 400、硬脂酸-40-聚烃氧基酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、甘油一硬脂酸酯、聚山梨酸酯40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可以单独或作为不同比率的混合物存在于所述蛋白或衍生物的制剂中。
添加剂也可以包括所述制剂中，以增强所述化合物的吸收。潜在具有该特性的添加剂例如为脂肪酸油酸、亚油酸和亚麻酸。
可能需要控释制剂。本发明化合物可以掺入到允许通过扩散或浸提机制释放的惰性基质例如树胶中。缓慢变质的基质也可以重掺入到所述制剂中，例如藻酸盐、多糖。本发明化合物的另一种形式的控释是通过基于Oros治疗系统(Alza Corp.)的方法，即所述药物封在半透膜中，所述半透膜允许水进入，并且由于渗透效应而将药物推过单一小开孔。某些肠溶衣也具有延释效应。
其它包衣可以用于所述制剂。这些包括各种各样的可以应用于包衣锅的糖。所述治疗药也可以以薄膜衣片剂给出，用于这种情况的材料分为两组。第一组为非肠溶材料，包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚维酮和聚乙二醇。第二组包括通常为邻苯二甲酸酯的肠溶材料。
材料的混合物可以用来提供最佳薄膜衣的材料。薄膜包衣可以在包衣锅或在流化床中进行，或者通过压制包衣法来进行。
肺部给药形式.此中也考虑了本发明蛋白(或其衍生物)的肺部给药。当被吸入并且穿过肺上皮衬层进入血流时，所述蛋白(或衍生物)被传递至哺乳动物的肺部。(关于这一点的其它报道包括Adjei等，Pharma.Res.(1990)7565-9；Adjei等(1990)，Internatl.J.Pharmaceutics63135-44(醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate))；Braquet等(1989)，J.Cardiovasc.Pharmaco1.13(suppl.5)s.143-146(内皮缩血管肽-1)；Hubbard等(1989)，Annals Int.Med.3206-12(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等(1989)，J.Clin.Invest.841145-6(α1-蛋白酶)；Oswein等(March1990)，″Aerosolization of Proteins″，Proc.Symp.Resp.Drug Delivery II，Keystone，Colorado(重组人生长激素)；Debs等(1988)，J.Immunol.1403482-8(干扰素-γ和肿瘤坏死因子α)和Platz等，美国专利第5,284,656号(粒细胞集落刺激因子)。
考虑可供用于实施本发明的有各种各样设计用于治疗药制品肺部给药的机械装置，包括但不限于粉末雾化器、定量吸入器和粉末吸入器，所有这些都是本领域技术人员所熟悉的。适用于实施本发明的市售装置的某些具体实例有Ultravent粉末雾化器，由Mallinckrodt，Inc.制造，St.Louis，Missouri；Acorn II粉末雾化器，由Marquest MedicalProducts制造，Englewood，Colorado；Ventolin定量吸入器，由Glaxo Inc.制造，Research Triangle Park，North Carolina；和Spinhaler粉末吸入器，由Fisons Corp.制造，Bedford，Massachusetts。
所有这类装置都要求应用适合于分配本发明化合物的制剂。通常，每种制剂对于所用是装置类型的专用的，除可用于治疗的稀释剂、辅料和/或载体外，还可以包括应用合适的抛射剂材料。
为了最有效地传递至远端肺部，本发明化合物应该最有利地以颗粒剂形式制备，其平均粒径小于10μm(或微米)，最优选为0.5-5μm。
药学上可接受的载体包括糖类，例如海藻糖、甘露醇、木糖醇、蔗糖、乳糖和山梨醇。供制剂中应用的其它组分可以包括DPPC、DOPE、DSPC和DOPC。可以使用天然或合成表面活性剂。可以使用PEG(甚至除了其应用于将所述蛋白或类似物衍生化外)。可以使用葡聚糖，例如环葡聚糖(cyclodextran)。可以使用胆汁盐和其它相关增强剂。可以使用纤维素和纤维素衍生物。可以使用氨基酸，例如用于缓冲制剂中。
此外，考虑了应用脂质体、微囊或微球、包藏复合物或其它类型的载体。
适用于或者射流式或者超声式粉末雾化器的制剂通常将包含溶于水的本发明化合物，其浓度约为0.1-25mg生物活性蛋白/ml溶液。所述制剂也可以包括缓冲剂和单糖(例如为了蛋白稳定和调节渗透压)。粉雾剂也可以含有表面活性剂，以降低或防止由于在形成气雾剂时所述溶液雾化引起的表面诱发的所述蛋白的聚集供定量吸入装置应用的制剂一般将包含借助于表面活性剂而悬浮于抛射剂中的含本发明化合物的细微粉末。所述抛射剂可以是用于此目的的任何常规材料，例如氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷或其组合。合适的表面活性剂包括脱水山梨醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。
可供从粉末吸入装置中分配的制剂将包含含本发明化合物的细微粉末，也可以包括填充剂，例如乳糖、山梨醇、蔗糖、甘露醇、海藻糖或木糖醇，其含量为有助于所述粉末从所述装置中分配的量，例如所述制剂重量的50-90％。
经鼻给药形式.也考虑了经鼻给予本发明化合物。经鼻给药允许所述蛋白在所述治疗药制品给予鼻后直接进入血流，而无需所述制品沉积在肺中。用于经鼻给药的制剂包括具有葡聚糖或环葡聚糖的制剂。也考虑了通过穿越其它粘膜转运的给药。
剂量.涉及用于治疗上述病症的方法中的给药方案将由主治医师考虑各种可改变药物作用的因素来决定，所述因素例如为患者的年龄、病症、体重、性别和饮食、任何感染的严重程度、给药时间和其它临床因素。一般而言，每日给药方案的范围应该为0.1-1000微克本发明化合物/公斤体重，最好为0.1-150微克/公斤。
具体的优选实施方案本发明人已经测定了以下表4中所列优选肽的优选结构。符号“Λ”可以是本文所述的任何接头，或者可以简单地表示一个正常的肽键(即因此不存在接头)。为了清楚，串联重复和接头用破折号分开显示。
表4-优选实施方案
“F1”是本文先前定义的Fc区。除了表4中所列的优选实施方案外，本发明人进一步考虑了其中Fc二聚体的每条链与不同肽序列连接的异源二聚体；例如其中一条链可以描述为SEQ ID NO166、而另一条链可以描述为SEQ ID NO170或者与表1和表2中任何序列连接的Fc的分子。
所有本发明的化合物都可以用PCT申请WO99/25044中描述的方法制备。
本发明将通过以下工作实施例进一步描述，所述实施例是说明性的，而不是限制性的。
实施例1Fc-缀合PTH/PTHrP受体(PTH-R1)激动剂[PTH-(1-34)-Fc]的生物活性引言甲状旁腺激素[PTH-(1-34)或天然PTH-(1-84)]当每日注射时，引起骨生成增加和骨量增加。这种合成代谢反应先前被认为需要短暂暴露于PTH，这由半寿期短(不足1小时)的PTH来促进。临床上，PTH疗法的合成作用需要每日皮下注射，这对于广泛应用PTH是一个相当大的障碍。PTH较低频率的注射在临床上会是理想的，可能通过增加PTH的体内半寿期而达到。短期(间断)暴露于PTH(＜1h/天)刺激成骨细胞骨生成，而长期(连续)暴露(＞2h/天)刺激破骨细胞骨吸收(Dobnig等，Endocrinology1384607，1998)。现有技术提示，其自身半寿期延长的PTH可能增加骨吸收，并且导致血钙过高。然而，应该有可能用骨吸收抑制剂来防止PTH诱导的破骨细胞活性。Osteoprotegerin(OPG)可以很好地适合于此目的。用OPG-Fc单一治疗大鼠、小鼠或人类，通过基本上根除破骨细胞群体，引起持续抑制骨吸收。共同给予有效的骨吸收抑制剂如OPG可能提供更大的效应。这种方案在理论上可能允许PTH无对立面地刺激骨生成，导致骨量增加。有可能其它骨吸收抑制剂包括二膦酸或雌激素也可能抑制PTH诱导的骨吸收，因此可以与长效PTH分子联合使用。为了这一目标，我们克隆、表达和纯化了人PTH-(1-34)-Fc。Fc与蛋白缀合引起其循环半寿期显著增加，这可能允许按照与OPG-Fc相似或相同的方案注射PTH-(1-34)-Fc。本发明的益处包括PTH注射频率较低，从目前标准的每日一次至不常进行如每季度一次。
材料、方法和结果高钙血测定我们在鼠类高钙血模型中测试了PTH-(1-34)-Fc的效力和作用持续时间。简而言之，给小鼠皮下注射一次不同剂量的PTH-(1-34)或PTH-(1-34)-Fc，从眶后静脉窦收集外周血，以供测定血离子化钙。通过小鼠对前一种药物的持续高钙血反应证实，PTH-(1-34)-Fc的半寿期和效力大于PTH-(1-34)的半寿期和效力(图4)。PTH-(1-34)诱导的高钙血持续6-24h，而等摩尔剂量的PTH-(1-34)-Fc引起更为持续的高钙血(48-72h)。这种反应时间长度与PTH-(1-34)-Fc构建体相对于PTH-(1-34)而言半寿期更长是一致的。PTH-(1-34)-Fc的效力也显著高于PTH-(1-34)(图4)。与等摩尔剂量的PTH-(1-34)相比，最高剂量PTH-(1-34)-Fc引起的峰离子化钙水平的增加更大。曲线下面积的分析(AUC)证明，在所用的最高剂量下，PTH-(1-34)-Fc引起的高钙血反应比等摩尔剂量的PTH-(1-34)高2.6倍。
合成代谢分析已经证明了PTH-(1-34)-Fc的药理学和半寿期优于PTH-(1-34)，我们进行了一项先导研究，以确定PTH-(1-34)-Fc与OPG-Fc的共同治疗是否增加骨量。简而言之，将6月龄的雄性Sprague Dawley(SD)大鼠分为多个组，每组6只。通过双能量X射线吸收测定法(DEXA)，在所有大鼠的第三腰椎(L3)测量基线骨盐密度(BMD)(第0天)。然后大鼠按照以下方案进行治疗。
组1溶媒对照(PBS，皮下注射，第1、3和5天)组2OPG-Fc，在第1天一次皮下注射(1mg/kg)组3PTH-(1-34)，在第1、3和5天皮下注射，20nMoles PTH/kg/注射。这代表最佳合成代谢PTH方案。
组4与组3相同，但在第1天注射一次OPG-Fc。
组5在第1天，皮下注射一次PTH-(1-34)-Fc，60nMoles/kg。这代表与组3接受的PTH-(1-34)的总剂量相同的摩尔剂量，但在一次注射中给予。
组6与组5相同，但在第1天注射一次OPG-Fc(SC，1mg/kg)。
在第7天再次进行腰椎的DEXA，以评价BMD的变化。与PBS治疗的大鼠相比，注射一次OPG-Fc或注射3次PTH-(1-34)，L3中的BMD中等增加(图5)。PTH-(1-34)+OPG引起的BMD增加大于单独的OPG或PTH-(1-34)。作为单一疗法，注射一次PTH-(1-34)-Fc不能增加BMD。然而，注射一次PTH-(1-34)-Fc加上注射一次OPG-Fc引起BMD显著增加(图5)。这一结果提供了下述原理的证明循环半寿期延长的PTH构建体可以与有效的抗吸收药如OPG-Fc联合，引起骨骼合成代谢反应。与通过多次注射PTH-(1-34)与OPG-Fc的共同治疗或无OPG-Fc共同治疗诱导的合成作用相比，用PTH-(1-34)-Fc加上OPG-Fc一次治疗的合成作用更大。总而言之，BMD的最大增加可以通过较少频率地注射PTH-(1-34)-Fc+OPG-Fc来达到，与必须每日注射或每隔一天注射的PTH-(1-34)相比，这是优越的治疗方案。
图5显示了PTH-Fc+OPG-Fc对第三腰椎中(L3)骨盐密度(BMD)的影响。正常的6月龄雄性大鼠用PTH-Fc或PTH或者溶媒一次皮下注射来治疗。某些大鼠也接受一次OPG皮下注射。DEXA后7天，测量BMD。数据代表平均值±SD，n＝6只大鼠/组。
实施例2Fc-缀合PTH/PTHrP受体(PTH-R1)拮抗剂([Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc)的生物活性引言一些病状与PTH或PTHrP循环水平增高有关。原发性和继发性甲状旁腺机能亢进(分别为PHPT和SHPT)与PTH水平增高有关，而恶性肿瘤的体液高钙(HHM)导致PTHrP水平增高。这两种蛋白都通过共同PTH/PTHrP受体(PTH-R1)发送信号，引起骨吸收、肾钙重吸收和维生素D的肾生物合成增加。虽然骨吸收抑制剂已经在抑制这些病状中破骨细胞骨吸收方面取得了不同程度的成功，但目前没有一种疗法可减轻PTH或PTHrP过量对钙血症的肠和肾影响。因此，与吸收抑制剂相比，直接拮抗PTH或PTHrP信号的药物有可能具有更大的功效。
已研究的大多数PTH-R1信号拮抗剂基于氨基末端截短。PTH-(7-34)肽是相当有效的具有非常温和激动剂活性的PTH-R1拮抗剂。与PTH-(7-34)相比，PTHrP-(7-34)肽对于PTH-R1的亲和性更高，由此是更有效的拮抗剂。然而，与PTH-(7-34)相比，PTHrP-(7-34)也具有更高(但仍是温和的)激动剂活性(McKee(1990)，Endocrinol.12776)。所述最佳拮抗剂可以将PTH-(7-34)的较弱激动作用与PTHrP-(7-34)的较强的拮抗作用组合在一起。Nutt等(1990)，Endocrinol.127491证明，将PTH的Asn10和Leu11置换成PTHrP序列(取代Asp10和Lys11)，产生最终没有激动剂活性、但仍具有非常有效拮抗剂活性的肽([Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc)。
同天然PTH一样，所有基于肽的PTH-R1拮抗剂共享循环半寿期非常短(＜1h)的特性。此外，除去受体激动作用所需的氨基末端截短也显著降低这些肽对PTH-R1的亲和性。这些特性限制了常规肽拮抗剂的临床潜能。Fc-与氨基末端截短的PTH肽或PTHrP肽缀合，应该显著增加其循环半寿期，使得PTH-R1的连续拮抗作用可以通过足够地暴露于这些Fc-拮抗剂来达到。
材料、方法和结果我们已经克隆、表达和纯化了[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc。我们测试了该化合物在小鼠中拮抗急性和慢性高钙血反应的能力。用PTHrP-(1-34)作为血钙因子，以评价[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc的急性效应。因为PTHrP是HHM的主要介质，所以这项研究也代表诱导高钙血的肿瘤模型。简而言之，测量基线的血液离子化钙(BIC)，然后小鼠通过皮下注射用溶媒(PBS)或PTHrP-(1-34)(0.5mg/kg)攻击。然后小鼠用不同剂量的[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc或溶媒(PBS)皮下治疗一次。在溶媒治疗、用PTHrP-(1-34)攻击的小鼠中，观测到一过性高钙血反应。峰钙血反应发生在攻击后3小时，并且持续至攻击后至少6小时。与溶媒治疗相比，10mg/kg[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc引起PTHrP-诱导的高钙血更快地正常化。30mg/kg的剂量完全阻断了对PTHrP-(1-34)的钙血反应(图6)。
为了测试[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc拮抗更为慢性的高钙血的能力，我们用PTH-(1-34)-Fc作为长效血钙因子。这项研究也代表特征为PTH水平持续升高的原发性和继发性甲状旁腺机能亢进模型。在溶媒治疗的小鼠中，一次皮下注射PTH-(1-34)-Fc(30mg/kg)在正常小鼠中引起强高钙血反应，在攻击后24小时达到2.75mg/dl的水平(相比之下，正常对照数值为1.35)。一次皮下注射10-100mg/kg[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc引起在24小时时对PTH-(1-34)-Fc的峰高钙血反应显著降低(图6)。
总而言之，我们在急性和慢性高钙血动物模型中证实了[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc的拮抗活性。这些模型使用基于PTH和PTHrP两种序列的血钙因子。这些数据提示，[Asn10，Leu11]PTHrP-(7-34)-Fc以及其它Fc-缀合PTH-R1拮抗剂对于甲状旁腺机能亢进HHM和与异常PTH-R1信号相关的其它疾病而言，可能是有效的治疗选择。
实施例3FC-缀合的和天然的C末端截短PTH片段的成骨特性A.cAMP测定我们用大鼠成骨细胞样ROS 17/2.8细胞测试了PTH-Fc构建体刺激cAMP积累的相对能力。培养物用磷酸二酯酶抑制剂IBMX处理，以促进cAMP的积累。然后培养物用或者溶媒(PBS)或者各种PTH构建体攻击15分钟。证实所有片段都有剂量依赖性cAMP积累。无Fc缀合的PTH-(1-34)的效力略微高于PTH-(1-31)-Fc和PTH-(1-30)-Fc(图7)。这些数据证明，Fc-缀合PTH片段保持在成骨细胞中激活AC途径的能力。B.小鼠生物测定然后，我们在小鼠中测试了PTH-(1-34)、PTH-(1-34)-Fc、PTH-(1-31)-Fc和PTH-(1-30)-Fc的效应。在第0、5和10天，给4周龄雄性小鼠通过皮下注射，注射溶媒或PTH片段。在24小时、48小时和72小时时，取外周血以供进行临床化学研究。第15天处死小鼠，收获椎骨、胫骨和股骨以供组织学研究，收集一个胫骨以供骨密度测量(外周定量计算机体层摄影，pQCT)。临床化学终点包括总血清钙、血清碱磷酸酶(AP，一种成骨细胞活性标记)和血清酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRAP，一种破骨细胞活性的标记)。对于每只动物，计算AP∶TRAP比值，作为与破骨细胞活性相比的相对成骨细胞活性的指标。较高的AP∶TRAP比值将表示可能更强的合成代谢因子。相对高剂量(高于最适合成代谢剂量15倍)的选择基于先前的研究，所述研究证实了在临床化学终点的显著变化。预期可能需要较低剂量，以证明对骨密度的合成作用，并且也可能需要抗吸收共同治疗以达到合成代谢反应。
临床化学研究的结果示于图8中。血清钙在注射300nmoles/kg(1.2mg/kg)的PTH-(1-34)后24、48或72小时没有显著差异。这一结果与无Fc缀合的肽的半寿期短是一致的，无Fc缀合的肽通常引起血清钙的一过性(12h)增加。相反，等摩尔剂量的PTH-(1-34)-Fc引起血清钙的显著且持续的增加，在24小时达到峰值。PTH-(1-31)-Fc是更为有效的血钙因子，虽然PTH-(1-30)-Fc的血钙是3种Fc肽中最低的(图8A)。血清AP(成骨细胞标记)未因给予PTH-(1-34)而改变，但通过在72小时给予300nmoles/kg的PTH(1-34)-Fc以及给予PTH-(1-31)-Fc而显著升高。PTH-(1-30)-Fc表现出AP的最高增加，在注射1,000nmoles/kg后72小时达到峰值(图8B)。血清TRAP(破骨细胞标记)未因PTH-(1-34)、PTH-(1-34)-Fc或PTH-(1-30)-Fc而显著改变，但给予PTH-(1-31)-Fc使其显著增加(图8C)。计算的AP∶TRAP比值未因PTH-(1-34)而改变，但通过给予PTH-(1-34)-Fc在规定的时间内增加。低剂量的PTH-(1-31)-Fc(100nmoles/kg)提高AP∶TRAP，而高剂量(1,000nmoles/kg)降低AP∶TRAP。AP∶TRAP的最大提高用PTH-(1-30)-Fc(1,000nmoles/kg)实现(图8D)。
各种PTH构建体对骨盐密度(近端胫骨干骺端)的效应示于图9中。在15天的研究结束时，观测到PTH-(1-34)(300nmoles/kg)当在第0、5和10天注射时具有中等的(非显著的)合成作用。PTH-(1-34)-Fc(300nmoles/kg)对骨密度没有影响，100nmoles/kg的PTH-(1-31)-Fc也没有影响。较高剂量的PTH-(1-31)-Fc(300-1,000nmoles/kg)引起显著的高钙血相关毒性，从这些动物中未收集骨以供进行pQCT。PTH-(1-30)-Fc引起骨密度的最大增加。有明显的反向剂量反应，其中100nmoles/kgPTH-(1-30)-Fc的效应最大，而在1,000nmoles/kg下的效应最小，尽管在所有剂量下BMD都高于对照(图9)。这些反向的剂量反应与下述的想法一致所用剂量(根据临床化终点选择的)高于最适合成代谢剂量5-50倍。不能显著增加血清钙的低剂量的PTH(或PTH-Fc)对于合成作用是最适的。参见Hock，J.M.(1992)，J.Bone Min.Res.765-72。在目前的研究中，合成作用最大的治疗方案(PTH-(1-30)-Fc，100nmoles/kg)也是不能显著增加血清钙的唯一PTH-Fc疗法(图8A)。
这些数据证明了C末端截短的PTH-Fc肽的潜在的合成作用。通过Fc缀合赋予的半寿期较长结合通过C末端截短对AC/cAMP选择性刺激，可能解释在缺乏有效骨吸收抑制剂时的合成作用。预期逐步C末端截短PTH-(1-30)-Fc将揭示保留或超过PTH-(1-30)-Fc合成分布型的更短的片段。这些片段可能在更为选择性地刺激成骨细胞，可能血钙作用更低，因此为合成代谢疗法提供更宽的治疗窗。
实施例4作为单一疗法的PTH-Fc疗法在成年小鼠中证明PTH-(1-34)-Fc作为单一疗法的功效。简而言之，雄性BDF1小鼠(4月龄)通过皮下注射各种剂量的PTH-(1-34)-Fc或溶媒(PBS)每周治疗两次。其它小鼠通过皮下注射80μg/kg/天(20nmol/kg/天)剂量的PTH-(1-34)每日进行治疗，这对于增加啮齿动物骨量而言是最佳治疗方案(M.Gunness-Hey和J.M.Hock，Metab.Bone Dis.& Rel.Res.5；177-181，1984)。3周后，处死小鼠，通过pQCT分析胫骨的骨盐密度(BMD)(图10)。
与溶媒治疗的对照相比，通过每日注射PTH-(1-34)，总胫骨BMD和骨松质(cancelled)BMD都显著增加(图1，双因素ANOVA，p＜0.05)。每周两次注射PTH-(1-34)-Fc引起总BMD和骨松质BMD两者均剂量依赖性增加，这种增加在两个最高剂量(50和150nmol/kg)下显著大于溶媒或者每日注射PTH-(1-34)的效应。每日PTH-(1-34)治疗，并未使胫骨的骨密质BMD显著增加。每周两次PTH-(1-34)-Fc引起骨密质BMD的剂量依赖性增加，这种增加在最高剂量下显著大于在用溶媒或每日PTH-(1-34)治疗的小鼠中观测到的增加(p＜0.05)。
作为单一疗法每周两次PTH-(1-34)-Fc在老年卵巢切除(OVX)大鼠中也有效地增加BMD。Sprague Dawley大鼠在3月龄时经卵巢切除术，使得骨丢失达11个月。其它大鼠进行假手术，每周两次用溶媒(PBS)治疗。OVX大鼠每周两次通过皮下注射或者溶媒或者二膦酸APD(帕米膦酸，0.5mg/kg)或PTH-(1-34)-Fc(50nmol/kg)或APD+PTH-(1-34)-Fc治疗。每周通过双能量X射线吸收测量法(DEXA)测量BMD。大鼠在治疗4周后处死。在治疗开始时，与溶媒治疗的OVX大鼠相比，OVX大鼠的所分析的所有骨骼部位的BMD都显著降低(图11，p＜0.05，双因素ANOVA)。与溶媒治疗的OVX大鼠相比，单独的APD没有显著增加任何骨骼部位的BMD。单独的PTH-(1-34)-Fc在治疗4周后引起股骨干骺端BMD显著增加(p＜0.05)，用PTH+ABD治疗OVX大鼠与该部位BMD较早的显著增加(3周)有关。APD+PTH-(1-34)-Fc的组合也引起腰椎和股骨干骺端的显著的BMD增加(p＜0.05)。单独的PTH-(1-34)-Fc引起温和且短暂的高钙血反应，无论是否继续治疗，这种反应在第10天后都自发消除。共同给予APD完全阻断了PTH-(1-34)-Fc的血钙效应。
这些数据提示，PTH-(1-34)-Fc当在成年小鼠和老年OVX大鼠中用作单一疗法时，是一种有效的合成代谢药。我们也证明了，在PTH-(1-34)-Fc疗法中加入抗吸收药(APD)与老年OVX大鼠中BMD相似的或更快的增加相关。共同给予APD也阻断由PTH-(1-34)-Fc产生的一过性高钙血反应，这提示PTH-(1-34)-Fc的治疗指数可以通过共同给予有效的抗吸收药显著提高。
***现在已经全面描述了本发明，对于本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本文所述的本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明作出许多变化和修改。
缩写AC 腺苷酸环化酶AP 碱性磷酸酶BMD 骨盐密度cAMP环腺苷酸DEXA双能量X射线吸收测量法HHM 恶性肿瘤的体液高钙OPG osteoprotegerinOVX 卵巢切除的PBS 磷酸缓冲盐溶液pQCT外周定量计算机体层摄影PTH 甲状旁腺激素PTHrP 甲状旁腺激素相关蛋白TRAP酒石酸抗性酸性磷酸酶序列表<110>安姆根有限公司(AMGEN INC.)<120>甲状旁腺激素和甲状旁腺激素相关蛋白的受体的调节物<130>A-665B<140>PCT/US 01/13528<141>2001-04-27<150>US 09/843,221<151>2001-04-26<150>US 60/266,673<151>2001-02-06<150>US 60/214,860<151>2000-06-28<150>US 60/200,053<151>2000-04-27<160>170<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>684<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(684)<223><400>1atg gac aaa act cac aca tgt cca cct tgt cca gct ccg gaa ctc ctg48Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu1 5 10 15ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc96Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu20 25 30atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc144Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser35 40 45cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag192His Glu Asp Pro Glu 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20 25<210>107<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>107Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg Arg Ala1 5 10 15Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu His Thr Ala20 25<210>108<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>108Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Arg Lys Leu His20 25 30Thr Ala<210>109<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>109Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 25 30Thr Ser<210>110<211>37<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>110Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 25 30Thr Ala Gly Arg Arg35<210>111<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>111Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu Lys20 25 30Glu Leu<210>112<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>112Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 25 30Thr Ala<210>113<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>113Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 25 30Thr Ala<210>114<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>114Ala Val Ser Glu Ala Gln Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 25 30Ala Leu<210>115<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>115Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His20 25 30Thr Ala<210>116<211>33<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>116Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His Thr20 25 30Ala<210>117<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>117Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lys Arg Leu His20 25 30Thr Ala<210>118<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>118Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lys Arg Leu His20 25 30Thr Ala<210>119<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>119Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu His20 25 30Thr Ala<210>120<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>120Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu His20 25 30Thr Ala<210>121<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>121Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu His20 25 30Thr Ala<210>122<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>122Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 25 30Asn Tyr<210>123<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>123Ala Val Ser Glu Ile Gln Phe Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Ser1 5 10 15Ser Met Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 25 30Asn Tyr<210>124<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTH<400>124Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys
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2025 30<210>128<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTH<400>128Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu His20 25 30Asn Phe<210>129<211>24<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTH<400>129Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu1 5 10 15Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20<210>130<211>24<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTH<400>130Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu1 5 10 15Leu Leu Glu Lys Leu Leu Lys Lys20<210>131<211>24<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTH<400>131Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Ala1 5 10 15Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala20<210>132<211>24<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTH<400>132Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Ser1 5 10 15Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser20<210>133<211>24<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTH<400>133Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Ala1 5 10 15Phe 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Lys Leu Leu Arg Lys20 25 30<210>145<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>145Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30<210>146<211>33<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>146Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His20 25 30Thr<210>147<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>147Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30<210>148<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>148Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30<210>149<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>149Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30<210>150<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>150Ala Val Ser Glu Ala Gln Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys20 25 30<210>151<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>151Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg20 25 30<210>152<211>29<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>152Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg20 25<210>153<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>153Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lys Arg20 25 30<210>154<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>经修饰的人PTHrP<400>154Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gln1 5 10 15Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lys Arg20 25 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Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe<210>164<211>34<212>PRT<213>人工序列<220><223>优选实施方案-PTH<220><221>misc_feature<222>(34)..(34)<223>任选的接头和在C末端连接的Fc区<400>164Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Arg Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe<210>165<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>优选实施方案-PTH<220><221>misc_feature<222>(31)..(31)<223>任选的接头和在C末端连接的Fc区<400>165Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val20 25 30<210>166<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>优选实施方案-PTH<220><221>misc_feature<222>(30)..(30)<223>任选的接头和在C末端连接的Fc区<400>166Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp20 25 30<210>167<211>29<212>PRT<213>人工序列<220><223>优选实施方案-PTH<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>通过任选的接头于N末端连接的Fc区<400>167Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln20 25<210>168<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>优选实施方案-PTH<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>通过任选的接头于N末端连接的Fc区<400>168Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu20 25<210>169<211>28<212>PRT<213>人工序列<220><223>优选实施方案-PTHrP<220><221>misc_feature<222>(28)..(28)<223>任选的接头和在C末端连接的Fc区<400>169Leu Leu His Asn Leu Gly Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe1 5 10 15Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala20 25<210>170<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>优选实施方案-TIP39<220><221>misc_feature<222>(39)..(39)<223>任选的接头和在C末端连接的Fc区<400>170Ser Leu Ala Leu Ala Asp Asp Ala Ala Phe Arg Glu Arg Ala Arg Leu1 5 10 15Leu Ala Ala Leu Glu Arg Arg His Trp Leu Asn Ser Tyr Met His Lys20 25 30Leu Leu Val Leu Asp Ala Pro3权利要求
1.下式的组合物P1-(L1)a-F1及其多聚体，其中F1是载体并且连接于P1-(L1)a的C末端；P1是PTH/PTHrP调节结构域；L1是接头；且a是0或1。
2.权利要求1的式P1-F1的组合物。
3.权利要求1的组合物，其中F1为一个Fc区。
4.权利要求1的组合物，其中F1为一个IgG Fc区。
5.权利要求1的组合物，其中F1为一个IgG1 Fc区。
6.权利要求1的组合物，其中F1包含SEQ ID NO2的序列。
7.权利要求1的组合物，其中所述PTH/PTHrP调节结构域具有分子式XNHX10X11X12KX14X15X16X17X18X19RX21X22X23X24X25X26X27X28XC(SEQ ID NO3)其中XN不存在或为X3X4X5X6X7、X2X3X4X5X6X7、X1X2X3X4X5X6X7或YX1X2X3X4X5X6X7；X1-X7、X10、X11、X12、X14-X28分别独立地为氨基酸残基；XC不存在或为X29、X29X30、X29X30X31、X29X30X31X32、X29X30X31X32X33、X29X30X31X32X33X34、X29X30X31X32X33X34X35或X29X30X31X32X33X34X35X36；X29-X36分别独立地为氨基酸残基。
8.权利要求7的组合物，其中XN为X1X2X3X4X5X6X7；X1为一个亲水性或非官能性残基；X2为V；X3为S；X4为E；X5为一个非官能性或碱性残基；X6为Q；X7为L；X10为一个酸性或亲水性残基；X11为一个非官能性或碱性残基；X12为一个非官能性残基；X14为一个碱性或亲水性残基；X15为一个非官能性残基；X16为一个非官能性或亲水性残基；X17为一个酸性、亲水性或非官能性残基；X18为一个非官能性残基；X19为一个酸性或碱性残基；X21为一个非官能性或碱性残基；X22为一个亲水性、酸性或芳族残基；X23为一个芳族或亲脂性残基(优选L)；X24为一个亲脂性残基；X25为一个亲水性或碱性残基；X26为一个亲水性或碱性残基；X27为一个亲脂性、碱性或非官能性残基；且X28为一个亲脂性或非官能性残基。
9.权利要求8的组合物，其中XC为X29X30X31X32X33X34；X29为一个亲水性或非官能性残基；X30为一个亲水性或酸性残基；X31为一个亲脂性或非官能性残基；X32为H；X33为一个亲水性残基；且X34为一个非官能性或芳族残基。
10.权利要求8的组合物，其中XC为X29X30X31；X29为一个亲水性或非官能性残基；X30为一个亲水性或酸性残基；且X31为一个亲脂性或非官能性残基。
11.权利要求8的组合物，其中XC为X29X30；X29为一个亲水性或非官能性残基；且X30为一个亲水性或酸性残基。
12.权利要求8的组合物，其中Xc为X29；且X29为一个亲水性或非官能性残基。
13.权利要求8的组合物，其中XC不存在。
14.权利要求8的组合物，其中X1为A、S或Y；X5为H或I；X10为N或D；X11为L、R或K；X12为G、F或W；X14为H或S；X15为L或I；X16为Q、N、S或A；X17为S、D或L；X18为M、L、V或Nle；X19为E或R；X21为V、M、R或Nle；X22为E或F；X23为W或F；X25为R或H；X26为K或H；X27为K或L；且X28为L或I。
15.权利要求14的组合物，其中XC为X29X30X31X32X33X34；X29为Q或A；X30为D或E；X31为V或I；X33为N或T；且X34为A、F或Y。
16.权利要求14的组合物，其中XC为X29X30X31；X29为Q或A；X30为D或E；且X31为V或I。
17.权利要求14的组合物，其中XC为X29X30；X29为Q或A；且X30为D或E。
18.权利要求14的组合物，其中XC为X29；且X29为Q或A。
19.权利要求14的组合物，其中XC不存在。
20.权利要求1的组合物，其中所述PTH/PTHrP调节结构域具有下式JNJ7J8HNJ11J12KHLJ16SJ18J19RJ21EWLRKKLJC(SEQ ID NO4)其中JN不存在或选自J1J2J3J4J5J6、J2J3J4J5J6、J3J4J5J6；J1为一个氨基酸残基；J2为一个氨基酸残基；J3为一个氨基酸残基；J4为一个氨基酸残基；J5为一个氨基酸残基；J6为一个氨基酸残基；J7为一个氨基酸残基；J8为一个氨基酸残基；J11为一个非官能性或碱性残基；J12为一个氨基酸残基；J16为一个氨基酸残基；J18为一个氨基酸残基；J19为一个酸性或碱性残基；J21为一个氨基酸残基；JC不存在或为J29、J29J30、J29J30J31、J29J30J31J32、J29J30J31J32J33或J29J30J31J32J33J34；且J29为一个氨基酸残基；J30为一个氨基酸残基；J31为一个氨基酸残基；J32为一个氨基酸残基；J33为一个氨基酸残基；J34为一个氨基酸残基。
21.权利要求20的组合物，其中JN为J1J2J3J4J5J6；J1为一个非官能性或芳族残基；J2为一个非官能性残基；J3为一个亲水性残基；J4为一个酸性残基；J5为一个非官能性残基；J6为一个碱性残基；J7为一个非官能性或芳族残基；J8为一个非官能性残基；J11为一个碱性或非官能性残基；J12为一个非官能性或芳族残基；J16为一个非官能性或亲水性残基；J18为一个非官能性残基；J19为一个酸性或碱性残基；而J21为一个非官能性残基；JC为J29J30J31J32J33J34；J29为一个亲水性或非官能性残基；J30为一个亲水性或酸性残基；J31为一个亲脂性或非官能性残基；J32为一个碱性残基；J33为一个酸性残基；且J34为一个芳族残基。
22.权利要求21的组合物，其中J1为A、S或Y；J2为V；J3为S；J4为E；J5为I；J6为Q；J7为L或F；J8为M或Nle；J11为L、R或K；J12为G或W；J16为N、S或A；J18为M、Nle、L或V；J19为E或R；J21为V、M或Nle；J29为Q或A；J30为D或E；J31为V或I；J32为H；J33为N；且J34为F或Y。
23.权利要求20的组合物，其中JN为J1J2J3J4J5J6；J1为一个非官能性或芳族残基；J2为一个非官能性残基；J3为一个亲水性残基；J4为一个酸性残基；J5为一个非官能性残基；J6为一个碱性残基；J7为一个非官能性或芳族残基；J8为一个非官能性残基；J1为一个碱性或非官能性残基；J12为一个非官能性或芳族残基；J16为一个非官能性或亲水性残基；J18为一个非官能性残基；J19为一个酸性或碱性残基；J21为一个非官能性残基；JC为J29J30J31；J29为一个亲水性或非官能性残基；J30为一个亲水性或酸性残基；且J31为一个亲脂性或非官能性残基。
24.权利要求23的组合物，其中J1为A、S或Y；J2为V；J3为S；J4为E；J5为I；J6为Q；J7为L或F；J8为M或Nle；J11为L、R或K；J12为G或W；J16为N、S或A；J18为M、Nle、L或V；J19为E或R；J21为V、M或Nle；J29为Q或A；J30为D或E；且J31为V或I。
25.权利要求20的组合物，其中JN为J1J2J3J4J5J6；J1为一个非官能性或芳族残基；J2为一个非官能性残基；J3为一个亲水性残基；J4为一个酸性残基；J5为一个非官能性残基；J6为一个碱性残基；J7为一个非官能性或芳族残基；J8为一个非官能性残基；J11为一个碱性或非官能性残基；J12为一个非官能性或芳族残基；J16为一个非官能性或亲水性残基；J18为一个非官能性残基；J19为一个酸性或碱性残基；J21为一个非官能性残基；JC为J29J30；J29为一个亲水性或非官能性残基；且J30为一个亲水性或酸性残基。
26.权利要求25的组合物，其中J1为A、S或Y；J2为V；J3为S；J4为E；J5为I；J6为Q；J7为L或F；J8为M或Nle；J11为L、R或K；J12为G或W；J16为N、S或A；J18为M、Nle、L或V；J19为E或R；J21为V、M或Nle；J29为Q或A；且J30为D或E。
27.权利要求20的组合物，其中JN为J1J2J3J4J5J6；J1为一个非官能性或芳族残基；J2为一个非官能性残基；J3为一个亲水性残基；J4为一个酸性残基；J5为一个非官能性残基；J6为一个碱性残基；J7为一个非官能性或芳族残基；J8为一个非官能性残基；J11为一个碱性或非官能性残基；J12为一个非官能性或芳族残基；J16为一个非官能性或亲水性残基；J18为一个非官能性残基；J19为一个酸性或碱性残基；J21为一个非官能性残基；JC为J29；且J29为一个亲水性或非官能性残基。
28.权利要求27的组合物，其中J1为A、S或Y；J2为V；J3为S；J4为E；J5为I；J6为Q；J7为L或F；J8为M或Nle；J11为L、R或K；J12为G或W；J16为N、S或A；J18为M、Nle、L或V；J19为E或R；J21为V、M或Nle；且J29为Q或A。
29.权利要求20的组合物，其中JN为J1J2J3J4J5J6；J1为一个非官能性或芳族残基；J2为一个非官能性残基；J3为一个亲水性残基；J4为一个酸性残基；J5为一个非官能性残基；J6为一个碱性残基；J7为一个非官能性或芳族残基；J8为一个非官能性残基；J11为一个碱性或非官能性残基；J12为一个非官能性或芳族残基；J16为一个非官能性或亲水性残基；J18为一个非官能性残基；J19为一个酸性或碱性残基；J21为一个非官能性残基；且JC不存在。
30.权利要求29的组合物，其中J1为A、S或Y；J2为V；J3为S；J4为E；J5为I；J6为Q；J7为L或F；J8为M或Nle；J11为L、R或K；J12为G或W；J16为N、S或A；J18为M、Nle、L或V；J19为E或R；且J21为V、M或Nle。
31.权利要求20的组合物，其中所述PTH/PTHrP调节结构域选自表1。
32.权利要求1的组合物，其中所述PTH/PTHrP调节结构域具有下式ONLHO10O11O12KSIO16O17LRRRFO23LHHLIOC(SEQ ID NO5)其中ON不存在或为 YO1O2O3O4O5O6O7、O1O2O3O4O5O6O7、O2O3O4O5O6O7、O3O4O5O6O7、O4O5O6O7、O5O6O7、O6O7或O7；O1为一个氨基酸残基；O2为一个氨基酸残基；O3为一个氨基酸残基；O4为一个氨基酸残基；O5为一个氨基酸残基；O6为一个氨基酸残基；O7为一个氨基酸残基；O10为一个氨基酸残基；O11为一个氨基酸残基；O12为一个氨基酸残基；O16为一个氨基酸残基；O17为一个氨基酸残基；O23为一个氨基酸残基；OC不存在或为 O29，O29O30、O29O30O31、O29O30O31O32、O29O30O31O32O33、O29O30O31O32O33O34、O29O30O31O32O33O34O35或O29O30O31O32O33O34O35O36；且O29-O36分别独立地为氨基酸残基。
33.权利要求27的组合物，其中ON为O7；O7为一个非官能性残基；O10为一个酸性或亲水性残基；O11为一个碱性或非官能性残基；O12为一个芳族或非官能性残基；O15为一个亲水性或非官能性残基；O16为一个亲水性残基；O17为一个酸性或非官能性残基；O23为一个芳族残基；且OC不存在。
34.权利要求23的组合物，其中ON为O1O2O3O4O5O6O7；O1为一个非官能性氨基酸残基；O2为一个非官能性氨基酸残基；O3为一个亲水性氨基酸残基；O4为一个酸性氨基酸残基；O5为一个碱性或非官能性氨基酸残基；O6为一个亲水性氨基酸残基；O7为一个非官能性残基；O10为一个酸性或亲水性残基；O11为一个碱性或非官能性残基；O12为一个芳族或非官能性残基；O15为一个亲水性或非官能性残基；O16为一个亲水性残基；且O17为一个酸性或非官能性残基；且O23为一个芳族残基。
35.权利要求34的组合物，其中O1为A；O2为V；O3为S；O4为E；O5为H或I；O6为Q；O7为L；O10为N或D；O11为K或L；O12为G、F或W；O15为I或S；O16为Q或N；O17为D或L；且O23为F或W。
36.权利要求27的组合物，其中所述PTH/PTHrP调节结构域选自表2。
37.权利要求1的组合物，其中所述PTH/PTHrP调节结构域具有TIp39的氨基酸序列。
38.权利要求1的组合物，所述组合物包含一个选自表4的序列。
39.一种主题组合物，所述组合物包含一种选自SEQ ID NO17、18、19和69的肽。
40.一种编码权利要求1的组合物的核酸。
41.一种编码权利要求7的组合物的核酸。
42.一种编码权利要求20的组合物的核酸。
43.一种编码权利要求32的组合物的核酸。
44.一种编码权利要求39的组合物的核酸。
45.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求40的DNA。
46.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求41的DNA。
47.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求42的DNA。
48.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求43的DNA。
49.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求44的DNA。
50.一种包含权利要求45的表达载体的宿主细胞。
51.一种包含权利要求46的表达载体的宿主细胞。
52.一种包含权利要求47的表达载体的宿主细胞。
53.一种包含权利要求48的表达载体的宿主细胞。
54.一种包含权利要求49的表达载体的宿主细胞。
55.权利要求50的细胞，其中所述细胞为大肠杆菌细胞。
56.权利要求51的细胞，其中所述细胞为大肠杆菌细胞。
57.权利要求52的细胞，其中所述细胞为大肠杆菌细胞。
58.权利要求53的细胞，其中所述细胞为大肠杆菌细胞。
59.一种制备所述PTH/PTHrP受体拮抗剂的方法，所述方法包括a)选择至少一种与所述受体结合的肽；且b)制备包含与至少一个所选肽的氨基酸序列共价连接的至少一个Fc区的药物。
60.权利要求59的方法，其中所述肽选自SEQ ID NO3、4或5。
61.权利要求59的方法，其中所述肽在包括筛选以下文库的方法中进行选择噬菌体展示文库、大肠杆菌展示文库、核糖体文库。RNA-肽文库或化学肽文库。
62.权利要求59的方法，其中所述药物的制备通过以下步骤进行a)制备一种基因构建体，所述基因构建体包含一个编码所选肽的核酸序列和一个编码Fc区的核酸序列；且b)表达所述基因构建体。
63.权利要求59的方法，其中所述基因构建体在大肠杆菌细胞中表达。
64.权利要求59的方法，其中所述肽的选择通过包含下述步骤的方法进行a)制备一种基因构建体，所述基因构建体包含一个编码第一所选肽的核酸序列和一个编码Fc区的核酸序列；b)用所述基因构建体和诱变引物进行聚合酶链式反应，其中i)一种第一诱变引物包含一个与所述基因构建体编码链的5’端或5’端附近的序列互补的核酸序列，和ii)一种第二诱变引物包含与所述基因构建体非编码链的3’端互补的核酸序列。
65.一种治疗骨质稀少的方法，所述方法包括给予一种PTH激动剂和一种骨吸收抑制剂，其中所述PTH激动剂包含权利要求1的组合物。
66.一种治疗骨质稀少的方法，所述方法包括给予一种PTH激动剂和一种骨吸收抑制剂，其中所述PTH激动剂包含权利要求7的组合物。
67.一种治疗骨质稀少的方法，所述方法包括给予一种PTH激动剂和一种骨吸收抑制剂，其中所述PTH激动剂包含权利要求20的组合物。
68.一种治疗骨质稀少的方法，所述方法包括给予一种PTH激动剂和一种骨吸收抑制剂，其中所述PTH激动剂包含权利要求32的组合物。
69.一种治疗骨质稀少的方法，所述方法包括给予一种PTH激动剂和一种骨吸收抑制剂，其中所述PTH激动剂包含权利要求39的组合物。
70.权利要求65的方法，其中所述骨吸收抑制剂选自OPG、OPG-L抗体、降钙素、二膦酸、雌激素、雌激素受体调节剂和替勃龙。
71.权利要求66的方法，其中所述骨吸收抑制剂选自OPG、OPG-L抗体、降钙素、二膦酸、雌激素、雌激素受体调节剂和替勃龙。
72.权利要求67的方法，其中所述骨吸收抑制剂选自OPG、OPG-L抗体、降钙素、二膦酸、雌激素、雌激素受体调节剂和替勃龙。
73.权利要求68的方法，其中所述骨吸收抑制剂选自OPG、OPG-L抗体、降钙素、二膦酸、雌激素、雌激素受体调节剂和替勃龙。
74.权利要求69的方法，其中所述骨吸收抑制剂选自OPG、OPG-L抗体、降钙素、二膦酸、雌激素、雌激素受体调节剂和替勃龙。
75.一种治疗骨质稀少的方法，所述方法包括给予权利要求1的组合物。
76.一种治疗骨质稀少的方法，所述方法包括给予权利要求7的组合物。
77.一种治疗骨质稀少的方法，所述方法包括给予权利要求20的组合物。
78.一种治疗骨质稀少的方法，所述方法包括给予权利要求32的组合物。
79.一种治疗骨质稀少的方法，所述方法包括给予权利要求39的组合物。
全文摘要
本发明涉及调节PTH和PTHrP活性的治疗药。按照本发明，PTH和PTHrP的调节剂包含(1)一个PTH/PTHrP调节结构域；和(b)一个载体，例如聚合物(例如PEG或葡聚糖)或一个Fc区，优选其中所述载体共价连接于所述PTH/PTHrP调节结构域的C末端。所述载体和所述PTH/PTHrP调节结构域可以通过如下进一步描述的所述PTH/PTHrP调节结构域的N末端或C末端连接。优选的载体是Fc区，优选的Fc区是IgGFc区。优选的PTH/PTHrP调节结构域包含下文所述的PTH和PTHrP衍生的氨基酸序列。其它PTH/PTHrP调节结构域可以通过噬菌体展示、RNA－肽筛选和本文所述的其它技术来产生。这类肽通常会是PTH活性和PTHrP活性两者的调节剂，虽然这类技术可以用来产生用作选择性调节剂(例如PTH活性的激动剂、但不是PTHrP活性的激动剂)的肽序列。
文档编号A61P21/00GK1439021SQ01811719
公开日2003年8月27日 申请日期2001年4月27日 优先权日2000年4月27日
发明者P·科斯特努伊克, C·-F·刘, D·L·拉西 申请人:安姆根有限公司