专利名称：作为佐剂组合的qs－21和il－12的制作方法
背景技术：
IL-12是一种主要由树突细胞、巨噬细胞和嗜中性白细胞产生的异二聚体细胞因子，在1型免疫应答和细胞介导的免疫中起基本作用(Brunda，J.Leukocyte Biol.55280-288(1994)；Scott和Trinchieri，Semin.Immunol.9285-291(1997))。用各种动物模型进行的一些研究的结果支持如下观点，即rIL-12有很大的潜力作为预防或治疗传染性和转移性疾病的疫苗的佐剂(Rodolfo和Colombo，Methods 19114-120(1999)；Scott和Trinchieri，Semin.Immunol.9285-291(1997))。最近，报道了rIL-12可能用作RSV的天然F蛋白的佐剂(Hancock等，Viral Immunol.1357-72(2000))。在BALB/c小鼠中，结果表明当rIL-12吸附于氢氧化铝佐剂(F/AlOH)时，其能提高F蛋白引发T细胞应答的能力，使这种应答更平衡而并不朝2型表型极化。然而，用rIL-12共配制不能完全调节所有由F/AlOH引发的2型应答。即，用F/AlOH和rIL-12引发对小鼠的攻击时，仍观察到IL-5-依赖性肺嗜曙红细胞增多。另外，最近I期临床试验的数据(Atkins等，Clin，Cancer Res.3409-417(1997))也表明对常规的疫苗接种而言，高剂量rIL-12可能太反应原性。
已报道了高纯皂苷QS-21(Kensil等，J.Immunol.146431-437(1991))改善对F蛋白的免疫应答的质量和数量的能力(Hancock等，Vaccine 13391-400(1995)；Hancock等，J.Virol.707783-7791(1996))。与F/AlOH相比，用F/QS-21免疫接种未作过实验对象的小鼠的结果是产生增大的血清和滴定度(这与从占优势的G1产生F蛋白特异性Ig转移到G2亚类有关)。攻击后，由肺部中MHC类I限制的CD8+T细胞和蛋白质特异性抗体分泌细胞介导的抗原依赖性杀伤细胞活性也增加了。重要的是，IL-5-依赖性肺嗜曙红细胞明显减少。然而，临床数据表明该制剂中的QS-21与注射后的局部毒性相关。
发明概述本发明涉及一种含有效量的QS-21和IL-12以及任选的生理上可接受的载体的佐剂组合物。本发明还涉及包含有效量的QS-21和IL-12以及任选的生理上可接受的载体的组合物，其中该组合物基本不含3-O-去酰基化的单磷酸脂A。本发明还涉及包含有效量的QS-21和IL-12以及任选的生理上可接受的载体的组合物，其中该组合物包含低于约1μg的3-O-去酰基化的单磷酸脂A，更佳地是低于约0.5μg的3-O-去酰基化的单磷酸脂A，且更佳的为低于约0.0001μg(1Ug)的3-O-去酰基化的单磷酸脂A。在一优选实施例中，佐剂组合物不含3-O-去酰基化的单磷酸脂A。本发明还涉及包含有效量的QS-21和IL-12以及任选的生理上可接受的载体的佐剂组合物，其中该组合物包含低于约0.05μg的IL-12。在一实施例中，本发明还涉及基本由有效量的QS-21和IL-12以及任选的生理上可接受的载体组成的佐剂组合物。
在本发明的特定实施例中，当施用于脊椎动物时，QS-21的存在量基本不会产生局部的毒性。在本发明的其它实施例中，当施用于脊椎动物时，IL-12的存在量基本不是反应原性的。在本发明的优选实施例中，当施用于脊椎动物时，QS-21的存在量基本不会产生局部的毒性，IL-12的存在量基本不是反应原性的。较佳地，佐剂组合物包含有效量的QS-21和IL-12。如本文所述，QS-21和IL-12的有效量是指在维持组合物佐剂活性时，允许使用量减少的QS-21或IL-12或QS-21和IL-12两者的量(相对于各成分在其它成分不存在时达到类似免疫作用所需的量)。在本发明的优选实施例中，IL-12的存在量为约0.01ng到约50μg。在其它优选实施例中，QS-21的存在量为约0.01ng到约50μg。较佳地，QS-21和IL-12的组合产生协同的佐剂作用。在本发明的一实施例中，IL-12是重组人IL-12。
本发明还涉及包含至少一种抗原和佐剂组合物的免疫原性组合物，佐剂组合物包含有效量的IL-12和QS-21。本发明还涉及包含至少一种抗原和佐剂组合物的免疫原性组合物，所述的佐剂组合物包含有效量的IL-12和QS-21，其中佐剂组合物基本不含3-O-去酰基化的单磷酸脂A。本发明还涉及包含至少一种抗原和佐剂组合物的免疫原性组合物，所述的佐剂组合物包含有效量的IL-12和QS-21，其中佐剂组合物包含低于约1μg的3-O-去酰基化的单磷酸脂A，更佳地低于约0.5μg的3-O-去酰基化的单磷酸脂A和更佳地低于约0.0001μg(1Ug)的3-O-去酰基化的单磷酸脂A。在一优选实施例中，佐剂组合物不含3-O-去酰基化的单磷酸脂A。本发明还涉及含有至少一种抗原和佐剂组合物的免疫原性组合物，所述的佐剂组合物包含有效量的QS-21和IL-12，其中组合物含有低于约0.05μg IL-12。在一实施例中，本发明涉及包含至少一种抗原和佐剂组合物的免疫原性组合物，所述的佐剂组合物基本由有效量的QS-21和IL-12以及任选的生理上可接受的载体组成。
在免疫原性组合物的特定优选例中，当施用于脊椎动物时，QS-21的存在量基本不会产生局部毒性。在本发明的其它实施例中，当施用于脊椎动物时，IL-12的存在量基本不是反应原性的。在本发明的优选实施例中，当施用于脊椎动物时，QS-21的存在量基本不会产生局部毒性，IL-12的存在量基本不是反应原性的。在本发明的优选实施例中，IL-12的存在量为约0.01ng到约50μg。在其它优选实施例中，QS-21的存在量为约0.01ng到约50μg。较佳地，QS-21和IL-12产生协同的佐剂作用。在本发明的一个实施例中，IL-12是重组人IL-12。在本发明的一个实施例中，抗原是病毒抗原。在本发明的一优选实施例中，抗原是呼吸道合胞病毒F蛋白或其功能性部分。在另一实施例中，抗原是细菌抗原。在该实施例中，优选的抗原是非典型的流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)的P4蛋白或其功能性部分。
本发明还涉及引发针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向脊椎动物施用免疫有效量的组合物，该组合物包含至少一种抗原和佐剂组合物，所述的佐剂组合物包含有效量的QS-21和IL-12，从而引发针对脊椎动物体内抗原的免疫应答。本发明还涉及引发针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向脊椎动物施用免疫有效量的组合物，该组合物包含至少一种抗原和佐剂组合物，所述的佐剂组合物包含有效量的QS-21和IL-12，其中佐剂组合物基本不含3-O-去酰基化的单磷酸脂A，从而引发针对脊椎动物体内抗原的免疫应答。本发明还涉及引发针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向脊椎动物施用免疫有效量的组合物，该组合物包含至少一种抗原和佐剂组合物，所述的佐剂组合物包含有效量的QS-21和IL-12，其中佐剂组合物包含低于约1μg的3-O-去酰基化的单磷酸脂A，较佳地低于约0.5μg的3-O-去酰基化的单磷酸脂A，更佳地低于约0.0001μg(1Ug)的3-O-去酰基化的单磷酸脂A，从而引发针对脊椎动物体内抗原的免疫应答。本发明还涉及引发针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向脊椎动物施用免疫有效量的组合物，该组合物包含至少一种抗原和佐剂组合物，所述的佐剂组合物包含有效量的QS-21和IL-12，其中佐剂组合物包含低于约0.05μg的Il-12，从而引发针对脊椎动物体内抗原的免疫应答。在一实施例中，本发明涉及引发针对抗原的免疫应答的方法，所述的方法包括向脊椎动物施用免疫有效量的组合物，该组合物包含至少一种抗原和佐剂组合物，所述的佐剂组合物基本由有效量的QS-21和IL-12以及任选的生理上可接受的载体组成。
在本发明方法的特定实施例中，当施用于脊椎动物时，QS-21的存在量基本不会产生局部毒性。在本发明的其它实施例中，当施用于脊椎动物时，IL-12的存在量基本不是反应原性的。在本发明的优选实施例中，当施用于脊椎动物时，QS-21的存在量基本不会产生局部毒性，IL-12的存在量基本不是反应原性的。
在本发明的优选实施例中，Il-12的存在量为约0.01ng到约50μg。在其它优选实施例中，QS-21的存在量为约0.01ng到约50μg。较佳地，QS-21和IL-12产生协同的佐剂作用。在本发明的一个实施例中，IL-12是重组人IL-12。在本发明的一个实施例中，抗原是病毒抗原。在一优选实施例中，抗原是呼吸道合胞病毒F蛋白或其功能性部分。在另一实施例中，抗原是细菌抗原。在该实施例中，优选的抗原是可非典型的流感嗜血菌的P4蛋白或其功能性部分。在一实施例中，免疫应答包括选自以下的应答体液应答、细胞介导的应答或体液和细胞介导的应答。
附图简述
图1A-1F显示用rIL-12和QS-21共同配制的RSV F蛋白接种BALB/c小鼠的脾中抗原依赖性杀伤细胞前体。在图1A-1E中，用1.0μgrIL-12/剂量(实心圆)制备的F蛋白或仅PBS(空心圆)。用20.0(图1A)、4.0(图1B)、0.8(图1C)、或0.0(图1D)μg QS-21/剂量共同配制疫苗。用QS-21(20μg)仅与PBS(空心方块)注射对照小鼠(图1E)，或用RSV的A2菌株(空心三角)试验性地感染(～2×106pfu)对照小鼠。图1F显示了独立试验，其中F蛋白仅用PBS制备或与0.8μgQS-21一起制备，以及rIL-12剂量递减(1.0到0.01μg)。测试效应细胞针对RSV-感染的(实线或实心柱)和对照(短划线或空心柱)同系靶细胞的抗原依赖性杀伤细胞活性；效应细胞与靶细胞的比例为100∶1。
发明详述由疫苗接种诱发的保护性免疫力取决于疫苗引发适合的免疫应答以抵抗或消灭病原的能力。根据病原体，这可能需要细胞介导的和/或体液免疫应答。辅助T细胞在免疫应答中作用的实例是在T细胞可在其产生的细胞因子的基础上分成亚组，且在这些细胞中观察到的不同细胞因子特性确定了它们的功能。这种T细胞模型包括两个主要亚组产生IL-2和干扰素-γ(IFN-γ)的Th1细胞，其增加细胞和体液免疫应答；和产生IL-4、IL-5和IL-10的Th2细胞，增加体液免疫应答(Mosmann等，J.Immunol.1262348(1986))。经常需要提高抗原的免疫原性，以便在接受免疫接种的生物体中获得教强的免疫应答，针对特定类型的应答定向免疫应答和强化宿主对携带抗原的试剂的抗性。能提高与其一起施用的抗原的免疫原性的物质称为佐剂。
用各种动物模型进行的一些研究的结果支持如下观点，即重组rIL-12有希望作为预防或治疗传染性和转移性疾病的疫苗的佐剂(Rodolfo和Colombo，Methods 19114-120(1999)；Scott和Trinchieri，Semin.Immunol.146431-427(1991))。已报道了IL-12改进针对RSV F蛋白的免疫应答的质量和数量的能力(Hancock等，Vaccine 13391-400(1995)；Hancock等，J.Virol707783-7791(1996))。
本发明的研究表明QS-21可与IL-12协同作用，能引发全身的体液和细胞介导的免疫应答。因此，IL-12和QS-21一起形成强佐剂组合引发针对抗原的功能性细胞介导的和体液免疫应答。这种协同作用可以降低佐剂的总量和/或降低佐剂各成分的量(单独使用可能会产生不良效果)。
佐剂组合物包含有效量的QS-21和IL-12。如本文所述，QS-21的有效量指针对至少一种抗原允许组合物中使用量降低的IL-12同时维持佐剂组合物的佐剂活性(如引发体液应答、引发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答、或同时引发体液应答和CTL应答)的量。IL-12的有效量指针对至少一种抗原允许组合物中使用量降低的QS-21同时维持佐剂组合物的佐剂活性(如引发体液应答、引发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答、或同时引发体液应答和CTL应答)的量。如本文所述，QS-21和IL-12的有效量是指在维持组合物佐剂活性时，允许使用量减少的QS-21或IL-12或QS-21和IL-12两者的量(相对于各成分在其它成分不存在时达到类似免疫作用所需的量)。
有效量可以是附加的或协同的；然而，较佳地，有效量是协同的。即，IL-12和QS-21组合的附加或协同效果允许使用不被视为是引发所需免疫应答最佳的IL-12、QS-21或IL-12和QS-21的量。如本文所述，组合佐剂(QS-21和IL-12)的协同作用指在各自使用时大于IL-12佐剂效果(尤其是佐剂组合物中所用的浓度)和QS-21佐剂效果(尤其是佐剂组合物中所用的浓度)总和的作用。使用减少量的IL-12、QS-21或IL-12与QS-21有利于降低可能与剂量较高的IL-12和QS-21相关的副作用(如毒性和反应原性)。通过剂量曲线试验，用一种佐剂的特定降低剂量并监测第二种佐剂递增量的效果并同时维持所需的佐剂活性，可以确定QS-21和IL-12的有效量。
在优选实施例中，IL-12的存在量对接受佐剂组合物的哺乳动物基本不是反应原性的。即，IL-12在组合物中的存在量宜在接受组合物的哺乳动物中不产生不能接受的应答。在一优选实施例中，IL-12的存在量基本不会产生发烧、恶心、呕吐、口炎、异常肝功能试验、淋巴细胞减少、贫血、中性白细胞减少、高血糖、血小板减少和/或白蛋白血症减少。在一实施例中，IL-12的存在量为约0.01ng到约50μg。例如，IL-12的存在量可以为约0.01ng到约35μg，或约0.01ng到约20μg，或约0.01ng到约15μg，或约0.01ng到约10μg，或约0.01ng到约5μg。在特定实施例中，IL-12的存在量为约0.01μg到约0.1μg。在一个实施例中，IL-12的存在量低于约0.05μg。所用的具体剂量取决于所治疗的哺乳动物的年龄、体重和用药条件，以及给药的方法和抗原。本领域技术人员易根据本文所提供的指导确定合适的剂量。
可从任何合适的来源获得IL-12。较佳地，IL-12是重组IL-12(rIL-12)，即其可以是用重组DNA方法产生的；例如，在宿主系统中克隆和表达编码人IL-12的基因，从而产生大量纯的人IL-12。IL-12的生物活性亚单位或片段也可用于本发明。另外，一些T淋巴细胞系产生高水平的IL-12，从而提供非常易得的来源。重组人和鼠IL-12的商业来源包括Genetics Institute，Inc.(Cambridge，MA)(也可参见国际专利申请WO 90/05147)。
QS-21是从粗皂树(Qyullaja saponaria)提取物纯化的皂素，且已由Kensil和Marciani(美国专利No.5,057,540)描述过。在本发明的优选实施例中，组合物中QS-21的存在量基本不会在接受该组合物的哺乳动物体内产生局部毒性。在具体实施例中，组合物中QS-21的存在量低于约50μg，更佳地低于约20μg。在优选实施例中，组合物中QS-21的存在量低于约10μg，较佳地低于约4μg，且更佳地低于约1μg。例如，QS-21的存在量可以为约0.01ng到约35μg，或约0.01ng到约20μg，或约0.01ng到约15μg，或约0.01ng到约10μg，或约0.01ng到约5μg。在一实施例中，QS-21的存在量为约0.8μg或更低。
本发明还涉及免疫原性疫苗或药物组合物，其包含本文所述的佐剂组合物和一种或多种抗原以及任选的生理上或药学上可接受的载体。如本文所述，免疫原性组合物是引发接受该组合物的哺乳动物免疫应答的组合物。引发的免疫应答可以是体液或细胞介导的。如本文所述，疫苗组合物是能引发接受该组合物的哺乳动物的免疫应答并能保护该哺乳动物免受组合物的抗原或相关生物随后的攻击或感染的组合物。
如本文所述，“保护”(如针对RSV的保护)指在脊椎动物(如哺乳动物)中产生保护性的(部分或完全)针对由组合物中的抗原或相关生物(如RSV)引起的疾病表现的免疫应答。对由RSV病毒引起的疾病有保护的脊椎动物可能受RSV的感染，但其程度比未免疫接种的要低；可能受RSV的感染，但不会表现出病症；或可能受RSV感染，但其病症比未免疫接种产生的病症少。或者，对由RSV病毒引起的疾病有保护的脊椎动物，即使与病毒接触，也可能根本不被RSV病毒感染。
组合物的抗原成分可选自几乎任何抗原、抗原性的决定簇或感兴趣的医用或兽用药物的半抗原，尤其是能增加免疫原性(如CTL应答)的那些抗原。例如，抗原可以为纯化的或部分纯化形式的抗原，衍生自细菌、病毒、立克次氏体、真菌、寄生虫或它们的产物，或细菌、病毒、立克次氏体、真菌或寄生虫的提取物，或者抗原可以是变应原如花粉、尘埃、头皮屑及其提取物。抗原还可以以有毒昆虫或爬虫得到的毒物或毒液形式。较佳地，抗原可以其毒物或毒性已减少或被破坏的形式，且当被引入到本发明组合物中合适的宿主内时会引发主动免疫，通过在其中产生针对制备抗原所用的微生物、微生物的提取物或产物的抗体，或所用的是变应原时，会帮助减轻由特异性变应原产生的变应性症状。抗原可以单独或组合使用；例如，多种细菌抗原、多种病毒抗原、多种支原体抗原、多种立克次氏体抗原、多种真菌抗原、多种寄生虫抗原、多种细菌或病毒类毒素、多种变应原或任何上述产物的组合可与本发明的佐剂组合物联用。
本发明的佐剂组合适用于含有多种抗原的免疫原性组合物，所述的抗原来自多种致病微生物，包括(但不限制于)感染人和非人类脊椎动物的病毒、细菌、真菌或寄生虫微生物或来自癌细胞或肿瘤细胞。抗原可包含衍生自蛋白质以及下述任一物质的片段的肽或多肽糖、蛋白质、多-或寡核苷酸、癌或肿瘤细胞或其它大分子成分。例如，在免疫原性组合物中可包含多种抗原。
含有本发明佐剂组合物的理想的病毒疫苗包括那些用于预防和/或治疗由以下病毒引起的疾病的疫苗(但不限制于)人免疫缺陷型病毒、呼吸道合胞病毒、1-3型副流感病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、杯状病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、狂犬病病毒、犬热病病毒、冠状病毒、细小病毒、传染性鼻气管炎病毒、猫白血病病毒、猫传染性腹膜炎病毒、禽传染性囊炎病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒、猪呼吸和生殖综合征病毒、马动脉炎病毒和各种脑炎病毒。
含有本发明佐剂组合物的理想的细菌疫苗包括那些用于预防和/或治疗由以下细菌引起的疾病的疫苗(但不限制于)流感嗜血菌(典型的和非典型的)、睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellacatarrhalis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、大肠杆菌、志贺氏菌、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)-胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)复合物、奇异变形菌(Proteus mirabilis)、普通变形菌(Proteus vulgaris)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropheumoniae)和鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)。在一实施例中，抗原是非典型流感嗜血菌的P4蛋白或其功能性部分。
含有本发明佐剂组合物的理想的抗真菌病原体的疫苗包括那些用于预防和/或治疗由以下真菌病原体引起的疾病的疫苗(但不限制于)曲霉、芽生菌、念球菌、球孢子菌、隐球菌和组织胞浆菌。
含有本发明佐剂组合物的理想的抗寄生虫的疫苗包括那些用于预防和/或治疗由以下寄生虫引起的疾病的疫苗(但不限制于)利什曼虫、蛔虫、鞭虫、鞭毛虫、血吸虫、隐孢子虫、滴虫、冈氏弓形虫和卡林尼肺囊虫。
含有本发明佐剂组合物的理想的在脊椎动物宿主体内引发治疗或预防抗癌作用的疫苗包括那些使用以下癌抗原或肿瘤相关抗原的疫苗(但不限制于)前列腺特异性抗原、癌胚抗原、MUC-1、Her2、CA-125和MAGE-3。
含有本发明佐剂组合物的理想的调节脊椎动物宿主中对变应原应答的疫苗包括那些含有变应原及其片段的疫苗。美国专利No.5,830,877和已出版的国际专利申请No.WO99/5125g(本文将它们全部纳入作为参考)中描述了这些变应原的实例，包括花粉、昆虫毒液、动物头皮屑、真菌孢子和药物(如青霉素)。疫苗干扰IgE抗体(一种已知的过敏反应源)的产生。
含有本发明佐剂组合物的理想的预防或治疗脊椎动物宿主中以淀粉状蛋白沉积为特征的疾病的疫苗包括那些含有淀粉状蛋白肽蛋白(APP)的部分的疫苗。这种疾病指多种疾病如阿尔茨海默病、淀粉样变性或淀粉样蛋白源性病。β-淀粉状蛋白肽(也称为Aβ肽)是APP的42氨基酸片段，其是通过用β和γ分泌酶加工APP产生的，具有如下序列Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His GlnLys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys GlyAla Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(SEQ ID NO1)在一些患者中，淀粉状蛋白沉积物为聚集的Aβ肽形式。现在人们惊讶地发现施用分离的Aβ肽，在脊椎动物宿主中引发抗淀粉状蛋白沉积物的Aβ肽成分的免疫应答(已出版的国际专利申请No.WO99/27944)。因此，本发明的疫苗包括本发明的佐剂组合物与Aβ肽，以及Aβ肽的片段和Aβ肽的抗体或其片段。Aβ肽的片段为具有如下序列的28氨基酸肽(美国专利No.4,666,829)Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln LysLeu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys(SEQ ID NO2)在一优选实施例中，抗原是呼吸道合胞病毒抗原。呼吸道合胞病毒(RSV)(副粘病毒科的负链病毒)是下肺道疾病的主要原因，尤其在幼小儿童和婴儿中。RSV包含2种主要外包膜糖蛋白、融合(F)蛋白和附着(G)蛋白，它们对病毒的感染性是重要的，因此是设计用于RSV的亚单位疫苗的合理的靶。虽然本发明在RSV F蛋白抗原方面作了说明，但应理解本发明并非局限于本发明的组合物中使用RSV F蛋白抗原。
RSV F蛋白的野生型(天然)核苷酸和氨基酸序列是本领域已知的(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)817683-7687(1984)；美国专利No.5,639,853；美国专利No.5,723,130)。适用于本发明的RSV蛋白包括完整的RSV F蛋白以及RSV F蛋白的功能性部分。例如，功能性部分可以是保留了当施用于哺乳动物时能引发抗体应答能力的蛋白质的部分。这种免疫原性部分的实例为包含RSV F蛋白283-315、289-315和294-299位氨基酸的多肽。这些区域包括引发中和和抗融合抗体的RSV F蛋白的表位(Paradiso等，美国专利No.5,639,853)。或者，也可使用天然二聚形式的RSV F蛋白(140kD)(Paradiso等，美国专利No.5,223,254)。
本发明的F蛋白和多肽可以是部分或基本纯化的(如纯化至同质性)，和/或基本无其它蛋白。或者，本发明的F蛋白或多肽是化学合成的或是用本领域已知的方法重组产生的(参见，如Broach等，《基因表达实验操作》(Experimental Manipulation of Gene Expression)，M.Inouye编辑(AcademicPress，1983)第83页；《分子克隆实验室手册》(Molecular ClongALaboratory Manual)，第2版，Sambrook等编辑(Cold Spring Harbor laboratoryPress，1989)第16和17章)。可以用各种方法从重组细胞培养物分离或纯化(如到同质性)本发明的蛋白质和多肽。这些方法包括(但并非限制于)阴离子或阳离子离子交换层析、乙醇沉淀、亲和层析和高效液相层析(HPLC)。所用的具体方法取决于多肽的特性和宿主的选择；适合的方法对本领域的技术人员是显而易见的。
合适的RSV F蛋白还包括具有一个或多个氨基酸改变的RSV蛋白或部分。如本文所述，“改变”及其派生指氨基酸的变化。改变包括插入、缺失和/或一个或多个氨基酸的替代。例如，改变宜为保守的氨基酸变化或保留天然F蛋白的三维构型。另外，可以用本领域技术人员已知的方法鉴定对F蛋白的功能(尤其是免疫原性)是必需的氨基酸。具体可用的方法包括保守氨基酸的鉴定、定向诱变和丙氨酸-扫描诱变(如，Cunningham和Wells，Science 2441081-1085(1989))、结晶和核磁共振。可以测试用这些方法产生的改变的蛋白质或多肽的生物活性(包括免疫原性和抗原性)。
具体地说，可以一些标准为基础进行适合的氨基酸改变，这些标准包括疏水性、碱性或酸性特征、电荷、极性、大小、官能团(如-SH或糖基化位点)的存在与否、和芳基特征。对本领域技术人员而言，在上述特性基础上各种氨基酸排列成类似的基团是显而易见的；其它适合的氨基酸变化还可参见Bowie等，Science 2471306-1310(1990)。
本发明的蛋白抗原(如F蛋白或多肽)还可以是包含所有或部分融合于其它成分的蛋白质氨基酸序列的融合蛋白。可选择所述的其它成分(如放射性同位素和抗原性标记)以协助分离和纯化多肽或延长多肽的半衰期。在一实施例中，蛋白抗原是F蛋白或多肽，其是包含所有或部分融合于全部或部分RSV G蛋白氨基酸序列的F蛋白氨基酸序列的融合蛋白(Wertz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924075-4079(1985)；Satake等，Nucl.Acids Res.13(21)7795-7810(1985))。
本发明还涉及包含编码抗原(如RSV F蛋白或多肽)的核酸分子和有效量的IL-12和QS-21以及任选的生理上可接受的载体的组合物。这里也将这种组合物称为免疫原性核酸组合物或免疫原性DNA组合物，可用于遗传免疫接种脊椎动物。本文所用的术语“遗传免疫接种”指用针对致病物质(尤其是RSV)的核酸疫苗接种脊椎动物(尤其是哺乳动物)，从而引发免疫应答，且最好由此保护脊椎动物抵抗RSV。本文所用的术语“免疫原性核酸组合物”或“免疫原性DNA组合物”指含有编码多肽抗原(尤其是RSV F蛋白或多肽)的核酸分子的核酸构建物。核酸构建物也可包括转录启动子元件、增强子元件、剪接信号、终止信号和聚腺苷酸化信号以及其它核酸序列。将免疫原性核酸组合物与本文所述的有效量的IL-12和QS-21一起施用。
可用标准方法制备免疫原性核酸组合物。例如，用已知的方法可以将编码RSV F蛋白或多肽的核酸(如DNA)插入表达载体构建免疫原性核酸组合物(参见Maniatis等，《分子克隆，实验室手册》第2版，Cold Spting Harbor LaboratoryPress(1989))。可以按标准方法，用免疫原性核酸组合物接种各脊椎动物(即施用免疫原性核酸组合物)。该脊椎动物可以是皮下、静脉内、腹腔内、皮内、肌肉内、局部、口腔内、直肠、鼻、脸颊、阴道接种，通过吸入喷雾或通过移植入储器(含有常规无毒生理可接受的载体或载体的剂型)。或者，用粒子加速装置(“基因枪”)给脊椎动物接种免疫原性核酸组合物。如此施用的形式(如胶囊、片剂、溶液、乳剂)部分取决于施用所采取的途径。例如，对于粘膜给药可以使用滴鼻剂、吸入剂或栓剂。在一具体实施例中，将核酸构建物与转染促进剂一起施用。在一优选实施例中，转染促进剂是布比卡因(bupivicaine)(美国专利No.5,593,972)。
抗原成分或免疫原性组合物的量部分取决于抗原的同一性，以及宿主的年龄、体重和身体状况，以及施用的方法。另外，本领域技术人员易确定合适的剂量。本领域技术人员也易确定免疫原性组合物的剂量的数量和给药方案。在一些实例中，佐剂组合的辅药特性可能降低所需的剂量数量或给药方案的时间过程。
免疫原性组合物使用佐剂组合物的佐剂量。本文所用的术语“佐剂量”指佐剂组合物的用量(或除QS-21或IL-12以外的佐剂量)足以引发体液应答、CTL应答或体液和CTL应答。较佳地，佐剂量足以提高或改善免疫原性组合物的一种或多种抗原的免疫应答。较佳地，当使用三种或多种佐剂时，佐剂量足以提高或改善免疫原性组合物的两种或多种抗原的免疫应答。
本发明的组合物还可任选地包含其它佐剂，如植物油或其乳剂、氢氧化铝、磷酸铝、表面活性剂如十六烷基胺、十八烷基氨基酸酯、十八烷基胺、溶血卵磷脂、二甲基-二十八烷基溴化铵、N，N-二十八烷基-N’-N二(2-羟乙基-丙二胺)、甲氧基十六烷基甘油和多聚醇；聚胺，如吡喃、葡聚糖硫酸酯、聚IC、acrbopol；肽，如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸、促吞噬肽；免疫刺激复合物；油性乳剂；脂多糖，如MPL_(3-O-脱酰基化的单磷酸脂A；RIBI ImmunoChemResearch，Inc.，Hamilton，Montana)；和矿物凝胶。还可将本发明的抗原掺入脂质体、螺旋体(cochleate)、生物可降解的聚合物如聚-丙交酯、聚-乙交酯和聚-丙交酯-共-乙交酯，或ISCOMS(免疫刺激复合物)，并且还可使用辅助的活性成分。在一优选实施例中，本发明的佐剂、免疫原性疫苗或药物组合物不含大量MPL_。本文所用的术语“大量MPL_”指将附加的赋剂性赋于组合物的量。或者，佐剂、免疫原性疫苗或药物组合物含有量低于约1μg的MPL_，较佳地为低于约0.5μg，更佳地为低于约1Ug。本发明的组合物还可与细菌毒素及其减毒衍生物一起施用。本发明的组合物还可与其它淋巴因子一起施用，所述的淋巴因子包括(但并非限制于)IL-2、IL-3、IL-15、IFN-γ和GM-CSF。
本发明的RSV F蛋白可与其它分子偶联，从而调节或提高免疫应答。合适的载体蛋白包括细菌毒素(对施用于哺乳动物是安全的且具有作为载体的免疫作用)。实例包括百日咳、白喉和破伤风类毒素，和无毒的突变蛋白(交叉反应物(CRM))，如白喉类毒素CRM197的无毒变体。含有至少一个T-细胞表位的天然毒素或类毒素的片段也可用作抗原的载体。制备抗原和载体分子的偶联物的方法是本领域熟知的，且可在文献中借鉴，如Dick和Burret，Contrib MicrobialImmunol.1048-114(Cruse JM，Lewis RE Jr编辑；Based，Krager(1989)和美国专利No.5,360,897(Anderson等)。还可将本发明的抗原吸附到明矾上。
本发明的组合物包含任选的生理上或药学上可接受的载体或基质。具体的生理学基质包括(但并非限制于)水、缓冲盐水、多醇(如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇)和葡萄糖溶液。按熟知的方法通过试验可确定所选基质中活性成分的最佳浓度，且该浓度还取决于所需的最终的药物制剂。该组合物还可以常规方式与免疫学上可接受的稀释剂或载体混合，以制备可注射的液态溶液或悬浮液。根据所治疗的疾病或状况，可用多种给药途径，包括(但并非限制于)口服、规定饮食、局部、阴道、直肠、皮内、经皮(参见，如已出版的国际专利申请WO 98/20734，本文将其纳入作为参考)、肠胃外(如静脉内、动脉内、肌肉内、皮下注射)，吸入法(支气管内、眼内、鼻内或口腔吸入、滴鼻剂)。其它合适的给药方式还包括可再装药的或生物可降解的装置以及缓释聚合物装置。本发明的药物组合物还可作为联合治疗的一部分与其它药剂一起施用。
本发明还涉及引发针对抗原(如RSV抗原)的免疫应答的方法，该方法包括向脊椎动物(如哺乳动物)宿主施用免疫有效量的免疫原性组合物，该组合物包含抗原与有效量的IL-12和QS-21的混合物，且还任选地包含生理上可接受的载体。本发明还涉及在脊椎动物中引发体液或CTL-介导的免疫应答的方法，该方法包括向脊椎动物施用免疫有效量的免疫原性组合物，该组合物包含抗原与有效量的IL-12和QS-21的混合物，且该组合物还任选地包含生理上可接受的载体。如本文所述，免疫原性组合物的“免疫有效”剂量指适合引发免疫应答的剂量。具体的剂量取决于患者的年龄和体重。组合物还可任选地以药学上或生理上可接受的载体施用，如生理盐水或乙醇、多醇如甘油或丙二醇。适合本文所述的免疫接种的脊椎动物包括(但并非限制于)灵长类动物(如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠和其它牛科动物、羊科动物、马科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物或鼠科动物。
用以下非限制性实施例进一步说明本发明。本文引用的所有参考文献、专利以及专利申请都全部纳入作为参考。
实施例除非详细描述，以下实施例都是用本领域技术人员熟知的和常规的标准方法进行的。以下实施例仅用于说明，对本发明的范围无任何限制。
实施例1用与QS-21和重组(r)IL-12共同配制的RSV F蛋白接种BALB/c小鼠的全身体液免疫应答这些试验的目的是确定与QS-21和重组IL-12共同配制的RSV F蛋白是否能引发比单用任一佐剂免疫后达到的滴定度更高的功能性血清抗体滴定度。在这些试验中，通过离子交换层析，从被RSV的A2菌株感染的Vero细胞(ATCC No.CCL81)纯化出天然F蛋白。通过SDS-PAGE和抗原捕获ELISA估计该蛋白的纯度高于95％。分别从Aquila BioPharmaceuticals，Inc.(Worcester，MA)和Genetics Institute(Cambridge，MA)得到QS-21和rIL-12。从Charles RiverLaboratories(Wilmington，ME)得到未作过实验对象的雌性BALB/c小鼠(8-10周龄)，并在第0和4周用天然F蛋白(3μg/剂量)进行肌肉内接种。疫苗是如此制备的，即用递减剂量(1.0、0.1、0.01μg)的rIL-2制备F蛋白(F/rIL-12)，并与亚最佳剂量的QS-21(0.8μg)共同配制。用F/rIL-12而无QS-21、与20或0.8μg QS-21混合的F蛋白或仅PBS的F蛋白溶液注射对照小鼠。在用RSV的A2菌株试验性的感染(～2×106pfu)后，接种其它对照小鼠。在可注射的麻醉(氯胺酮(60mg/kg)和甲苯噻嗪(2-5mg/kg)，The Butler Co.，Dublin OH)下进行鼻内感染(0.05ml)。
在第二次疫苗接种后2周，通过终点ELISA和噬斑减少中和试验分别测定血清IgG的几何平均值和中和抗体滴定度(±1标准偏差)。确定无(-)和存在(+)作为补体源(C)的5％(V/V)豚鼠血清(BioWhittaker，Walkersville，MD)时抵抗病毒A2菌株的中和滴定度。将中和滴定度计算为每孔病灶数显示减少60％(相对于病毒对照)的血清稀释度的倒数。用JMP_统计发现软件(SAS InstituteInc.，Cary，NC)，通过Tukey-Kramer HSD多重比较，测定对数变换后的显著差异(＜0.05)。将所有动物都关养在由美国实验动物养护资格认可协会(American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care)认可的设备中。
结果表1所示的结果证实上述数据，并证明用最佳剂量的QS-21(20.0μg)而无IL-12疫苗接种产生的全身体液和细胞介导的免疫应答在量度和功能上与试验性感染后所观察到的类似。在第二次免疫接种后2周，抗-F蛋白IgG1和IgG2a滴定度和补体辅助的中和滴定度明显提高。另一方面，用与亚最佳剂量的QS-21(0.8μg)而无IL-12相混合的F蛋白疫苗接种，得到的血清抗体滴定度与F/QS-21(20.0μg)细胞相比低许多。这些结果还表明用但用PBS(无QS-21)配制的F/rIL-12(0.01-1.0μg)免疫不产生明显的补体辅助的血清中和滴定度。
综上所述，结果表明QS-21和rIL-12形成强的佐剂制剂。对产生功能性血清抗体而言，0.8μgQS-21和rIL-12之间的增效是明显的。表1显示了用0.8μgQS-21和rIL-12配制的F蛋白第二次免疫接种后2周产生的抗体滴定度。将0.8μg QS-21加到1.0、0.1或0.01μg rIL-2中，导致IgG2a和补体辅助的中和滴定度比用F/rIL-12而无QS-21或单用F/QS-21(0.8μg)注射后产生的滴定度高许多。另外，补体辅助的中和滴定度与试验性感染后产生的滴定度差异不明显。当将用F/rIL-12(1.0-0.01μg)加0.8μg QS-21接种的小鼠的血清与用F/rIL-12而无QS-21免疫的小鼠的血清相比时，抗F蛋白特异性IgG1滴定度没有观察到明显的差异。在所进行的4组研究的3组中观察到rIL-12和QS-21间引发RSV中和滴定度的增效作用。
实施例2确定用与QS-21和rIL-12共同配制的F蛋白接种的BALB/c小鼠的脾中抗原依赖性杀伤细胞的活性这些试验的目的是确定用与QS-21和rIL-12配制的F蛋白免疫引发的抗原依赖性杀伤细胞活性是否比单用各佐剂免疫接种后达到的活性高。在这些试验中，按实施例1所述纯化天然F蛋白、制备疫苗并将其施用于未作过实验对象的雌性BALB/c小鼠。为了确定抗原依赖性杀伤细胞的存在，在第二次免疫接种后2周收集脾细胞，并在同系RSV-感染的刺激细胞存在下培育6天。此后，测试变应细胞(在RPMI1640中用10％热灭活的胎牛血清进行3倍的连续稀释)抵抗RSV-感染的和对照同系靶细胞，在标准51Cr释放试验中的抗原依赖性杀伤细胞活性。在图1F中，效应细胞与靶细胞的比例为100∶1。每组5只小鼠。
结果图1A-1F所示的结果证明了先前出版的数据并表明用F/QS-21(20.0μg)免疫接种使抗原依赖性杀伤细胞的活性明显增加(图1A和F)。另一方面，用与亚最佳剂量QS-21(0.8μg)混合的F蛋白疫苗接种不引发显著的抗原依赖性杀伤细胞活性(图1C和F)。这些结果还证实早期的报道，该报道论证仅用PBS配制的F/rIL-12(0.01-1.0μg)不产生可检测的抗原依赖性杀伤细胞(图1D和F)。
但综上所述，这些结果表明QS-21和rIL-12形成F蛋白的强佐剂制剂。数据表明0.8μg QS-21与1.0或0.1μgrIL-12协同作用，并使F蛋白在BALB/c小鼠脾内产生的抗原依赖性杀伤细胞前体的水平与试验性感染或用F/QS-21(20μg)疫苗接种后引发的水平类似。杀伤细胞的活性分别比用F/rIL-12(1.0μg)(图1D)或F/QS-21(0.8μg)(图1C)疫苗接种的高5和3倍(效应细胞与靶细胞的比例为33∶1)。图1F显示了第二组试验的数据，其中0.8μg QS-21与0.1或1.0μgrIL-12协同作用(效应细胞与靶细胞的比例为100∶1)。当在疫苗中使用20.0μg QS-21时，没有观察到rIL-12和QS-21在产生功能性细胞介导的免疫应答上的协同作用(图1A)。在4.0μgQS-21剂量上似乎有协同作用的趋向。在用F/AlOH接种的小鼠脾中未观察到显著的杀伤细胞活性。未观察到针对同系对照靶(未用RSV感染)的细胞溶解(图1)。在所进行的3组研究的3组中都观察到rIL-12和QS-21间产生抗原依赖性杀伤细胞活性的协同作用。表1用F/rIL-12和QS-21第二次免疫接种后2周BALB/c小鼠的血清抗体滴定度。
血清抗体滴定度(Log10)F蛋白中和
aP＜0.05与用F/PBS和QS-21(20.0μg)或F/PBS疫苗接种的小鼠的IgG1、IgG2a和C-协助的中和抗体滴定度。
bP＜0.05与仅用F/PBS QS-21(0.8μg)疫苗接种小鼠的IgG2a和C-协助的中和滴定度。
cP＜0.05与用与0.8μgQS-21共同配制的F/rIL-12(1.0-0.01μg)疫苗接种可比较小鼠的IgG2a和C-协助的中和滴定度。
实施例3由QS-21和rIL-12构成的佐剂对由引发Th2辅助T细胞的抗原RSV G蛋白引发的全身体液免疫应答的作用本试验的目的是确定rIL-12与QS-21对由病毒抗原(倾向于引发Th2辅助T细胞应答)引发的体液免疫应答的佐剂特性。为了实现该目的，研究了rIL-12对由与亚最佳剂量(0.8μg)QS-21共同配制的天然G蛋白引发的免疫应答的作用。在该试验中，用1μg天然G蛋白肌肉内引发未作过实验对象的雌性BALB/c小鼠(7-10周龄)。用免疫亲和层析从受A2菌株RSV感染的Vero细胞纯化该蛋白，且用SDS PAGE电泳估计其纯度高于95％。将该蛋白单用PBS制备、与亚最佳剂量(0.8μg)QS-21混合，或与亚最佳剂量(0.8μg)QS-21和10倍递增剂量的鼠rIL-12(0.01、0.1或1.0μgrIL-12)混合。用与最佳剂量(20.0μg)QS-21配制的3μgF或1μg G蛋白引发对照小鼠。
在初次疫苗接种后4周收集血清，以确定(通过ELISA)终点IgG抗体滴定度的几何平均数。用针对病毒A2菌株的噬斑减少中和试验评估血清中和抗体滴定度的几何平均值。确定无(-)和存在(+)作为补体(C)的5％豚鼠血清时的中和滴定度。将中和滴定度计算为每孔病灶数显示减少60％(相对于病毒对照)的血清稀释度的倒数。用JMP_统计软件(SAS Institute Inc.，Cary，NC)，通过Tukey-Kramer HSD多重比较试验，确定对数变换后的显著差异(P＜0.05)。对IgG的统计分析而言，将低于100的终点滴定度设值为50。
结果已广泛研究了RSV G蛋白，且显示它是BALB/c小鼠中Th2辅助T细胞应答的强诱导剂。由于rIL-12可以与亚最佳剂量(0.8μg)QS-21协同作用并提高由RSV F蛋白引发的Th1协助T细胞应答(表1和图1)，因此研究了引发Th2细胞应答的rIL-12对由抗原(G蛋白)引发的应答作用。已知QS-21不会减弱由G蛋白引发的Th2辅助T细胞应答的优势。在该试验中，分别用得到的血清抗G蛋白IgG1和IgG2a滴定度监测rIL-12对Th2和Th1辅助T细胞应答产生的作用。表2中的数据表明0.01μg rIL-12恢复亚最佳剂量(0.8μg)QS-21的佐剂特性并引发抗G蛋白的IgG1滴定度。评估与G/PBS相比的IgG1滴定度，且其与那些用最佳剂量(20.0μg)QS-21疫苗接种后引发的差异不明显。当rIL-12的剂量高于0.01μg时，在抗G蛋白的IgG1滴定度中没有观察到明显的差异。添加0.01-1.0μg rIL-12至G/QS-21(0.8μg)中不影响IgG2滴定度的产生。另外，在补体存在下测定的所有中和滴定度都是检测不到的，且低于log101.3。唯一的例外是用G蛋白和最佳剂量(20.0μg)QS-21接种的小鼠的血清(中和滴定度＝log101.7)。因此，这些数据表明rIL-12也能恢复亚最佳剂量(0.8μg)QS-21辅助针对抗原(倾向于引发Th2辅助T细胞应答)的应答的能力。
表2 rIL-2恢复亚最佳剂量QS-21在初次疫苗接种后4周的BALB/c小鼠中引发针对天然G蛋白的血清IgG1滴定度的辅助特性的能力抗-G蛋白血清滴定度(log10)_疫苗(μg)_rIL-12(μg)IgGIgG1IgG2aG/PBS 0.0 3.4±0.7 ＜2.02.6±0.9G/QS-21(0.8)0.0 3.3±0.5 2.3±0.8 2.1±0.9G/QS-21(0.8)0.01 3.2±0.9 2.8±0.7a1.9±0.5G/QS-21(0.8)0.1 2.8±1.2 2.1±0.9 2.3±0.9G/QS-21(0.8)1.0 3.5±0.8 2.5±0.7 2.5±0.9G/QS-21(20) 0.0 4.5±0.4 3.8±0.2b3.3±0.6G/QS-21(20) 1.0 3.5±0.3 2.4±0.7 2.7±0.6_用与0.8μg QS-21和递增剂量的鼠rIL-12(0.0-1.0μg/剂量)混合的1.0μgG蛋白引发BALB/c小鼠。用单用PBS配制的、与20.0μg QS-21混合的或20.0μgQS-21与1.0μg IL-12混合的G蛋白引发对照小鼠。
_用ELISA确定血清终点IgG滴定度的几何平均值(log10±标准偏差)。每组5只小鼠。
ap＞0.05与用G/QS-21(20.0μg)而无rIL-12引发的小鼠的IgG1抗体滴定度。
bp＜0.05与除用G/QS-21(0.8μg)与0.01μg rIL-12引发的那些小鼠以外所有小鼠的IgG1抗体滴定度。
实施例4rIL-12恢复与QS-21共同配制的RSV G蛋白引发BALB/c小鼠肺嗜曙红细胞增多的能力本试验的目的是确定由rIL-12和QS-21构成的佐剂会对天然G蛋白引发小鼠肺嗜曙红细胞增多(攻击后)的特性有影响。嗜曙红细胞增多取决于CD4+辅助Th2细胞和细胞因子、白细胞介素-5。在本试验中，用1μg天然G蛋白肌内引发未作过实验对象的雌性BALB/c小鼠(7-10周龄)。用免疫亲和层析从受RSV的A2菌株感染的Vero细胞纯化该蛋白，且用SDS PAGE估计其纯度高于95％。将该蛋白单用PBS制备、与亚最佳剂量(0.8μg/剂量)QS-21混合，或与亚最佳剂量(0.8μg/剂量)QS-21和10倍递增剂量的鼠rIL-12(0.01、0.1或1.0μgrIL-12)混合。用与最佳剂量(20.0μg)QS-21混合的3μgF或1μg G蛋白引发对照小鼠。
在初次接种后4周攻击小鼠。在可注射麻醉(氯胺酮和甲苯噻嗪)下进行鼻内攻击(0.05ml)。5天后进行支气管肺泡灌洗(BAL)。在用Diff-Quik(DadeInternational，Miami，FL)染色的载玻片上检验至少400个白细胞后，评估嗜曙红细胞的相对百分比。用JMP_统计软件(SAS Institute Inc.，Cary，NC)，通过Tukey-Kramer HSD多重比较试验，确定对数变换后的显著差异(P＜0.05)。
结果表3所示的结果表明用与递增剂量的rIL-12共同配制的G/QS-21(0.8μg)引发的对BALB/c小鼠的攻击后5天，肺嗜曙红细胞的平均百分比。数据表明rIL-12提高亚最佳剂量(0.8μg)QS-21的佐剂特性并促进G蛋白引发Th2辅助T细胞应答的天然趋势。随着添加到G/QS-21(0.8μg)的rIL-12的量的增加，肺嗜曙红细胞增多在统计学上增加至用与最佳剂量(20.0μg)QS-21共同配制的G蛋白疫苗接种后观察到的水平相等。因此，用G/QS-21(0.8μg)和1.0μg rIL-12引发的小鼠的肺嗜曙红细胞增多与用G/QS-21(20.0μg)引发的小鼠的水平相等(攻击后)。这些数据还表明1.0μgrIL-12不会减少由G/QS-21(20.0μg)产生的Th2辅助T细胞应答的优势。攻击后对肺嗜曙红细胞增多而言，用F/QS-21疫苗接种不会使BALB/c小鼠易感染。
表3 rIL-12对与亚最佳剂量的QS-21混合的G蛋白产生Th2辅助T细胞应答的能力的影响_疫苗(μg)rIL-12(μg)％嗜曙红细胞_G/PBS0.0 5G/QS-21(0.8) 0.0 2a
G/QS-21(0.8) 0.01 20G/QS-21(0.8) 0.120G/QS-21(0.8) 1.025bG/QS-21(20) 0.040G/QS-21(20) 1.040bG/QS-21(20) 0.02_用PBS制备的、与0.8或20μg QS-21混合的、或与0.8μg QS-21和10倍递增剂量的鼠rIL-12混合的1μg天然G蛋白引发BALB/c小鼠。用与QS-21混合的3μg F引发对照小鼠。4周后用RSV的A2菌株攻击小鼠。攻击后5天，在检验了至少400个白细胞后确定嗜曙红细胞的平均相对百分比。每组5只小鼠。
_这些数据为相对平均百分比嗜曙红细胞。对数转化后确定统计学差异。
ap＜0.05与用G/QS-21(0.8μg)和0.01-1.0μg IL-12和G/QS-21(20.0μg)引发的小鼠的嗜曙红细胞的百分比。p＞0.05与G/PBS和F/QS-21。
bp＞0.05与G/QS-21(20.0μg)无rIL-12。
实施例5rIL-12对与QS-21共同配制的非典型流感嗜血菌的重组非脂化的P4蛋白引发的全身体液免疫应答的影响本试验的目的是验证由rIL-12和QS-21构成的佐剂对细菌抗原产生的体液免疫应答的影响。为了实现此目的，研究了rIL-12对非典型流感嗜血菌的重组非脂化的P4(rP4)蛋白与QS-21混合时产生的免疫应答的影响。在该试验中，在第0周和第4周用10μgrP4蛋白皮下接种未作过实验对象的雌性BALB/c小鼠(7-10周龄)。该蛋白是单用PBS制备的、或与亚最佳剂量(0.8μg/剂量)QS-21混合的，或是与亚最佳剂量(0.8μg/剂量)QS-21和10倍递增剂量的鼠rIL-12(0.01、0.1或1.0μg rIL-12)混合的。用与最佳剂量(20.0μg)QS-21或磷酸铝(AlPO，100.0μg/剂量)无rIL-12配制的rP4蛋白免疫其它对照小鼠。分别在初次和第二次接种后的4和2周收集血清，以确定(用ELISA)终点IgG滴定度的几何平均值。用JMP_统计软件通过Tukey-Kramer HSD多重比较试验，确定对数变换后的显著差异(p＜0.05)。
结果表4所示的结果表明rIL-12可以和亚最佳剂量的QS-21一起作用，并增强由细菌抗原(非典型流感嗜血菌的rP4蛋白)产生的全身体液免疫应答。在第二次接种后2周，与用rP4/QS-21(0.8μg)而无rIL-12免疫相比，用rP4/QS-21(0.8μg/剂量)与0.01、0.1或1.0μg rIL-12免疫得到明显较高的血清抗rP4IgG2a滴定度。IgG2a滴定度还比用rP4/AlPO接种后产生的滴定度明显高。这些滴定度与用和最佳剂量(20.0μg)QS-21而无rIL-12混合的rP4蛋白引发的小鼠的滴定度没有明显差异。将1.0μg rIL-12添加到与亚最佳剂量QS-21混合的rP4蛋白中也明显增加IgG1的滴定度(与用rP4/PBS或rP4/AlPO接种的相比)。因此这些数据表明，对细菌和病毒抗原而言，rIL-12增强亚最佳剂量(0.8μg)的QS-21的佐剂特性。初次接种后4周，抗rP4 IgG滴定度没有统计学的显著差异。
表4 rIL-12对与亚最佳剂量的QS-21共配制的非典型流感嗜血菌的rP4蛋白引发BALB/c小鼠全身体液免疫应答的能力的影响抗-rP4 IgG滴定度_疫苗(μg)_rIL-12(μg)IgGIgG1IgG2arP4/PBS 0.0 6.1±0.0 5.9±0.14.7±0.4rP4/QS-21(0.8)0.0 6.4±0.0 6.3±0.15.0±0.3rP4/QS-21(0.8)0.01 6.6±0.1 6.4±0.35.9±0.1arP4/QS-21(0.8)0.1 6.7±0.2 6.2±0.26.2±0.3arP4/QS-21(0.8)1.0 7.0±0.1a6.5±0.2b6.2±0.2arP4/QS-21(20) 0.0 6.9±0.1 6.2±0.36.3±0.2arP4/AIPO1(100)0.0 6.1±0.2 6.0±0.24.6±0.3_用第二次接种后2周收集的血清进行ELISA，确定IgG抗体滴定度的几何平均值(log10±1标准偏差)。每组5只小鼠。
在第0周和第4周，用10.0μg rP4蛋白皮下接种BALB/c小鼠。用QS-21(0.8μg)和所示的递增量的重组rIL-12配制蛋白质。用以PBS制备的、与QS-21(20.0μg/剂量)或吸附到磷酸铝(AlPO，100μg/剂量)而无rIL-12制备的rP4注射对照小鼠。
ap＜0.05与rP4/PBS、rP4/AlPO和rP4/QS-21(0.8)而无rIL-12的IgG或IgG2a抗体总滴定度。
bp＜0.05与rP4/PBS和rP4/AlPO的IgG1抗体总滴定度。
实施例6rIL-12对与QS-21混合的非典型流感嗜血菌的重组脂化的P4蛋白产生的全身体液免疫应答的影响本试验的目的是确定包含rIL-12和QS-21的佐剂对由脂化的细菌抗原引发的体液免疫应答的影响。为了实现此目的，测试了rIL-12和QS-21对由非典型流感嗜血菌的重组脂化的P4(rLP4)蛋白引发的体液免疫应答的影响。在本试验中，在第0周和第4周用5μg rLP4肌肉内接种未作过实验对象的雌性BALB/c小鼠(8-10周龄)。单用PBS制备蛋白质、将其与5倍递增剂量(0.8-20.0μg)的QS-21混合、或与10倍递增剂量的鼠rIL-12(0.01、0.1或1.0μgrIL-12)混合，或与所示的QS-21和rIL-12的组合混合。分别在第一次和第二次接种后的第4和2周收集血清，以确定(用ELISA)终点IgG滴定度的几何平均值。用JMP_统计软件通过Tukey-Kramer HSD多重比较试验，确定对数变换后的显著差异(p＜0.05)。
结果表5和6分别显示了在第一次和第二次接种后的第4和第2周抗-rLP4 IgG滴定度。结果表明单独的QS-21或rIL-12都是增强产生针对rLP4的体液免疫应答的优良佐剂。这可由增加的抗rLP4 IgG2a滴定度看出。例如，与单用PBS制备的rLP4注射的小鼠的血清相比(表5)，免疫后4周，用rLP4/rIL-12(0.01μg)或rLP4/rIL-12(1.0μg)引发的小鼠的滴定度分别增加10和100倍。同样，rLP4/QS-21(4.0μg)或rLP4/QS-21(20.0μg)引发的小鼠的IgG2a滴定度增强100倍(表5)。第二次接种后2周观察到类似的结果(表6)。然而，对于脂化的细菌抗原而言，将亚最佳剂量的rIL-12和QS-21组合使用时似乎没有任何协同作用。
表5用与QS-21和IL-12_共同配制的rLP4蛋白初次免疫后的4周BALB/c小鼠的血清IgG滴定度抗原 佐剂(μg)抗rLP4蛋白(Log10)aIgG1IgG2arLP4 QS-21(20) 4.9±0.55.0±0.3rLP4 QS-21(20)+rIL-12(0.01) 4.1±0.45.1±0.4rLP4 QS-21(20)+rIL-12(0.1) 4.3±0.35.8±0.6rLP4 QS-21(20)+rIL-12(1.0) 4.2±0.95.0±1.5rLP4 QS-12(4)5.3±0.44.7±0.5rLP4 QS-21(4)+IL-12(0.01)5.1±0.44.7±0.5rLP4 QS-21(4)+IL-12(0.1) 4.5±0.55.0±0.5rLP4 QS-21(4)+IL-12(1.0) 4.8±0.55.5±1.1rLP4 QS-21(0.8) 3.3±0.62.4±0.8rLP4 QS-21(0.8)+rIL-12(0.01) 3.7±0.72.7±0.7rLP4 QS-21(0.8)+rIL-12(0.1) 3.8±0.52.9±0.3rLP4 QS-21(0.8)+rIL-12(1.0) 3.6±0.33.8±0.7rLP4 没有3.6±0.42.1±0.4rLP4 rIL-12(0.01)3.7±0.93.1±0.4rLP4 rIL-12(0.1) 4.0±0.43.2±0.3rLP4 rIL-12(1.0) 4.3±0.14.0±0.7_用单用PBS制备的、与所示剂量(0.8-20.0μg)QS-21、10倍递增剂量的鼠rIL-12(0.01、0.1、或1.0μg rIL-12/)混合的、或QS-21和rIL-12组合混合的5μg rLP4蛋白肌肉内引发的BALB/c小鼠。
a这些数值为终点抗体滴定度的几何平均值±标准偏差。每组5只小鼠。
表6用与QS-21和IL-12_共同配制的rLP4蛋白第二次接种后2周BALB/c小鼠的血清IgG滴定度抗原 佐剂(μg)抗rLP4 IgG滴定度(Log10)aIgG1IgG2arLP4 QS-21(20)6.8±0.4 7.0±0.3rLP4 QS-21(20)+rIL-12(0.01) 6.6±0.4 7.3±0.4rLP4 QS-21(20)+rIL-12(0.1)6.6±0.4 7.2±0.5rLP4 QS-21(20)+rIL-12(1.0)6.3±0.3 7.2±0.3rLP4 QS-12(4) 6.2±0.5 6.6±0.5rLP4 QS-21(4)+IL-12(0.01) 5.5±0.1 6.2±0.5rLP4 QS-21(4)+IL-12(0.1) 5.8±0.3 6.3±0.2rLP4 QS-21(4)+IL-12(1.0) 5.9±0.3 7.4±0.5rLP4 QS-21(0.8) 5.6±0.5 4.5±0.6rLP4 QS-21(0.8)+rIL-12(0.01) 5.3±1.0 4.3±0.5rLP4 QS-21(0.8)+rIL-12(0.1) 5.2±0.2 4.8±0.8rLP4 QS-21(0.8)+rIL-12(1.0) 5.4±0.3 6.0±0.7rLP4 没有 5.5±0.3 4.4±0.5rLP4 rIL-12(0.01) 4.6±0.6 4.0±0.4rLP4 rIL-12(0.1) 5.0±0.3 4.3±1.0rLP4 rIL-12(1.0) 5.3±0.6 5.9±0.9_在第0周和4周用5μg rLP4蛋白肌肉内接种BALB/c小鼠。该蛋白是单用PBS制备的、与所示剂量(0.8-20.0μg)的QS-21、10倍递增剂量的鼠rIL-12(0.01、0.1、或1.0μg rIL-12/)混合的、或QS-21和rIL-12组合混合的。
a这些数值为终点抗体滴定度的几何平均值±标准偏差。每组5只小鼠。
已参考本发明的优选实施例具体说明和描述了本发明，但本领域技术人员应理解在不脱离本文所附的权利要求涵盖的本发明的范围内还可对本发明的形式和细节进行各种改变。
权利要求
1.一种包含有效量的QS-21和IL-12的佐剂组合物，其特征在于，所述的组合物包含低于约1μg 3-O-脱酰基化的单磷酸脂A。
2.如权利要求1所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的组合物包含低于约0.5μg 3-O-脱酰基化的单磷酸脂A。
3.如权利要求1所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的组合物包含低于约0.0001μg 3-O-脱酰基化的单磷酸脂A。
4.如权利要求1所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的组合物还包含生理上可接受的载体。
5.如权利要求3所述的佐剂组合物，其特征在于，当施用于脊椎动物时，所述的IL-12的存在量基本不是反应原性的。
6.如权利要求1-5任一所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的QS-21和IL-12产生协同的佐剂作用。
7.如权利要求1-5任一所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的IL-12是重组人IL-12。
8.如权利要求1-5任一所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的IL-12的存在量为约0.01ng到约50μg。
9.如权利要求1-5任一所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的QS-21的存在量为约0.01ng到约50μg。
10.一种包含有效量QS-21和IL-12的佐剂组合物，其特征在于，所述的组合物基本不含3-O-脱酰基化的单磷酸脂A。
11.如权利要求10所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的组合物还包含生理上可接受的载体。
12.如权利要求10所述的佐剂组合物，其特征在于，当施用于脊椎动物时，所述的IL-12的存在量基本不是反应原性的。
13.如权利要求10-12任一所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的QS-21和IL-12产生协同的佐剂作用。
14.如权利要求10-12任一所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的IL-12是重组人IL-12。
15.如权利要求10-12任一所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的IL-12的存在量为约0.01ng到约50μg。
16.如权利要求10-12任一所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的QS-21的存在量为约0.01ng到约50μg。
17.一种包含有效量的QS-21和IL-12的佐剂组合物，其特征在于，所述的组合物包含低于约0.05μg IL-12。
18.如权利要求17所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的组合物还包含生理上可接受的载体。
19.如权利要求17所述的佐剂组合物，其特征在于，当施用于脊椎动物时，所述的IL-12的存在量基本不是反应原性的。
20.如权利要求17-19任一所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的QS-21和IL-12产生协同的佐剂作用。
21.如权利要求17-19任一所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的IL-12是重组人IL-12。
22.如权利要求17-19任一所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的IL-12的存在量为约0.01ng到约50μg。
23.如权利要求17-19任一所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的QS-21的存在量为约0.01ng到约50μg。
24.一种基本由有效量的QS-21和IL-12构成的佐剂组合物。
25.一种包含至少一种抗原和佐剂组合物的免疫原性组合物，其中佐剂组合物包含有效量的QS-21和IL-12，其特征在于，所述的佐剂组合物包含低于约1μg3-O-脱酰基化的单磷酸脂A。
26.如权利要求25所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述的佐剂组合物包含低于约0.5μg 3-O-脱酰基化的单磷酸脂A。
27.如权利要求26所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述的佐剂组合物包含低于约0.0001μg 3-O-脱酰基化的单磷酸脂A。
28.如权利要求27所述的免疫原性组合物，其特征在于，当施用于脊椎动物时，所述的IL-12的存在量基本不是反应原性的。
29.一种包含至少一种抗原和佐剂组合物的免疫原性组合物，所述的佐剂组合物包含有效量的QS-21和IL-12，其特征在于，所述的佐剂组合物基本不含3-O-脱酰基化的单磷酸脂A。
30.如权利要求29所述的免疫原性组合物，其特征在于，当施用于脊椎动物时，所述的IL-12的存在量基本不是反应原性的。
31.一种包含至少一种抗原和佐剂组合物的免疫原性组合物，所述的佐剂组合物包含有效量的QS-21和IL-12，其特征在于，所述的组合物包含低于约0.05μgIL-12。
32.如权利要求31所述的免疫原性组合物，其特征在于，当施用于脊椎动物时，所述的IL-12的存在量基本不是反应原性的。
33.如权利要求25-32任一所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述的QS-21和IL-12产生协同的佐剂作用。
34.如权利要求25-32任一所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述的IL-12是重组人IL-12。
35.如权利要求25-30任一所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述的IL-12的存在量为约0.01ng到约50μg。
36.如权利要求31-32任一所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述的IL-12的存在量为约0.01ng到约0.05μg。
37.如权利要求25-32任一所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述的QS-21的存在量为约0.01ng到约50μg。
38.如权利要求25-32任一所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述的抗原是细菌抗原。
39.如权利要求38所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述的抗原是非典型流感嗜血菌的P4蛋白或其功能性片段。
40.如权利要求25-32任一所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述的抗原是病毒抗原。
41.如权利要求40所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述的抗原是呼吸道合胞病毒F蛋白或其功能性片段。
42.如权利要求25-32任一所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述的组合物还包含任选的生理上可接受的载体。
43.一种包含至少一种抗原和佐剂组合物的免疫原性组合物，其中所述的佐剂组合物基本由有效量的QS-21和IL-12构成。
44.一种引发针对抗原的免疫应答的方法，所述的方法包括向脊椎动物施用免疫有效量的含至少一种抗原和佐剂组合物的组合物，所述的佐剂组合物包含有效量的QS-21和IL-12，其特征在于，所述的组合物包含低于约1μg 3-O-脱酰基化的单磷酸酯A，从而在脊椎动物中引发针对抗原的免疫应答。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述方法中使用的组合物包含低于约0.5μg 3-O-脱酰基化的单磷酸脂A，从而在脊椎动物中引发针对抗原的免疫应答。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述方法中使用的组合物包含低于约0.0001μg 3-O-脱酰基化的单磷酸脂A，从而在脊椎动物中引发针对抗原的免疫应答。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述的IL-12的存在量在脊椎动物中基本不是反应原性的。
48.一种引发针对抗原的免疫应答的方法，所述的方法包括向脊椎动物施用免疫有效量的含至少一种抗原和佐剂组合物的组合物，所述的佐剂组合物包含有效量的QS-21和IL-12，其特征在于，所述的组合物基本不含3-O-脱酰基化的单磷酸酯A，从而在脊椎动物中引发针对抗原的免疫应答。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述的IL-12的存在量在脊椎动物中基本不是反应原性的。
50.一种引发针对抗原的免疫应答的方法，所述的方法包括向脊椎动物施用免疫有效量的含至少一种抗原和佐剂组合物的组合物，所述的佐剂组合物包含有效量的QS-21和IL-12，其特征在于，所述的组合物包含低于约0.05μg IL-12，从而在脊椎动物中引发针对抗原的免疫应答。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述的IL-12的存在量在脊椎动物中基本不是反应原性的。
52.如权利要求48-51任一所述的方法，其特征在于，所述的QS-21和IL-12产生协同佐剂的作用。
53.如权利要求48-51任一所述的方法，其特征在于，所述的IL-12是重组人IL-12。
54.如权利要求48或49所述的方法，其特征在于，所述的IL-12的存在量为约0.01ng到约50μg。
55.如权利要求50或51所述的方法，其特征在于，所述的IL-12的存在量为约0.01ng到约0.05μg。
56.如权利要求48-51任一所述的方法，其特征在于，所述的QS-21的存在量为约0.01ng到约50μg。
57.如权利要求48-51任一所述的方法，其特征在于，所述的抗原是细菌抗原。
58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述的抗原是非典型流感嗜血菌的P4蛋白或其功能性片段。
59.如权利要求48-51任一所述的方法，其特征在于，所述的抗原是病毒抗原。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述的抗原是呼吸道合胞病毒F蛋白或其功能性片段。
61.一种引发针对抗原的免疫应答的方法，所述的方法包括向脊椎动物施用免疫有效量的含至少一种抗原和佐剂组合物的组合物，所述的佐剂组合物基本由有效量的QS-21和IL-12构成，从而在脊椎动物中引发针对抗原的免疫应答。
全文摘要
本发明公开了一种包含有效量IL－12和QS－21的佐剂组合物。本发明还公开了包含抗原和佐剂组合物的混合物的免疫原性的疫苗和药物组合物，其中佐剂组合物包含有效量的IL－12和QS－21。这些组合物针对至少一种抗原引发功能性细胞介导的免疫应答和体液免疫应答。还公开了采用公开的组合物的方法。
文档编号A61P37/04GK1437481SQ01811650
公开日2003年8月20日 申请日期2001年6月21日 优先权日2000年6月22日
发明者G·E·汉考克 申请人:美国氰胺公司