专利名称：具有佐剂作用的细菌膜组分的制作方法
技术领域：
本发明涉及革兰氏阴性细菌尤其是肺炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)的膜组分联合抗原或半抗原，在制备旨在将免疫应答引向Th1型和/或混合的Th1/Th2型应答的药物组合物中的用途，其中所述免疫应答对抗所述抗原或半抗原。此外，本发明包括用于制备所述膜组分和含有所述膜组分的药物组合物的方法，以及它们在预防和治疗感染性疾病(尤其是RSV等副粘病毒造成的感染)和癌症(尤其是那些其肿瘤与肿瘤抗原相关的癌症)中的用途。
接种疫苗是一种预防或降低尤其是感染的有效手段。接种运动在该领域的成功使疫苗的概念可以延伸到自身免疫病、癌症和生殖领域。另一方面，单独接种抗原并不总是能够引起快速而持久的抗体应答，这就需要佐剂，即帮助(来自拉丁文adjuvare帮助)这些抗原诱导该应答的化合物的存在。
佐剂构成一组结构和来源均不同的化合物。因此，在该范畴中有尤其是油包水型(弗氏不完全佐剂)或水包油型乳剂、细菌来源的化合物例如来自革兰氏阴性细菌的脂多糖衍生物、和铝盐。目前，仅铝盐被作为佐剂在疫苗制品中应用于人。
对抗抗原的抗体应答的发生需要一系列的复杂事件。它涉及呈递该抗原的细胞、调节性T淋巴细胞(Th，即T“辅助细胞”)、和产生抗体的B淋巴细胞。两种类型的Th淋巴细胞可以根据它们产生的细胞因子类型来区分1型Th淋巴细胞在小鼠中产生IFN-γ和IL-2，并促进IgG2a的形成，而2型Th淋巴细胞在小鼠中产生II-4、IL-5和IL-10，并引起IgG1的形成(Mosman，T.R.和Sad S.当代免疫学(Immunol.Today)1996，17138)。而且，已经显示，对于相同的给定抗原，正是佐剂在抗体应答期间造成了占优势的同种型(Toellner K.-M.等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1998，1871193)。因此，已知铝盐例如铝胶在小鼠中诱导基本上是Th2型的应答，并促进IgGl或甚至是IgE的形成(Allison A.C.疫苗设计-细胞因子网络的角色(Vaccine design-The role of cytokine networks)第293卷，1-9，Plenum Press，1997)，这会给有过敏性体质的患者造成问题。而且，根据所设想的治疗目标，可能期望Th1或混合(Th1/Th2)型应答。
因此，目前需要获得能够诱导Th1或混合(Th1/Th2)型免疫应答，优选其中Th1应答接近或高于Th2应答的混合Th1/Th2型应答的新佐剂。
令人惊奇的是，本发明的作者阐明了革兰氏阴性细菌肺炎克氏杆菌的膜组分(又称FMKp)，尤其是按以下实例中所描述的方法获得的膜组分的特殊性质。事实上，作者发现，所述膜组分FMKp联合抗原不仅能够增强对抗所述抗原的抗体应答，而且能够将细胞因子应答重新引向Th1/Th2型分布，因此与所寻求的特殊佐剂活性相符，而且这与所述膜组分的施用方式并不相关。
因此，本发明的主题是革兰氏阴性细菌尤其是肺炎克氏杆菌的膜组分联合抗原或半抗原，在将免疫应答引向对抗所述抗原或半抗原的Th1型和/或混合的Th1/Th2型应答中的用途，或在制备旨在将免疫应答引向对抗所述抗原或半抗原的Th1型和/或混合的Th1/Th2型应答的药物组合物中的用途。
关于将免疫应答引向Th1和/或混合Th1/Th2型应答的问题，优选尤其是相对于用明矾佐剂获得的Th1/Th2应答而言引向促进诱导Th1应答的免疫应答。
关于将免疫应答引向Th1和/或混合Th1/Th2型应答的问题，尤其更优选引向对抗相关抗原的IgG2a抗体的效价相对于用明矾佐剂获得的IgG2a效价增加了至少10倍、优选至少25倍、50倍和100倍的免疫应答。
以一种尤其优选的方式，该免疫应答被引向其中Th1应答接近或高于Th2应答的Th1和/或混合Th1/Th2型应答。词语“接近”应理解为是指，当以对抗相关抗原的IgG2a抗体的效价表示时，应答是对抗所述抗原的IgG1抗体效价的至少0.5倍，优选至少0.75倍，而且对抗该相关抗原的IgG抗体效价接近或高于用明矾或弗氏佐剂获得的对抗该相关抗原的IgG抗体效价。
本发明还涉及根据本发明的用途，其特征在于该膜组分含有至少两种不同细菌菌株的膜组分。
词语细菌的膜组分在本发明中应理解为是指从所述细菌的培养物获得的并且其制备方法至少包含了如下步骤的任何纯化或部分纯化的膜组分或提取物，该步骤是裂解培养后获得的该细菌，并通过尤其是离心或过滤，从该裂解步骤后获得的总裂解物中分离含有所述细菌的膜的组分。
在本发明中，当所述细菌是肺炎克氏杆菌时，词语“细菌膜组分”还应理解为是指具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的P40蛋白，即肺炎克氏杆菌膜组分中的一种活性组分，或其片段之一。
根据本发明，这些膜组分可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如Haeuw J.F等(欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)255，446-454，1998)所描述的方法。
根据一个具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的用途，其特征在于该膜组分是通过包含以下步骤的方法制备的a)在允许所述细菌生长的培养基中对所述细菌进行培养，之后离心所述培养物；b)如果适当的话，失活步骤a)获得的细菌沉淀中的分解酶，之后离心获得的悬浮物；c)通过在抽提溶液中对步骤a)或b)中获得的沉淀进行至少一个循环的洗涤，从该沉淀中抽提和除去非膜蛋白质和核酸；d)在存在蛋白水解酶的情况下消化步骤c)中获得的膜沉淀，之后离心；e)在生理盐水和/或蒸馏水中对步骤d)中获得的沉淀进行至少一个循环的洗涤；和f)超声处理步骤e)中获得的沉淀。
步骤b)，对步骤a)获得的细菌沉淀中的分解酶的失活，可以通过任何已知的酶失活方法来实现，例如尤其是通过将该重新悬浮的细菌沉淀加热至优选近100℃的温度，或通过加入这些酶的活性的抑制剂来实现。
步骤c)，从步骤a)或b)获得的沉淀中抽提并除去非膜蛋白质和核酸，可以通过例如在抽提溶液中对该沉淀进行至少一个如下循环的洗涤来实现，即加入高渗溶液(抽提溶液)，优选摩尔浓度接近1M的盐溶液，在足以达到期望效果的接触期之后，离心获得的悬浮物，并除去在所述离心后获得的上清液，可以重复几次该洗涤循环。
步骤d)，消化步骤c)中获得的膜沉淀，可以在存在蛋白水解酶例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或任何已知的具有蛋白水解活性的酶的溶液时进行，其中反应条件、溶液的pH、反应温度和持续时间均优选调节至对于所选酶而言最佳的条件，并在反应后进行离心，该消化循环可以采用相同的酶、相同的酶组合、或针对进行的每个消化循环而言采用不同的酶重复几次。
步骤e)，洗涤步骤d)中获得的沉淀，是通过将该沉淀放入生理盐水或蒸馏水中，在足够的接触期后进行离心来实现的，可以将该洗涤循环重复几次。
最后步骤f)，沉淀的超声处理，旨在尤其是分解和匀浆步骤e)结束时获得的膜组分。该超声条件(持续时间和强度)将由本领域技术人员，根据例如待处理的膜组分的量来确定。
根据另一个具体实施方案，本发明涉及根据本发明的用途，其特征在于该膜组分是通过包含以下步骤的方法制备的a)在允许所述细菌生长的培养基中对所述细菌进行培养，之后，如果适当的话，进行离心；b)冷冻步骤a)获得的该培养基或沉淀，之后融化并干燥细胞；c)利用DNase从重新悬浮起来的步骤b)获得的该干燥细胞中除去核酸；d)研磨步骤c)获得的细胞，然后澄清获得的悬浮物；e)在酸性介质中沉淀步骤d)获得的悬浮物，并除去沉淀；f)中和步骤e)获得的含有膜悬浮物的上清液，之后透析并浓缩该膜悬浮物；和
g)对步骤f)获得的浓缩膜悬浮物进行灭菌。
该方法步骤b)中的融化条件当然应由本领域技术人员根据待处理的沉淀的初始量来确定，优选对于1kg干细胞的等同物在4℃进行至少48个小时。
步骤c)中，核酸的去除通过例如向浓度等同于5％干细胞的细胞悬浮物中加入DNase至终浓度5mg/ml来实现。
对步骤c)获得的细胞的研磨可以利用本领域技术人员已知的用于研磨细胞的任何系统或装置，例如压机或优选例如在Manton Gaulinet loop中研磨30分钟，来进行。
研磨后获得的悬浮物的澄清可以利用本领域技术人员已知的用于澄清细菌细胞研磨产物的任何系统或装置，例如Sharpless系统来进行。
步骤e)，在酸性介质中沉淀步骤d)获得的悬浮物，可以用例如乙酸来实现。该沉淀之后通过Sharpless类系统除去沉淀，并回收上清液。
步骤f)包括对在酸性介质中沉淀后获得的上清液进行中和、稀释、透析和浓缩。
最后，最后步骤包括通过例如于121℃加热约35分钟，对前面步骤获得的膜组分浓缩物灭菌。
本发明尤其是涉及根据本发明的用途，其特征在于该膜组分是具有SEQ ID NO.2序列的肺炎克氏杆菌P40蛋白，或其一个片段。
词语“P40蛋白片段”应理解为尤其是指具有能够增加非特异性免疫应答和/或能够诱导抗肿瘤免疫应答的P40蛋白氨基酸序列中所包含的氨基酸序列的任一个片段，且所述片段含有至少5个氨基酸、优选至少10个氨基酸、更优选至少15个氨基酸。
当然，所述P40蛋白，或其片段，可以通过化学合成或以重组肽的形式获得。
本发明尤其涉及根据本发明的用途，其特征在于所述抗原或半抗原选自感染剂例如病毒、细菌、真菌或寄生虫所特异的抗原或半抗原，或与肿瘤细胞相关的抗原。
根据本发明，所述抗原或半抗原优选选自肽、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂质、或任何能够特异将免疫应答指向对抗感染剂所特异的抗原或半抗原的或对抗肿瘤细胞相关抗原的Th1型和/或混合的Th1/Th2型应答的化合物。
当然，当所述抗原或半抗原的性质是多肽时，可以通过化学合成或重组合成来获得。
现在，制备重组肽的方法是本领域技术人员所熟知的，因此不在本发明说明书中作详细描述。在可以用于产生这些重组肽的细胞中，当然可以提及细菌细胞(Olins P.O.和Lee S.C.，1993，大肠杆菌中异源基因表达的最新进展(Recent advances in heterologous gene expression in E.coli)，Curr.Op.Biotechnology 4520-525)，和酵母细胞(Buckholz R.G.，1993，用于异源基因产物表达的酵母系统(Yeast Systems for theExpression of Heterologous Gene Products)，Curr.Op.Biotechnology4538-542)，以及动物细胞，尤其是哺乳动物细胞培养物(Edwards C.P.和Aruffo A.，1993，基于COS细胞的瞬时表达系统的当前应用(Currentapplications of COS cell based transient expression systems)，Curr.Op.Biotechnology 4558-563)，和其中可以采用涉及例如杆状病毒的方法的昆虫细胞(Luckow V.A.，1993，用于人类基因产物表达的杆状病毒系统(Baculovirus systems for the expression of human geneproducts)，Curr.Op.Biotechnology 4564-572)。
此外，本发明还包含根据本发明的用途，其特征在于所述抗原或半抗原与所述膜组分偶联或混合，尤其是与该膜组分中所包含的至少一种化合物共价偶联。
在一个优选的实施方案中，本发明包含根据本发明的用途，其特征在于所述抗原或半抗原与支持肽(supporting peptide)共价偶联，形成能够与哺乳动物血清白蛋白特异结合的复合物，优选地所述支持肽是来源于链球菌G蛋白的肽片段，尤其是称作BB的C端片段。
当然，所述复合物可以通过遗传重组制备。
可以利用重组DNA技术通过将编码蛋白质性质的所述抗原或半抗原的序列插入或添加在编码所述链球菌G蛋白肽片段的DNA序列上，制备所述嵌合或杂合复合物。
用于合成杂合分子的方法包括在遗传工程中用于构建编码期望多肽序列的杂合多核苷酸的方法。可以有利地参考例如D.V.Goeddel等(基因表达技术(Gene expression technology)，酶学方法(Methods inEnzymology)，第185卷，3-187，1990)所描述的用于制备编码融合蛋白的基因的技术。
根据本发明，该共价偶联可以通过化学合成实现。在本发明的一个具体实施方案中，可以将一或多个连接元件引入该膜组分所包含的至少一种化合物中和/或引入所述抗原或半抗原中，以利于该化学偶联。
优选地，引入的所述连接元件是氨基酸。
根据本发明，可以引入一或多个连接元件，尤其是氨基酸，以便于该膜组分的化合物与所述抗原或半抗原之间的偶联反应。根据本发明所述该膜组分的化合物与所述抗原或半抗原之间的共价偶联可以发生在该膜组分的化合物的N-或C-末端或所述抗原或半抗原的N-或C-末端，如果后者的性质是例如肽的话。允许该偶联的双功能试剂将根据选择用于该偶联的末端，和待偶联的所述抗原或半抗原的性质来决定。
本发明还包含根据本发明的用途，其特征在于当抗原、半抗原或复合物和膜化合物的性质是肽时，所述抗原、半抗原或复合物与膜组分所包含的至少一种化合物之间的偶联是通过遗传重组实现的。
实际上确实可以通过遗传重组实现所述抗原、半抗原或复合物与膜组分所包含的至少一种化合物之间的偶联。例如，可以在提取所述革兰氏阴性细菌的膜组分之前，预先用含有编码目的抗原或所述复合物的核酸结构的载体转化该细菌，以便由此转化的该细菌表达与所述细菌的膜结合或锚定在其中的该目的抗原或所述复合物。用于表达与膜结合的重组蛋白质的方法是熟知的，并且需要例如存在特异的调节序列，例如信号肽类序列。
本发明的主题还是根据本发明的用途，其特征在于该药物组合物还含有使得可以以能增加其稳定性和/或其免疫原性的形式运载与所述抗原、半抗原或复合物相联的所述膜组分的药剂，这些形式例如水包油或油包水型乳剂的形式，脂质体、微球体或纳球体(nanosphere)类颗粒的形式，或允许与所述抗原、半抗原或复合物相联的所述膜组分以颗粒形式封装和呈递的任何类型结构。
本发明还涉及根据本发明的用途，其特征在于所述药剂选自铝盐，钙盐，植物来源的化合物例如Quil A或皂苷，或细菌来源的化合物例如霍乱、百日咳或破伤风类毒素的衍生物，或大肠杆菌热不稳定性毒素的衍生物。
本发明还包括根据本发明的用途，其特征在于该药物组合物还含有可以调节所述膜组分联合所述抗原、半抗原或复合物诱导的免疫应答的药剂。
在所述调节药剂中，尤其优选细胞因子、生长因子、激素、或细胞成分例如核酸、热休克蛋白家族中的蛋白质或核糖体。
本发明的主题还有在制备旨在预防或治疗病毒、细菌、真菌或寄生虫来源的感染性疾病，或旨在预防或治疗癌症(尤其是其中肿瘤与肿瘤抗原相关的癌症)的药物组合物中的根据本发明的用途。
在所述病毒来源的感染性疾病中，尤其优选由副粘病毒，尤其是由副流感病毒，更优选由呼吸道合胞病毒(RSV)引起的感染性疾病。
在一个具体的实施方案中，根据本发明的用途的特征在于与该膜组分相联的所述抗原含有G2Na肽，即具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的病毒G蛋白片段；与序列SEQ ID NO.4比对后其序列表现出至少80％、优选至少90％、95％和99％一致性的G2Na的同源肽；或与链球菌G蛋白的C端片段(BB)，即描述于Power等的文献(1997，病毒学(Virology)230，155-166)和WO 96/14416中的肽BB，共价偶联形成能够与哺乳动物血清白蛋白结合的复合物的G2Na肽或其同系物之一。
为了本发明的目的，词语两个核酸或氨基酸序列之间的“一致性百分数、程度或水平”应理解为是指在最佳比对后获得的待比较的两个序列之间一致的核苷酸或氨基酸残基的百分数，该百分数是纯粹的统计学结果，而且这两个序列之间的差异随机地分布在它们的全长范围内。传统上两个核酸或氨基酸序列之间的序列比较是在以最佳方式比对这些序列之后通过比较这些序列进行的，而所述比较是通过片段或“比较窗”鉴定和比较局部区域的序列相似性来进行的。用于比较的最佳序列比对可以通过手工完成，或利用Smith和Waterman(1981)(Ad.App.Math.2482)的局部同源性算法、Neddleman和Wunsch(1970)(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48443)的局部同源性算法、Pearson和Lipman(1988)(美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)852444)的相似性搜索方法、或应用这些算法的计算机软件(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin遗传学软件包，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.，Madison，WI；或比较软件包BLAST N或BLAST P)来完成。
两个核酸或氨基酸序列之间的一致性百分数通过计数比较窗中最佳比对的这两个序列来确定，对于这两个序列之间的最佳比对而言，在所述比较窗中待比较的核酸或氨基酸序列区域相对于参考序列可以含有添加或缺失。该一致性百分数通过以下方式计算确定这两个序列之间核苷酸或氨基酸残基一致的一致位置的数目，用该一致位置数目除以比较窗中位置的总数，然后将所获结果乘以100，以获得这两个序列之间的一致性百分数。
例如，可以采用在网址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html上可获得的BLAST程序，“BLAST 2序列”，和给出的默认参数(尤其是参数“开始空缺罚分”5，和“延伸空缺罚分”2；所选模板是例如由该程序提议的模板“BLOSUM 62”)，然后通过该程序直接计算待比较的两个序列之间的一致性百分数。
另一方面，本发明涉及制备革兰氏阴性细菌，尤其是肺炎克氏杆菌的膜组分的方法，其特征在于该方法含有以下步骤a)在允许所述细菌生长的培养基中对所述细菌进行培养，然后离心所述培养物；b)如果适当的话，失活步骤a)获得的细菌沉淀中的分解酶，之后离心获得的悬浮物；c)通过在抽提溶液中对步骤a)或b)获得的沉淀进行至少一个循环的洗涤，从该沉淀中抽提并除去非膜蛋白质和核酸；
d)在存在蛋白酶时消化步骤c)获得的膜沉淀，然后离心；e)在生理盐水和/或蒸馏水中对步骤d)获得的沉淀进行至少一个循环的洗涤；和f)超声处理步骤e)获得的沉淀。
本发明还包括制备革兰氏阴性细菌，尤其是肺炎克氏杆菌的膜组分的方法，其特征在于它含有如下步骤a)在允许所述细菌生长的培养基中对所述细菌进行培养，之后，如果适当的话，进行离心；b)冷冻步骤a)获得的该培养基或沉淀，之后融化并干燥这些细胞；c)利用DNase从重新悬浮起来的步骤b)获得的干燥细胞中除去核酸；d)研磨步骤c)获得的细胞，然后澄清获得的悬浮物；e)在酸性介质中沉淀步骤d)获得的悬浮物，并除去沉淀；f)中和步骤e)获得的含有膜悬浮物的上清液，之后透析并浓缩该膜悬浮物；和g)对步骤f)获得的浓缩膜悬浮物进行灭菌。
能够通过所述这些方法获得的膜组分事实上构成了本发明的一部分。
当用半乳糖总含量和蛋白质总含量表示时，能够通过所述方法获得的膜组分的蛋白聚糖含量，即活性成分FMKp的含量，优选在如下数值之间-对于半乳糖1.2g/l-3.4g/l；-对于蛋白质7.5g/l-14.9g/l。
更优选地，该含量为-对于半乳糖1.6g/l-2.6g/l；-对于蛋白质9.3g/l-11.7g/l。
此外，本发明还涉及含有通过根据本发明的这些方法能够获得的膜组分的药物组合物，优选地，所述药物组合物还含有与所述膜组分相联的上文所定义的抗原、半抗原或复合物，例如尤其是副粘病毒特异的病毒抗原或复合物，或与肿瘤细胞相关的抗原。
当然，根据本发明的所述药物组合物可以还含有诸如上面所定义的载体和调节剂等药剂。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的药物组合物的特征在于与该膜组分相联的所述抗原包括具有序列SEQ ID NO.4的呼吸道合胞病毒G2Na肽、上面所定义的它的同系物之一、与链球菌G蛋白C端片段(BB)共价偶联形成能够结合哺乳动物血清白蛋白的复合物的所述G2Na肽或其同系物之一。
以下
和实施例旨在举例说明本发明，而不是以任何方式限制其范围。
图1FMKp辅助的BBG2Na-剂量-反应研究(血清抗G2Na IgG效价)。
*p＜0.05(与PBS组比较)。
图2FMKp辅助的BBG2Na-抗G2Na的IgG1和IgG2a的效价。
图3FMKp辅助的BBG2Na-保护研究。
图4FMKp对Immugrip(流感疫苗)的佐剂作用。
*p＜0.05在样品收集的同一天与未有佐剂的组(“0”)进行比较。
实施例1肺炎克氏杆菌膜组分(FMKp)的制备方法1优选在从离心沉淀中抽提肺炎克氏杆菌I145的膜之前加上如下步骤在任选地重新溶解在溶液中之后，例如通过100℃加热沉淀，破坏沉淀中获得的细胞成分的分解酶。
从该离心沉淀中将膜实际提取出来优选通过以下方式来进行在任选破坏分解酶后，用盐水溶液例如1M氯化钠处理沉淀的细胞成分一或多次，之后优选以20,000g离心获得的悬浮物，从该离心获得的上清液含有蛋白质和核酸等非膜杂质，将其除去，而沉淀含有所述膜。
与含有这些杂质的盐溶液分离后，在有蛋白水解酶，优选胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶时，于pH8的溶液中37℃消化该膜4小时。
消化后，通过超声匀浆该溶液。由此获得的产物构成称作FMKp的膜组分。
获得的上清再次在相同条件下，优选在140,000g离心。制备膜糖肽通过40,000g离心20分钟，从所获得的沉淀中制备该组分。将所述沉淀重新悬浮在生理盐水中，然后在沸水浴上100℃加热该悬浮物10分钟，以失活分解酶。冷却后，20,000g离心该介质30分钟。获得的沉淀用1M NaCl抽提两次，以除去蛋白质和核酸。通过20,000g离心30分钟回收该膜。
然后37℃在pH 8时用胰蛋白酶消化它们4小时，之后在相同条件下用胰凝乳蛋白酶消化。
然后通过2000g离心30分钟回收这些膜，用生理盐水，之后用蒸馏水洗涤，并通过超声15分钟进行破碎。方法2在+4℃融化最少48小时之后，将1kg肺炎克氏杆菌干细胞以5％干细胞的浓度重新悬浮在溶液中。加入DNase至5mg/l。然后在Manton Gaulinloop中研磨30分钟，接着在SHARPLES中以50l/h澄清，之后在pH＝4.2+0.1下用乙酸沉淀30分钟。除去沉淀(SHARPLES，25l/h)并中和上清液，然后用渗透水(osmosed water)将其稀释至初体积的两倍。然后在PUF100上以高达800Ωcm进行恒定体积透析，之后将由此获得的膜悬浮物(NS)浓缩至11l/kg干细胞。然后在+121℃35分钟灭菌该MS，并于+4℃保存6个星期。FMKp的特性蛋白聚糖的量，即活性成分FMKp的量定义为半乳糖的总量和蛋白质的总量。
-半乳糖平均2.2g/l
-蛋白质平均10.5g/l。实施例2FMKp对重组蛋白质BBG2Na的佐剂作用BBG2Na是在大肠杆菌中制备的重组蛋白质。其由具有序列SEQ ID NO.4的G2Na肽，即A型呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白的第130位残基至第230位残基片段，和BB，即能够结合血清白蛋白的链球菌G蛋白片段，融合在一起构成的。BBG2Na是一种抗RSV疫苗(Power U.病毒学，1997，230155-166)。
BALB/C小鼠接受2次20μg BBG2Na和不同量FMKp的皮下注射。在第28天(D28)收集血液样品，以G2Na处于固相通过ELISA测定血清抗体的效价。获得的结果显示在图1中。令人惊奇的是，它们显示，FMKp显著增强了抗G2Na的IgG应答；所达到的抗G2Na的IgG效价与用明矾或弗氏佐剂诱导的相似。该作用是剂量依赖性的从5μg FMKp时可以观察到，自50ug FMKp时达到最大，100μg FMKp时保持不变。因此，对于BBG2Na，FMKp是一种潜在的佐剂。
就Th1/Th2应答而言，为了了解FMKp对免疫应答取向的影响，在按以上详述获得的血清上测定抗G2Na的IgG1和IgG2a效价。这些结果(图2)显示，令人惊奇的是，与用明矾所观察到的不同(占优势的同种型是IgG1)，FMKp能够改变抗G2Na IgG1/IgG2a的比例。该分布与弗氏佐剂所诱导的接近。这说明，FMKp可以用作免疫佐剂诱导混合(Th1/Th2)型应答。
按上述方法免疫的动物经鼻腔途径接受105TCID50的RSV-A的病毒攻击。这是在最后的免疫之后三周进行的。病毒攻击后5天，处死动物并取肺以测定RSV-A的滴度。结果(图3)显示，接受FMKp辅助的BBG2Na的动物受到保护不被RSV-A攻击。
总之，FMKp使得可以使抗体应答重新取向，而又不影响保护小鼠不受到RSV-A攻击的能力。实施例3FMKp对失活病毒(流感疫苗)的佐剂作用给BALB/C小鼠单次注射0.01μg ImmugripTM(购自INAVA实验室的流感疫苗)和不同量的FMKp。这些产品是一起施用的。该注射是在第0天经皮下进行的。在第7、14和21天，收集血液样品。采用固相上2μg/mlImmugrip通过ELISA测定抗Immugrip的血清IgG抗体效价。所获结果(图4)显示，FMKp显著增加抗Immugrip的抗体效价，这从最低剂量的FMKp，即0.1μg，就出现了。该佐剂作用是剂量依赖性的。有趣的是，观察到与未接受辅助的Immugrip对照比较，FMKp的存在诱导从第7天较早地出现了抗体应答。采用参考佐剂，弗氏完全佐剂(CFA)，未获得该效果。
权利要求
1.肺炎克氏杆菌膜组分联合抗原或半抗原在制备旨在将免疫应答引向对抗所述抗原或半抗原的Th1型和/或混合Th1/Th2型应答的药物组合物中的用途。
2.权利要求1的用途，其特征在于该膜组分含有至少两种不同细菌菌株的膜组分。
3.权利要求1或2的用途，其特征在于该膜组分是通过含有以下步骤的方法制备的a)在允许所述细菌生长的培养基中对所述细菌进行培养，然后离心所述培养物；b)如果适当的话，失活步骤a)获得的细菌沉淀中的分解酶，之后离心获得的悬浮物；c)通过在抽提溶液中对步骤a)或b)获得的沉淀进行至少一个循环的洗涤，从该沉淀中抽提并除去非膜蛋白质和核酸；d)在存在蛋白酶时消化步骤c)获得的膜沉淀，然后离心；e)在生理盐水和/或蒸馏水中对步骤d)获得的沉淀进行至少一个循环的洗涤；和f)超声处理步骤e)获得的沉淀。
4.权利要求1或2的用途，其特征在于该膜组分是通过含有以下步骤的方法制备的a)在允许所述细菌生长的培养基中对所述细菌进行培养，之后，如果适当的话，进行离心；b)冷冻步骤a)获得的该培养基或沉淀，之后融化并干燥这些细胞；c)利用DNase从重新悬浮起来的步骤b)获得的干燥细胞中除去核酸；d)研磨步骤c)获得的细胞，然后澄清获得的悬浮物；e)在酸性介质中沉淀步骤d)获得的悬浮物，并除去沉淀；f)中和步骤e)获得的含有膜悬浮物的上清液，之后透析并浓缩该膜悬浮物；和g)对步骤f)获得的浓缩膜悬浮物进行灭菌。
5.权利要求1-4之一的用途，其特征在于所述抗原或半抗原选自感染剂所特异的抗原或半抗原，或与肿瘤细胞相关的抗原。
6.权利要求5的用途，其特征在于所述抗原或半抗原选自肽、脂肽、多糖、寡糖、核酸、脂质、或任何能够特异指向对抗感染剂特异的抗原或半抗原或对抗肿瘤细胞相关抗原的Th1型和/或混合Th1/Th2型免疫应答的化合物。
7.权利要求1-6之一的用途，其特征在于所述抗原或半抗原与所述膜组分偶联或混合。
8.权利要求1-7之一的用途，其特征在于所述抗原或半抗原与支持肽共价偶联，形成能够特异结合哺乳动物血清白蛋白的复合物。
9.权利要求8的用途，其特征在于所述支持肽是来源于链球菌G蛋白的肽片段。
10.权利要求8或9的用途，其特征在于所述复合物是通过遗传重组制备的。
11.权利要求7-10之一的用途，其特征在于所述抗原、半抗原或复合物与该膜组分中包含的至少一种化合物共价偶联。
12.权利要求11的用途，其特征在于该共价偶联是通过化学合成实现的偶联。
13.权利要求12的用途，其特征在于有一或多个连接元件被引入该膜组分所包含的至少一种化合物中，和/或被引入所述抗原、半抗原或复合物中，以便于该化学偶联。
14.权利要求13的用途，其特征在于引入的所述连接元件是氨基酸。
15.权利要求11的用途，其特征在于当所述抗原、半抗原或复合物和所述膜化合物的性质是肽时，所述抗原、半抗原或复合物与该膜组分所包含的至少一种化合物之间的偶联是通过遗传重组来进行的。
16.权利要求1-15之一的用途，其特征在于该药物组合物还含有使得可以以能增强其稳定性和/或其免疫原性的形式运载与所述抗原、半抗原或复合物相联的所述膜组分的药剂。
17.权利要求16的用途，其特征在于所述药剂是水包油型或油包水型乳剂。
18.权利要求16的用途，其特征在于所述药剂是脂质体、微球体或纳球体类颗粒，或允许与所述抗原、半抗原或复合物相联的所述膜组分以颗粒形式封装和呈递的任何类型结构。
19.权利要求16的用途，其特征在于所述药剂选自铝盐、钙盐、植物来源的化合物例如Quil A或皂苷、或细菌来源的化合物例如霍乱、百日咳或破伤风类毒素或大肠杆菌热不稳定毒素。
20.权利要求1-19的用途，其特征在于该药物组合物还含有使得可以调节由与所述抗原、半抗原或复合物相联的所述膜组分所诱导的免疫应答的药剂。
21.权利要求20的用途，其特征在于所述调节药剂选自细胞因子、生长因子、激素、或细胞成分如核酸、热休克蛋白家族的蛋白质或核糖体。
22.权利要求1-21之一的用途，用于制备旨在预防或治疗感染性疾病或癌症的药物组合物。
23.权利要求22的用途，其特征在于该感染性疾病是病毒、细菌、真菌或寄生虫来源的。
24.权利要求23的用途，用于制备旨在预防或治疗副粘病毒感染的药物组合物。
25.权利要求24的用途，其特征在于该副粘病毒是呼吸道合胞病毒。
26.权利要求25的用途，其特征在于与该膜组分相联的所述抗原含有具有序列SEQ ID NO.4的G2Na肽，或其序列表现出与序列SEQ ID NO.4有至少80％一致程度的该G2Na肽的同系物之一。
27.权利要求26的用途，其特征在于所述G2Na肽或其同系物之一与链球菌G蛋白的C端片段(BB)共价偶联，形成能够与哺乳动物血清白蛋白结合的复合物。
28.权利要求24的用途，其特征在于该副粘病毒是副流感病毒。
29.药物组合物，其特征在于它含有通过权利要求3或4所定义的方法制备的膜组分，以及与所述膜组分相联的抗原或半抗原。
30.权利要求29的药物组合物，其特征在于所述抗原选自副粘病毒的肽片段。
31.权利要求30的药物组合物，其特征在于该副粘病毒是呼吸道合胞病毒或副流感病毒。
32.权利要求31的药物组合物，其中与该膜组分相联的所述抗原含有具有序列SEQ ID NO.4的呼吸道合胞病毒G2Na肽，或其序列表现出与序列SEQ ID NO.4有至少80％一致性程度的肽。
33.权利要求32的药物组合物，其特征在于所述G2Na肽或其同系物之一与链球菌G蛋白的C端片段(BB)共价偶联，形成能够与哺乳动物血清白蛋白结合的复合物。
全文摘要
本发明涉及革兰氏阴性菌尤其是肺炎克氏杆菌的膜组分联合抗原或半抗原在制备设计用于将免疫应答引向对抗所述抗原或半抗原的Th1和/或混合的Th1/Th2型应答的药物组合物中的用途。本发明还涉及制备所述膜组分和含有它们的药物组合物的方法,以及它们在预防和治疗感染性疾病,尤其是那些涉及副粘病毒例如VRS的感染性疾病和癌症,尤其是那些带有肿瘤相关抗原的癌症中的用途。
文档编号A61P37/00GK1343124SQ0080504
公开日2002年4月3日 申请日期2000年3月15日 优先权日1999年3月15日
发明者C·里博, N·科瓦雅, T·N·恩格耶, A·贝克, J－Y·博奈弗伊 申请人:皮埃尔法博赫药品公司