抑制胰高血糖素的方法

专利名称：抑制胰高血糖素的方法
技术领域：
本发明涉及抑制和/或降低被试者胰高血糖素的方法，包括施用exendin、exendin激动剂或修饰的exendin或exendin激动剂肽。修饰的exendin或exendin激动剂肽中，exendin或exendin激动剂多肽与一个或多个聚乙二醇聚合物或者其它化合物相连，用于降低肾对母体多肽的清除率。这些方法用于治疗诸如胰高血糖素血症和其它病症，这些病症将受益于胰高血糖素水平的降低或者胰高血糖素分泌的抑制。
背景以下叙述中的内容包括对理解本发明有帮助的信息。不承认此处提供的任何信息对于本申请的发明是现有技术或相关，也不承认任何具体地或隐含地提及的公开文书是现有技术。
exendin是发现于Gila畸形蜥蜴及墨西哥珠状蜥蜴唾液分泌物中的多肽。Gila畸形蜥蜴及墨西哥珠状蜥蜴为爬行动物，原产地为亚利桑那州及墨西哥北部地区。exendin-3[SEQ.ID.NO.1His Ser Asp Gly Thr PheThr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg LeuPhe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala ProPro Pro Ser-NH2]存在于Heloderma horridum(墨西哥珠状蜥蜴)唾液分泌物中，而exendin-4[序列编号2[SEQ.ID.NO.2His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu SerLys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp LeuLys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH2]存在于Heloderma suspectum(Gila畸形蜥蜴)唾液分泌物中(Eng，J.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，26520259-62，1990；Eng，J，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，2677402-05，1992)。exendin-3的氨基酸序列如

图1所示。exendin-4的氨基酸序列如图2所示。起初认为exendin-4是毒液的一种组分(可能有毒性)。现在看来，exendin-4根本没有毒性，它其实产生于Gila畸形蜥蜴的唾液腺中。
exendin与胰高血糖素类肽家族中几个成员在序列上有一些相似性，与GLP-1[7～36]NH2[SEQ.ID.NO.3]同源性最高，为53％(Goke，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，26819650-55，1993)。GLP-1[7～36]NH2有时指的是胰高血糖素原[78～107]，或者仅指本文引用最多的“GLP-1”，有促胰岛效应，刺激胰β-细胞分泌胰岛素。也有人报道GLP-1抑制胰α-细胞分泌胰高血糖素(Φrsov，等，糖尿病(Diabetes)，42658-61，1993；D’Alessio，等，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)，97133-38，1996)。有报道表明，GLP-1对胃排空有抑制作用(Willms B，等，J.Clin Endocrinol Metab.81(1)327-32，1996；Wettergren A，等，Dig Dis Sci 38(4)665-73，1993)，GLP-1对胃酸分泌也有抑制作用(SchjoldagerBT，等，Dig Dis Sci.34(5)703-8，1989；O’Halloran DJ，等，J.Endocrinol 126(1)169-73，1990；Wettergren A，等，Dig Dis Sci38(4)665-73，1993)。据报道在GLP-1[7-37]羧基末端有一额外的甘氨酸残基的GLP-1[7-37]刺激人分泌胰岛素(Φrskov，等，糖尿病(Diabetes)，42658-61，1993)。据报道，已经从β-细胞系中克隆了一种将G蛋白和腺苷酸环化酶偶联的跨膜受体，据说这种受体在GUP-1的促胰岛素作用中至少起部分作用(Thorens，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 898641-45，1992)。由于报道过GLP-1对刺激产生胰岛素有增强作用，所以GLP-1成为了近年来重大研究对象的焦点(Byrne MM，Goke B.，用类胰高血糖素肽-1对人进行研究的结果胃肠激素对于临床应用的潜力(Lessons fromhuman studies with glucagon-like peptide-1Potential of thegut hormone for clinical use.)于Fehmann HC，Goke B.促胰岛素胃肠激素类胰高血糖素肽1(Insulinotropic Gut HormoneGlucagon-like Peptide 1).Basel，SwitzerlandKarger，1997219-33)。
还有些报道涉及对胃排空的抑制(Wettergren A，等，截短的GLP-1(胰岛血糖素原78-107-酰胺)抑制人的胃和胰功能(TrunctedGLP-1(proglucagon 78-107-amide)inhibits gastric andpancreatic functions in man)，Dig.Dis.Sci，1993年4月；38(4)665-73)、对胰高血糖素分泌的抑制(Creutzfeldt WOC，等，I型糖尿病患者体内外源类胰高血糖素肽I(7-36)酰胺的glucagonostatic作用和断食高血糖的降低作用(Glucagonostatic actionsand reduction of fasting hyperglycemia by exogenousglucagon-like peptite I(7-36)amide in type I diabeticpatients)，Diabetes Care 1996；19(6)580-6)，以及对食欲的所谓控制作用(Turton MD，等，类胰高血糖素肽-1在对饮食的中心调控中的作用(Arole for glucagon-like peptide-1 in the centralregulation of feeding)，Nature 1996 Jan；379(6560)69-72)。
据报道，GLP-1可以恢复老年大鼠胰岛对葡萄糖的敏感性，将老年大鼠对葡萄糖的耐受性恢复到幼年大鼠时的水平(Egan JM，等，类胰高血糖素肽-1恢复老龄大鼠急性状态胰岛素释放(Glucagon-likepeptide-1 restores acute-phase insulin release to aged rats)，Diabetologia 1997年6月；40(增刊1)A130)。但是，在体内GLP-1发挥其生物作用时持续时间短暂是该肽的一个特征，这限制了其作为治疗药剂的发展。为了延长GLP-1或GLP-1(7-37)的半衰期，人们已经尝试过了多种方法，包括试图改变氨基酸序列以及通过某些制剂释放GLP-1或GLP-1(7-37)(可参见题目为《延长时间多肽的释放》的欧洲专利申请，作者为Darley等，公开号为0619322A2，介绍在含有GLP-1(7-37)的制剂中聚乙二醇包函物的有关问题)。
对药物研究的报道有exendin-4对某些胰岛素分泌细胞上的GLP-1受体起作用；对来自豚鼠的胰分散腺泡细胞起作用；对来自胃的壁细胞起作用；报道还认为，该肽可对促生长素抑制素的释放有刺激作用，对离体胃中胃泌素的释放有抑制作用(Goke，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)26819650-55，1993；Schelp，等，欧洲药物学杂志(Eur.J.Pharmacol.)，69183-91，1994；Eissele，等，生命科学(Life Sci.)，55629-34，1994)。据报道，exendin-3和exendin-4对胰腺胰泡细胞中cAMP的产生有刺激作用，对胰泡细胞释放淀粉酶也有作用(Malhotra，等，调节肽类(Regulatorypeptides)，40149-56，1992；Raufman，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，26721432-37，1992；Singh，等，Regul Pept.5347-59，1994)。此外，exendin-4的作用持续时间比GLP-1明显延长。例如，在一个实施方案中，据报道，由exendin-4对患有糖尿病小鼠的葡萄糖降低现象持续了数个小时，而且，根据剂量，最长持续24小时(EngJ.，exendin-4对db/db小鼠高血糖症的延长时间效果(Prolongedeffect of exendin-4 on hyperglycemia of db/db mice)，糖尿病(Diabetes)1996年五月；45(增刊2)152A(摘要554))。基于exendin-3和exendin-4的促胰岛素活性，有人建议可以用来治疗糖尿病及预防高血糖(Eng，美国专利号5424286)。
Chen和Drucker从Gila畸形体中克隆了exendin基因，他们对exendin是否是哺乳动物GLP-1的种的同系物进行了研究并报道了结果(生物化学杂志(J.Biol Chem.)272(7)4108-15(1997))。结果发现，Gila畸形体也有不同的胰高血糖素原基因(GLP-1是由胰高血糖素原加工而成)，与exendin相比，这一点更与哺乳动物胰高血糖素原相似。这表明，exendin不只是GLP-1的种的同系物。
那些用于延缓胃排空的药剂如今已在胃肠放射检测的诊断辅助药物中有了一席之地。例如，由郎氏胰岛α-细胞产生的胰高血糖素是一种多肽激素，它是一种胰高血糖素药剂，通过激发肝糖原带动葡萄糖。胰高血糖素刺激胰岛素分泌的效果非常轻微。当通过静脉注射葡萄糖这一给药方式行不通时，可以用胰高血糖素治疗由胰岛素诱导产生的低血糖。同时，因为胰高血糖素可以降低胃肠道的能动性，所以可以同时作为胃肠放射检测的诊断辅助药物。多项研究中使用了胰高血糖素治疗胃肠紊乱，这些胃肠紊乱发生的同时还伴随有痉挛的发生。Daniel等人(Br.Med.J.，3720，1974)报道与使用和镇痛药或镇痉剂治疗的病人相比，用胰高血糖素治疗病人急性窒息时的效果更能迅速减轻病人症状。Glauser等人(J，Am.Coll.EmergencyPhysns，8228，1979)在一篇综述中描述道，用胰高血糖素治疗食物性急性食管梗阻可以减轻症状。另外一项研究中，21位身患胆道疾病的病人用胰高血糖素治疗，而另外22位病人用安慰剂处理，结果发现胰高血糖素可明显减轻病人的疼痛(M.J.Stower，等，Br.J.Surg.，69591-2，1982)。
公开于1995年3月16日的共同拥有的国际申请PCT/US94/10225中，记述了使用糊精激动剂调节胃肠能动性的方法。
系列编号为08/908867的共同拥有的美国专利申请提交于1997年8月8日，申请的题目是《调节胃肠能动性的方法》。该申请记述了用exendin激动剂调节胃肠能动性所采用的方法。该申请实际上是1996年8月8日提交的系列编号为08/694954的美国专利申请的延续部分。
系列编号为09/003869的共同拥有的美国专利申请提交于1998年1月7日，申请的题目是《使用exendin及其激动剂减少摄食量》。该申请中描述了用exendin激动剂减少摄食量所采用的方法。该申请受益于四个美国临时申请，申请编号为60/034905的临时性申请提交于1997年1月7日，编号为60/055404的提交于1997年8月7日，编号为60/065442的提交于1997年11月14日，编号为60/066029的提交于1997年11月14日。
系列编号为PCT/US98/16387的共同拥有的PCT申请提交于1998年8月6日，申请的题目为《新型exendin激动剂化合物》。申请中描述了新型exendin激动剂。该申请受益于系列编号为60/055404的美国专利申请，后者提交于1997年8月8日。
系列编号为PCT/US98/24210的共同拥有的PCT申请提交于1998年11月13日，申请的题目为《新型exendin激动剂化合物》。申请中介绍了另一些新型exendin激动剂。该申请受益于系列编号为60/065442的美国临时申请，后者提交于1997年11月14日。
系列编号为PCT/US98/24273的共同拥有的PCT申请提交于1998年11月13日，申请的题目为《新型exendin激动剂化合物》。申请中介绍了另一些新型exendin激动剂。该申请受益于系列编号为60/066029的美国临时申请，后者提交于1997年11月14日。
还有一些与exendin有关的技术的最新进展在系列编号为60/075122的美国临时专利申请和系列编号为60/116380的美国临时专利申请中作了描述。申请的题目分别为《exendin和GLP-1的收缩能效应和利尿效果》和《新型exendin激动剂及其给药方法》，二者分别提交于1998年2月13日和1998年1月14日。
多肽及蛋白质药物用聚乙二醇(PEG)修饰后既有优点又有缺点。一方面，PEG修饰可以延长药物的循环时间，降低药物抗原性及免疫原性，提高药物的溶解度，增强药物抗蛋白水解的能力，提高药物生物利用率，降低药物毒性，增强其稳定性，使多肽更容易配成制剂(请参见Francis等，International Journal of Hematology，681-18，1998)。大多数情况下，用PEG修饰过的药物存在的问题是生物活性大大降低。此外，许多方法中都用到连接体，这些连接体会带来多种不利结果，包括免疫原性、不稳定性、毒性以及反应性。
除了对葡萄糖不再有耐受性外，glacagonoma(胰岛素分泌细胞肿瘤)还会使皮肤产生坏死性游走性红斑。这是一种隆起的鳞状红疹，有时发疱并最终结痂。该症状主要出现在脸部、腹部、四肢及会阴部。其并发症有舌和口部炎症、指甲病及头发稀疏化。据说这种症状是由于胰高血糖素类似物octreotide造成的。本文所述化合物也可以用作胰高血糖素药剂并能治疗此病。1966年有人最先对此病症作了记述(Kaplan，L.M.胃肠道和胰内分泌肿瘤(Endocrine Tumorsof the Gastrointestinal Tract and Pancreas).Ch 262，p1392In Harrison’s Principles of International Medicine，12版，McGraw-Hill Inc，New York，1991)。本文所述化合物用于降低胰高血糖素水平以及/或抑制胰高血糖素分泌，这些化合物中包括exendin、exendin激动剂、修饰的exendin和exendin激动剂，以及相关制剂和剂量制剂。
以上认同的文章、专利、专利申请以及所有提到或引用过的其它文件，所有内容在此引用作为参考。申请人保留以下权利将所有此文提及或引用过的任何资料及信息引入本申请，如文章、专利、专利申请及其它文献。
发明概述本发明涉及降低被试者胰高血糖素水平和/或抑制其胰高血糖素分泌的方法。发明还涉及对高胰高血糖素血症和受益于施用胰高血糖素药剂病症的治疗，后者包括但不仅限于坏死性游走性红斑。
因此，一方面，本发明涉及使用exendin、exendin激动剂或修饰的exendin或exendin激动剂降低被试者胰高血糖素水平的用途，其中修饰的exendin或exendin激动剂是将exendin或exendin激动剂与一个或多个聚乙二醇聚合物或其它分子量提高分子相连。
再一方面，本发明涉及使用exendin、exendin激动剂或修饰的exendin或exendin激动剂抑制被试者高胰高血糖素分泌的用途，其中修饰的exendin或exendin抑制剂与一个或多个聚乙二醇聚合物或用来降低母体肽的肾清除的其它化合物连接。
再一方面，本发明涉及使用extendin激动剂或修饰的extendin或entendin激动剂治疗与高胰血糖素相关的症状的用途，其中修饰的extendin或extendin激动剂与一个或多个聚乙二醇或其它分子量提高分子连接。
还有一方面，本发明涉及使用exendin、exendin激动剂或修饰的exendin或exendin激动剂治疗患有高血糖素瘤或坏死性游走性红斑的被试者的用途。其中修饰的exendin或xtendin抑制剂与一个或多个聚乙二醇或者其它分子量提高分子连接。
在优选实施方案中，exendin为exendin-4。其它优选实施方案中，修饰的exendin或exendin激动剂的分子量比exendin或exendin激动剂的分子量大(优选的大约大10％、50％或90％)；修饰的exendin或exendin激动剂所带负电荷比exendin或exendin激动剂的负电荷要多(优选的大约多10％、50％或90％)；修饰的exendin或exendin激动剂的肾清除率比exendin或exendin激动剂的肾清除率低(优选的大约低10％、50％或90％)；修饰的exendin或exendin激动剂的半衰期比exendin或exendin激动剂的半衰期要长(优选的大约长10％、50％或90％)；修饰的exendin或exendin激动剂的免疫原性/抗原性比exendin或exendin激动剂的免疫原性低；修饰的exendin或exendin激动剂的溶解度比exendin或exendin激动剂的溶解度大(优选的大约大10％、50％或90％)；修饰的exendin或exendin激动剂的蛋白水解速率比exendin或exendin激动剂的蛋白水解速率小(优选的大约小10％、50％或90％)；修饰的exendin或exendin激动剂的毒性比exendin或exendin激动剂的毒性要小；修饰的exendin或exendin激动剂的稳定性比exendin或exendin激动剂的稳定性强；修饰的exendin或exendin激动剂的通透性/生物功能比exendin或exendin激动剂的通透性/生物功能分别强和弱(优选的大约强或弱10％、50％或90％)。
exendin或exendin激动剂可以与1个、2个或3个聚乙二醇聚合物相连。聚乙二醇聚合物分子量优选在500和20000之间。优选实施方案中，修饰的exendin或exendin激动剂为化合物201～217中的其中之一，更优选化合物209、210和213中的其中之一，或化合物201和202中的其中之一，或者化合物216和217中的其中之一(见下面实施例4)。
聚乙二醇聚合物优选与氨基、羧基或硫基相连，可以连接到赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸侧链的N末端或C末端。此外，可用二胺或二羧基连接聚乙二醇聚合物。exendin或exendin激动剂优选通过其赖氨酸上的ε-氨基与聚乙二醇聚合物相连。
“exendin激动剂”指的是模拟exendin效果的化合物，例如对胃能动性及胃排空有效果的化合物(也就是能有效地与受体结合的化合物，exendin能在受体处行使其对胃能动性及胃排空的作用)。优选exendin类似物或衍生物。或者是模拟exendin对通过与受体结合减少摄食量的效果的化合物，在受体处产生以上效果。优选的exendin激动剂包括系列编号为90/003869的美国专利申请(及其它的优先权)中所述化合物，该申请题目为《使用exendin及其激动剂减少摄食量》，提交于1998年1月7日。系列编号为90/003869的美国专利申请(及其它的优先权)与本发明一起共同享有所有权，并且几乎其全部申请内容在下文列出作为参考。可以通过本文所述方法或本领域中熟知的用于检测exendin效果的其它方法对exendin或exendin激动剂的效果进行鉴定、评估或筛查。
另一方面，也给病人使用治疗有效量的糊精激动剂。在一个优选方面，糊精激动剂为糊精或糊精激动剂类似物，如25，28，29pro-人糊精(也叫“pramlintide”，以前称作“AC-137”，公开于1997年11月11日编号为5686511的美国专利《糊精激动剂多肽及其用途》对其进行了描述)或鲑鱼降钙素。
优选的被试者为脊椎动物，哺乳动物更优选，人最优选。本发明中的exendin、exendin激动剂或修饰的exendin或exendin激动剂的给药方式为不经肠式，更优选方式为注射，注射中最优选外周注射。本发明中修饰的exendin或exendin激动剂的优选给药量为大约1μg-30μg～5mg/天。本发明中修饰的exendin或exendin激动剂的更优选给药量为大约1μg-30μg～2mg/天或大约1μg-30μg～1mg/天。本发明中修饰的exendin或exendin激动剂的最优选给药量为大约3μg～500μg/天。
修饰及使用的优选exendin或exendin激动剂包括exendin-4(1-30)[SEQ ID NO 4His Gly Glu Gly Thr PheThr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg LeuPhe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly]；exendin-4(1-30)酰胺[SEQ ID NO 5His Gly Glu Gly ThrPhe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val ArgLeu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly-NH2]；exendin-4(1-28)酰胺[SEQ ID NO 6His Gly Glu Gly ThrPhe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val ArgLeu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn-NH2]；14Leu，25Phe exendin-4酰胺[SEQ ID NO 7His Gly Glu GlyThr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala ValArg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Gly Gly-NH2]；14Leu，25Phe exendin-4(1-28)酰胺 [SEQ ID NO 8His GlyGlu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu GluAla Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn-NH2]；和14Leu，22Ala，25Phe exendin-4(1-28)酰胺[SEQ ID NO 9HisGly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu GluGlu Ala Val Arg Leu Ala Ile Glu Phe Leu Lys Asn-NH2]。定义以下术语，除另作明确说明外，都定义为以下含义，本发明及此文中用到术语均与此一致。
“氨基酸”这一术语指的是天然氨基酸、非天然氨基酸以及氨基酸类似物，所有的立体异构体为D和L型(如果结构允许这些立体异构体形式出现的话)。天然氨基酸包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)以及缬氨酸(Val)。非天然氨基酸包括(但不局限于)三甲叉亚胺甲酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2，4-二氨基异丁酸、锁链(赖氨)素、2，2’-二氨基庚二酸、2，3-二氨基己酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟赖氨酸、别羟脯氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链(赖氨)素、别异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、戊基甘氨酸、六氢吡啶羧酸以及硫代脯氨酸。氨基酸类似物包括可逆的或不可逆的化学上被封闭的天然氨基酸和非天然氨基酸或者N-末端氨基或侧链基团上修饰过的天然和非天然氨基酸，如甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜、S-(羧甲基)-半胱氨酸、S-(羧甲基)-半胱氨酸亚砜以及S-(羧甲基)-半胱氨酸砜。
“氨基酸类似物”这一术语指的是这样一种氨基酸，其C-末端羧基，N-末端氨基或侧链官能团化学加工成另外一种官能团。例如，天冬氨酸-(β-甲酯)是天冬氨酸的氨基酸类似物；N-乙基甘氨酸是甘氨酸的氨基酸衍生物；而丙氨酸甲酰胺是丙氨酸的氨基酸类似物。
“氨基酸残基”这一术语指的是有以下结构的基团(1)-C(O)-R-NH-，其中典型的R为-CH(R’)-，其中R’为氨基酸侧链，典型的R’为H或含有一个碳的取代基；或者(2) 其中p＝1、2或3，分别表示三甲叉亚胺甲酸残基、脯氨酸残基或者六氢吡啶羧酸残基。
在有关有机基团如烷基时提及的“低级”这一术语指的是最多6个并包括6个碳原子在内的基团，优选最多4个并包括4个碳原子，适宜的基团有1个或2个碳原子。这样的基团可以是直链或支链的。
“药学上可接受的盐”包括本发明中的化合物的盐，它们由这样的化合物与一种有机酸或无机酸化合衍生。事实上用盐类形式与用碱的形式没有分别。本发明的化合物既可用游离碱的形式也可用盐类形式，两种形式均在本发明范围之内。
此外，以下缩写代表以下内容“ACN”或“CH3CN”是指乙腈；“Boc”“tBoc”或“Tboc”是指叔丁氧羰基；“DCC”是指N，N’-二环己基碳二亚胺；“Fmoc”是指芴甲氧羰基；“HBTU”是指2-(1-氢-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3，-四甲基糖醛六氟磷酸；“HOBt”是指1-羟基苯并三唑一水合物；“homo P”或“hPro”是指高脯氨酸；“MeAla”或“Nme”是指N-甲基丙氨酸；“naph”是指萘基丙氨酸；“pG”或“pGly”是指戊基甘氨酸；“tBuG”是指叔丁基甘氨酸；“ThioP”或“tPro”是指硫代脯氨酸；“3Hyp”是指3-羟基脯氨酸；“4Hyp”是指4-羟基脯氨酸；“NAG”是指N-烷基甘氨酸；
“NAPG”是指N-烷基戊基甘氨酸；“Norval”是指正缬氨酸；“Norleu”是指正亮氨酸。
从以下对本发明的优选实施方案及权利要求书的描述内容中，不难看到本发明的其它特点和优点。
附图简述图1显示出exendin-3[SEQ.ID.NO.1]的氨基酸序列。
图2显示出exendin-4[SEQ.ID.NO.2]的氨基酸序列。
图3显示出本发明中某些有效的exendin激动剂[SEQ.ID.NO.10～40]的氨基酸序列。
图4显示出本发明中的某些化合物的氨基酸序列。WX WGK TRQ 1-174。
图5图示说明功能性肾切除对exendin-4清除率的影响。
图6图示说明在肾切除了的被试者和假被试者中exendin-4血浆水平的终末衰变。
发明详述本发明涉及抑制和/或降低被试者胰高血糖素的方法，包括施用一种exendin、一种exendin激动剂或一种修饰的exendin或exendin激动剂，修饰的exendin或exendin激动剂中exendin多肽或exendin激动剂多肽与一个或多个聚乙二醇聚合物相连接，或者与能提高分子量的其它化合物相连接。这些方法对例如治疗高胰高血糖素血症及其它一些病症有帮助，被试者受益于胰高血糖素水平的降低或者胰高血糖素分泌的抑制。这些病症包括但不仅限于高血糖素瘤和坏死性游走性红斑。修饰的exendin和exendin激动剂本发明中的修饰的exendin或exendin激动剂包括例如连接一个或多个PEG聚合物的exendin或exendin激动剂，如天然存在的exendin、以及合成的exendin或exendin激动剂。exendin-4exendin-4是一种天然存在的多肽，是从Gila畸形体的唾液分泌物中分离得到的。动物实验表明exendin能降低血浆中的胰高血糖素并能够维持数小时。这种含有39个氨基酸的exendin-4多肽可以用本文所述的固相合成法人工合成，人工合成出的exendin-4与天然exendin-4没有区别。
正如本文所述，我们研究了exendin-4的非临床药理学。大脑中的exendin-4主要与后脑中的腮后区孤束核区以及前脑中的穹窿下器相结合。对exendin-4在大鼠和小鼠的脑及肾中的结合情况进行了观察研究。还不清楚肾中exendin-4与何结构相结合。
通过多种实验比较了exendin-4与GLP-1的生物作用，表明exendin-4特性谱更为有利。Db/db(糖尿的)及ob/ob(糖尿型肥胖的)小鼠中exendin-4单皮下剂量就使血浆胰高血糖素下降幅度最高可达40％。用exendin-4治疗Diabetic Fatty zucker(ZDF)大鼠5周后，HbA1c(对糖基化血红蛋白的度量，以便对血浆葡萄糖水平进行评估)下降幅度最高可达41％。治疗肥胖ZDF大鼠5周后，其胰岛素敏感性也升高了76％。发现在不耐葡萄糖的灵长类中血糖的下降幅度依赖于药物剂量的大小。
观察到在啮齿动物中exendin-4有促胰岛作用，在非禁食的Harlan Sprague Dawley(HSD)大鼠中能提高胰岛素对葡萄糖应答作用幅度超过100％，在非禁食的db/db小鼠中提高最大幅度大约10倍。若预处理中血糖浓度更高些，则exendin-4降低葡萄糖的效应就越强些。因此，看起来所观察到的exendin-4对葡萄糖的降低效应是葡萄糖依赖性的。当动物处于真血糖状态时，exendin-4对葡萄糖的降低效应将是最小的。
exendin-4对HSD大鼠胃排空的减缓作用是葡萄糖依赖性的，比GLP-1的作用效果要强～90倍。实验也表明，外周给药之后，exendin-4能减少NIH/Sw(瑞士)小鼠的摄食量，比GLP-1的作用效果强至少1000倍。麻醉的ZDF大鼠在其高胰岛素状态时和高血糖状态时exendin-4能降低大约40％血糖浓度，但正常大鼠在其真血糖状态时exendin-4并不能影响血糖的浓度。已经证明exendin-4减少肥胖ZDF大鼠体重的方式是剂量依赖性的，而在瘦ZDF大鼠中观察到其体重下降只是暂时性的。因为包括exendin-4在内的exendin、exendin激动剂和修饰的exendin或exendin激动剂能够降低胰高血糖素及抑制胰高血糖素的分泌，所以对于那些受益于胰高血糖素降低的人群(这些人包括那些有高血糖素瘤及坏死性游走性红斑的人群以及糖尿病人)，不论他们还有没有分泌胰岛素的能力，exendin-4对他们都有帮助。见实施例5。
对exendin-4在小鼠、大鼠和猴子的单剂量实验、大鼠和猴子的重复剂量(最高时每天连续28次)实验以及体外诱变性和染色体变替实验中exendin-4的毒理学进行了研究。目前为止，没有发生死亡，而且没有观察到在血液学、临床化学或宏微观组织中产生与治疗相关的变化。研究表明，exendin-4没有致突变的倾向，而且试验浓度(最高浓度5000μg/ml)中不曾使染色体发生畸变。
对exendin的大量免疫测定是为了研究其非临床药物动力学及其代谢。在初始药物动力学研究中用到了有限敏感性为～100pM的放射免疫测定法。随后用两点IRMA分析法测定exendin-4，用到的更低极限定量是15pM。采用皮下方式给药exendin-4，用放射免疫测定法发现exendin-4的生物利用率大约为50～80％。这与下面的采用腹膜内给药方式测定的exendin-4的生物利用率(48～60％)结果相近。给药30到43分钟(Tmax)之间时出现血浆浓度峰(Cmax)。Cmax和AUC值都仅与剂量相关。采用皮下给药方式时exendin-4的表观终末半衰期大约是90～110分钟，比下面采用静脉给药方式时的14～41分钟显著延长。用IRMA分析法得到了类似的结果。比较exendin-4和GLP-1的降解研究结果表明，exendin-4相对来说不会轻易被降解掉。exendin激动剂研究了exendin的结构-活性关系(SAR)；研究exendin中与抗糖尿活性有关的结构；研究exendin的代谢稳定性；改进其物理特性，尤其是多肽稳定性及受不同给药系统的影响程度。并因此发明了多种exendin激动剂多肽化合物。exendin激动剂包括exendin多肽类似物，在exendin多肽类似物中去除掉一个或多个天然氨基酸或用别的氨基酸替代。exendin-4激动剂类似物为优选的exendin激动剂。特别优选的exendin激动剂包括那些以下申请或临时申请中记述的化合物题目为《新型exendin激动剂化合物》、系列编号为PCT/US98/16387的共同拥有的PCT申请，提交于1998年8月6日，该申请受益于1997年8月8日提交的系列编号为60/055404的美国专利申请；题目为《新型exendin激动剂化合物》、系列编号为PCT/US98/24210的共同拥有的PCT申请，提交于1998年11月13日，该申请受益于1997年11月14日提交的系列编号为60/065442的美国临时申请；以及题目为《新型exendin激动剂化合物》、系列编号为PCT/US98/24273的共同拥有的PCT申请，提交于1998年11月13日，该申请受益于1997年11月14日提交的系列编号为60/066029的美国临时申请。以上所有申请在此完整引入作为参考，包括任何图表。
可以通过下文所述的测定法揭示exendin激动剂的活性。可以用此文所述方法或其它用于检测胃能动性的已知或相当的方法检定、评估或筛查exendin或exendin激动剂对胃能动性及胃排空的作用效果。利用负受体分析法或筛选法对exendin激动剂化合物或候选exendin激动剂化合物进行筛查。例如，用糊精受体制品采用1993年11月23日公开的、编号为5264372美国专利中所述糊精受体分析筛选法(此申请内容在此引入作为参考)；在T47D和MCF7乳癌细胞中包含有与腺苷酸环化酶活性的刺激作用相偶联的钙受体，用T47D和MCF7乳癌细胞采用1个或多个降钙素受体分析法/筛选法；及/或用SK-N-MC细胞采用CGRP受体分析法/筛选法。
检定或评定一种化合物降低胃能动性强弱所用的一个这样的方法包括(a)既要有待测样又要有待测系统，待测样中包含有1种或多种待测化合物，在待测系统中包含评定胃能动性时的系统，待测系统的特征在于其显示出对引入系统的葡萄糖或食物应答产生的血糖水平，及(b)鉴定系统中血糖升高的存在及其量的多少。可能会用到正和/或对照。包含在本发明领域之内的还有些式(I-VIII)的化合物的药学可接受盐以及包括所说的化合物及其盐在内的药物组合物。式Iexendin激动剂中还包括编号为60/065442的美国临时申请中所述的化合物，包括式(I)的化合物[SEQ.ID.NO.41]Xaa1Xaa2Xaa3Gly Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Ala Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26Xaa27Xaa28-Z1；其中Xaa1为His、Arg或Tyr；Xaa2为Ser、Gly、Ala或Thr；Xaa3为Asp或Glu；Xaa5为Ala或Thr；Xaa6为Ala、Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa7为Thr或Ser；Xaa8为Ala、Ser或Thr；Xaa9为Asp或Glu；Xaa10为Ala、Leu、Ile、Val、戊基甘氨酸或Met；Xaa11为Ala或Ser；Xaa12为Ala或Lys；Xaa13为Ala或Gln；Xaa14为Ala、Leu、Ile、戊基甘氨酸、Val或Met；Xaa15为Ala或Glu；Xaa16为Ala或Glu；Xaa17为Ala或Glu；Xaa19为Ala或Val；Xaa20为Ala或Arg；Xaa21为Ala或Leu；Xaa22为Ala、Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa23为Ile、Val、Leu、戊基甘氨酸、叔基甘氨酸或Met；Xaa24为Ala、Glu或Asp；Xaa25为Ala、Trp、Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa26为Ala或Leu；Xaa27为Ala或Lys；Xaa28为Ala或Asn；Z1为-OH，-NH2Gly-Z2，Gly Gly-Z2，Gly Gly Xaa31-Z2
Gly Gly Xaa31Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2或Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2；Xaa31、Xaa36、Xaa37及Xaa38独立地为Pro、高脯氨酸、3Hyp、4Hyp、硫代脯氨酸、N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸中的任何一个；而Z2为-OH或-NH2；条件是在Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中为Ala的不超过3个。在N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸及N-烷基丙氨酸中优选的N-烷基包括优选为1～6个碳原子的低级烷基，更优选的碳原子个数为1～4个。
优选的exendin激动剂化合物中包括那些其中Xaa1为His或Tyr的化合物。更为优选的Xaa1为His。
优选的化合物中Xaa2为Gly。
优选的化合物中Xaa14为Leu、戊基甘氨酸或Met。
优选的化合物中Xaa25为Typ或Phe。
优选的化合物中Xaa6为Phe或萘丙氨酸；Xaa22为Phe或萘丙氨酸，而Xaa23为Ile或Val。
优选的化合物中，Xaa31、Xaa36、Xaa37及Xaa38分别选自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸和N-烷基丙氨酸中的任何一个。
Z1优选-NH2。
Z2优选-NH2。
一方面，优选的式(I)的化合物中Xaa1为His或Tyr，更优选His；Xaa2为Gly；Xaa6为Phe或萘丙氨酸；Xaa14为Leu、戊基甘氨酸或Met；Xaa22为Phe或萘丙氨酸；Xaa23为Ile或Val；Xaa31、Xaa36、Xaa37或Xaa38均独自选自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-烷基丙氨酸中的任一个。Z1更优选-NH2。
特别优选方面，式(I)中特别优选化合物中Xaa1为His或Arg；Xaa2为Gly或Ala；Xaa3为Asp或Glu；Xaa5为Ala或Thr；Xaa6为Ala或Phe或萘丙氨酸；Xaa7为Thr或Ser；Xaa8为Ala、Ser或Thr；Xaa9为Asp或Glu；Xaa10为Ala、Leu或戊基甘氨酸；Xaa11为Ala或Ser；Xaa12为Ala或Lys；Xaa13为Ala或Gln；Xaa14为Ala、Leu或戊基甘氨酸；Xaa15为Ala或Glu；Xaa16为Ala或Glu；Xaa17为Ala或Glu；Xaa19为Ala或Val；Xaa20为Ala或Arg；Xaa21为Ala或Leu；Xaa22为Phe或萘丙氨酸；Xaa23为Ile、Val或叔丁基甘氨酸；Xaa24为Ala、Glu或Asp；Xaa25为Ala、Trp或Phe；Xaa26为Ala或Leu；Xaa27为Ala或Lys；Xaa28为Ala或Asn；Z1为-OH、-NH2、Gly-Z2、GlyGly-Z2、GlyGlyXaa31-Z2、GlyGlyXaa31Ser-Z2Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2，Gly Gly Xaa31SerSer Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38独立地为Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-甲基丙氨酸中的任何一个；Z2为-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中为Ala的不超过3个。编号为PCT/US98/24210、名为《新的exendin激动剂化合物》的PCT申请提交于1998年11月13日，特别优选的化合物包括在该申请列出的那些化合物，并在此确定为化合物2-23。
特别优选方面提供了化合物，其中Xaa14为Leu、Ile、Val或戊基甘氨酸，更优选Leu或戊基甘氨酸；Xaa25为Phe、Tyr或萘丙氨酸，更优选phe或萘丙氨酸。这样的化合物无论体外和体内，还是在化合物合成过程中都不易氧化降解。式IIexendin激动剂中还包括编号为60/066029的美国临时申请中所述的化合物，包括式(II)的化合物[SEQ.ID.NO.42]Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Ala Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26Xaa27Xaa28-Z1；其中Xaa1为His、Arg、Tyr、Ala、正缬氨酸、Val或正亮氨酸；Xaa2为Ser、Gly、Ala或Thr；Xaa3为Ala、Asp或Glu；Xaa4为Ala、正缬氨酸、Val、正亮氨酸或Gly；Xaa5为Ala或Thr；Xaa6为Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa7为Thr或Ser；Xaa8为Ala、Ser或Thr；Xaa9为Ala、正缬氨酸、VaL、正亮氨酸、Asp或Glu；Xaa10为Ala、Leu、Ile、Val、戊基甘氨酸或Met；Xaa11为Ala或Ser；Xaa12为Ala或Lys；Xaa13为Ala或Gln；Xaa14为Ala、Leu、Ile、戊基甘氨酸、Val或Met；Xaa15为Ala或Glu；Xaa16为Ala或Glu；Xaa17为Ala或Glu；Xaa19为Ala或Val；Xaa20为Ala或Arg；Xaa21为Ala或Leu；Xaa22为Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa23为Ile、Val、Leu、戊基甘氨酸、叔丁基甘氨酸或Met；Xaa24为Ala、Glu或Asp；Xaa25为Ala、Trp、Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa26为Ala或Leu；Xaa27为Ala或Lys；Xaa28为Ala或Asn；
Z1为-OH，-NH2Gly-Z2，Gly Gly-Z2，Gly GlyXaa31-Z2Gly GlyXaa31Ser-Z2Gly Gly Xae31Ser Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2或GlyGlyXaa31SerSerGlyAlaXaa36Xaa37Xaa38Xaa39-Z2，其中Xaa31、Xaa36、Xaa37及Xaa38独立地为Pro、高脯氨酸、3Hyp、4Hyp、硫代脯氨酸、N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸中的任何一个；而Z2为-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa9、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中为Ala的不超过3个，同时的前提是如果Xaa1为His、Arg或Tyr，那么在Xaa3、Xaa4和Xaa9中至少有一个是Ala。
在N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸及N-烷基丙氨酸中，优选的N-烷基包括优选为1～6个碳原子的低级烷基，更优选的碳原子个数为1～4个。合适的式(II)的化合物包括那些在1998年11月13日提交系列编号为PCT/US98/24273的申请中所述的化合物，该申请题目为《新的exendin激动剂化合物》，其中在实施例1-89鉴定了这些化合物(分别为“化合物1-89”)，以及实施例104和105所确定的那些相应的化合物。
优选的这样的exendin激动剂化合物中包括那些其中Xaa1为His、Ala或正缬氨酸的化合物。Xaa1更优选为His或Ala。Xaa1最优选His。
优选的式(II)化合物中Xaa2为Gly。
优选的式(II)化合物中Xaa3为Ala。
优选的式(II)化合物中Xaa4为Ala。
优选的式(II)化合物中Xaa9为Ala。
优选的式(II)化合物中Xaa14为Leu、戊基甘氨酸或Met。
优选的式(II)化合物中Xaa25为Trp或Phe。
优选的式(II)化合物中Xaa6为Ala、Phe或萘丙氨酸；Xaa22为Phe或萘丙氨酸；而Xaa23为Ile或Val。
优选的式(II)化合物中，Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38分别选自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-烷基丙氨酸中的任何一个。
Z1优选-NH2。
Z2优选-NH2。
一方面，优选的式(II)化合物中Xaa1为Ala、His或Tyr，更优选Ala或His；Xaa2为Ala或Gly；Xaa6为Phe或萘丙氨酸；Xaa14为Ala、Leu、戊基甘氨酸或Met；Xaa22为Phe或萘丙氨酸；Xaa23为Ile或Val；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38独立地选自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-烷基丙氨酸中的任何一个。Xaa39为Ser或Tyr，更优选Ser。Z1更优选-NH2。
特别优选方面，式(II)中特别优选化合物中Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gly或Ala；Xaa3为Ala、Asp或Glu；Xaa4为Ala或Gly；Xaa5为Ala或Thr；Xaa6为Phe或萘丙氨酸；Xaa7为Thr或Ser；Xaa8为Ala、Ser或Thr；Xaa9为Ala、Asp或Glu；Xaa10为Ala、Leu或戊基甘氨酸；Xaa11为Ala或Ser；Xaa12为Ala或Lys；Xaa13为Ala或Gln；Xaa14为Ala、Leu、Met或戊基甘氨酸；Xaa15为Ala或Glu；Xaa16为Ala或Glu；Xaa17为Ala或Glu；Xaa19为Ala或Val；Xaa20为Ala或Arg；Xaa21为Ala或Leu；Xaa22为Phe或萘丙氨酸；Xaa23为Ile、Val或叔丁基甘氨酸；Xaa24为Ala、Glu或Asp；Xaa25为Ala、Trp或Phe；Xaa26为Ala或Leu；Xaa27为Ala或Lys；Xaa28为Ala或Asn；Z1为-OH、-NH2、Gly-Z2、GlyGly-Z2、GlyGlyXaa31-Z2、
Gly Gly Xaa31Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2，GlyGly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly AlaXaa36-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2，Gly GlyXaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2或Gly Gly Xaa31SerSer Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38Xaa39-Z2；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38独立地为Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-甲基丙氨酸中的任何一个；Z2为-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中为Ala的不超过3个；再一个前提是，如果Xaa1为His、Arg或Tyr，那么Xaa3、Xaa4和Xaa9中至少有一个是Ala。特别优选的式(II)化合物包括在提交于1998年11月13日的系列编号为PCT/US98/24273的申请《新的exendin激动剂化合物》中所述化合物，其中有SEQ.ID.IVOS.5-93的氨基酸序列。
特别优选的方面提供了式(II)化合物中Xaa14为Ala、Leu、Ile、Val或戊基甘氨酸，更优选Leu或戊基甘氨酸；Xaa25为Ala、Phe、Tyr或萘丙氨酸，更优选Phe或萘丙氨酸。这样的化合物无论体外和体内，还是在化合物合成过程中都不易氧化降解。式III本发明范围内还包括范围更窄的各种长度的多肽化合物，如那些肽链长度分别不是28、29或30个氨基酸残基的化合物。另外，本发明还包括那些提交于1998年11月13日、系列编号为PCT/US98/24210的PCT申请《新型exendin激动剂化合物》中所述的范围更窄的化合物，这些化合物有特定的氨基酸序列，例如式(III)的化合物[SEQ.ID.NO.43]Xaa1Xaa2Xaa3Gly Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Ala Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26Xaa27Xaa28-Z1；其中Xaa1为His或Arg；Xaa2为Gly或Ala；Xaa3为Asp或Glu；Xaa5为Ala或Thr；Xaa6为Ala、Phe或萘丙氨酸；Xaa7为Thr或Ser；Xaa8为Ala、Ser或Thr；Xaa9为Asp或Glu；Xaa10为Ala、Leu或戊基甘氨酸；Xaa11为Ala或Ser；Xaa12为Ala或Lys；Xaa13为Ala或Gln；Xaa14为Ala、Leu或戊基甘氨酸；Xaa15为Ala或Glu；Xaa16为Ala或Glu；Xaa17为Ala或Glu；Xaa19为Ala或Val；Xaa20为Ala或Arg；Xaa21为Ala或Leu；Xaa22为Phe或萘丙氨酸；Xaa23为Ile、Val或叔丁基甘氨酸；Xaa24为Ala、Glu或Asp；Xaa25为Ala、Trp或Phe；Xaa26为Ala或Leu；Xaa27为Ala或Lys；Xaa28为Ala或Asn；Z1为-OH，-NH2Gly-Z2，Gly Gly-Z2，Gly GlyXaa31-Z2
Gly Gly Xaa31Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2或Gly GlyXaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2；Xaa31、Xaa36、Xaa37及Xaa38独立地选自为Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸和N-甲基丙氨酸中的任何一个；而Z2为-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中为Ala的不超过3个；以及其药学可接受盐类。式IV此外，本发明还包括提交于1998年11月13日、系列编号为PCT/US98/24273的PCT申请《新型exendin激动剂化合物》中所述的范围更窄的肽类化合物，这些化合物有特定的氨基酸序列，如式(IV)的化合物[SEQ.ID.NO.44]Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Ala Xaa18Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26Xaa27Xaa28-Z1；其中Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gly或Ala；Xaa3为Ala、Asp或Glu；Xaa4为Ala或Gly；Xaa5为Ala或Thr；Xaa6为Phe或萘丙氨酸；Xaa7为Thr或Ser；Xaa9为Ala、Ser或Thr；Xaa9为Ala、Asp或Glu；Xaa10为Ala、Leu或戊基甘氨酸；Xaa11为Ala或Ser；Xaa12为Ala或Lys；Xaa13为Ala或Gln；Xaa14为Ala、Leu、Met或戊基甘氨酸；Xaa15为Ala或Glu；Xaa16为Ala或Glu；Xaa17为Ala或Glu；Xaa19为Ala或Val；Xaa20为Ala或Arg；Xaa21为Ala或Leu；Xaa22为Phe或萘丙氨酸；Xaa23为Ile、Val或叔丁基甘氨酸；Xaa24为Ala、Glu或Asp；Xaa25为Ala、Trp或Phe；Xaa26为Ala或Leu；Xaa27为Ala或Lys；Xaa28为Ala或Asn；Z1为-OH，-NH2Gly-Z2，Gly Gly-Z2，Gly GlyXaa31-Z2，
Gly Gly Xaa31Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38Ser-Z2；Xaa31、Xaa36、Xaa37及Xaa38独立地为Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸和N-甲基丙氨酸中的任何一个；而Z2为-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中为Ala的不超过3个；并且前提是若Xaa1为His、Arg或Tyr，那么在Xaa3、Xaa4和Xaa9中至少有一个是Ala；以及其药学可接受盐类。
优选的式(IV)化合物中，Xaa1为His、Ala、正缬氨酸或4-咪唑丙酰。Xaa1优选His或4-咪唑丙酰或Ala，更优选His或4-咪唑丙酰。
优选的式(IV)化合物中Xaa2为Gly。
优选的式(IV)化合物中Xaa4为Ala。
优选的式(IV)化合物中Xaa9为Ala。
优选的式(IV)化合物中Xaa14为Leu、戊基甘氨酸或Met。
优选的式(IV)化合物中Xaa25为Trp或Phe。
优选的式(IV)化合物中Xaa6为Ala、Phe或萘丙氨酸；Xaa22为Phe或萘丙氨酸；而Xaa23为Ile或Val。
优选的式(IV)化合物中Z1为-NH2。
优选的式(IV)化合物中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38独立地选自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸及N-烷基丙氨酸中的任何一个。
优选的式(IV)化合物中Xaa39为Ser或Tyr，优选Ser。
优选的式(IV)化合物中Z2为NH2。
优选的式(IV)化合物中Z1为-NH2。
优选的式(IV)化合物中Xaa21为Lys-NHε-R，其中R为Lys、Arg、C1～C10直链或支链烷酰基。
优选的式(IV)化合物中X1为Lys-Asn，Lys-NHε-RAsn或Lys-NHε-R Ala，其中R是Lys、Arg、C1～C10直链或支链烷酰基。优选的式(IV)化合物中包括1998年11月13日提交的系列编号为PCT/US98/24273的PCT申请《新的exendin激动剂化合物》中所述的氨基酸序列化合物，选自其中的SEQ.ID.NOS95-110。式V此处也给出1998年11月13日提交的名为《新型exendin激动剂化合物》的PCT申请PCT/US98/24210中的化合物，包括式(V)的化合物[SEQ.ID.NO.45]5 10Xaa1Xaa2Xaa3Gly Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Ala Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26X1-Z1；其中Xaa1为His、Arg或Tyr或4-咪唑丙酰；Xaa2为Ser、Gly、Ala或Thr；Xaa3为Asp或Glu；Xaa5为Ala或Thr；Xaa6为Ala、Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa7为Thr或Ser；Xaa8为Ala、Ser或Thr；Xaa9为Ala或Glu；Xaa10为Ala、Leu、Ile、Val、戊基甘氨酸或Met；Xaa11为Ala或Ser；Xaa12为Ala或Lys；Xaa13为Ala或Gln；Xaa14为Ala、Leu、Ile、戊基甘氨酸、Val或Met；Xaa15为Ala或Glu；Xaa16为Ala或Glu；Xaa17为Ala或Glu；Xaa19为Ala或Val；Xaa20为Ala或Arg；Xaa21为Ala、Leu或Lys-NHε-R，其中R为Lys、Arg、C1～C10直链或支链烷酰基或环烷基烷酰基；Xaa22为Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa23为Ile、Val、Leu、戊基甘氨酸、叔丁基甘氨酸或Met；Xaa24为Ala、Glu或Asp；Xaa25为Ala、Trp、Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa26为Ala或Leu；X1为Lys Asn、Asn Lys、Lys-NHε-R Asn、Asn Lys-NHε-R、Lys-NHε-R Ala或Ala Lys-NHε-R，其中R是Lys、Arg、C1～C10直链或支链烷酰基或环烷基烷酰基；Z1为-OH，-NH2Gly-Z2，Gly Gly-Z2，Gly GlyXaa31-Z2Gly Gly Xaa31Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2或Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa3Xaa38-Z2；其中Xaa31、Xaa36、Xaa36及Xaa38独立地选自Pro、高脯氨酸、3Hyp、4Hyp、硫代脯氨酸、N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸中的任何一个；而Z2为-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25和Xaa26中为Ala的不超过3个，式(V)化合物的药学可接受盐类以及包括所述化合物及其盐的药用组合物，也都在本发明范围之内。
优选的式(V)exendin激动剂化合物包括那些其中Xaa1为His、Tyr或4-咪唑丙酰的化合物。Xaa1更优选His。
优选的式(V)化合物中Xaa1为4-咪唑丙酰。
优选的式(V)化合物中Xaa2为Gly。
优选的式(V)化合物中Xaa14为Leu、戊基甘氨酸或Met。
优选的式(V)化合物中Xaa25为Trp或Phe。
一方面，优选的式(V)化合物中Xaa6为Phe或萘丙氨酸；Xaa22为Phe或萘丙氨酸；Xaa23为Ile或Val。Z1更优选-NH2。一方面，特别优选的式(V)化合物中Xaa31、Xaa36、Xaa37或Xaa38独立地选自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸及N-烷基丙氨酸中的任何一个。Z2更优选-NH2。
优选的式(V)化合物中包括那些其中X1为Lys Asn、Lys-NHε-RAsn或Lys-NHε-R Ala的化合物，其中R为是Lys、Arg、C1～C10直链或支链烷酰基。优选的式(V)的化合物包括在1998年11月13日提交的、系列编号为PCT/US98/24210的名为《新的exendin激动剂化合物》PCT申请中所述的化合物，其中确定为化合物编号为62-69。
优选的这样的exendin激动剂化合物中包括那些其中Xaa1为His、Ala或正缬氨酸的化合物。Xaa1更优选His或Ala。Xaa1最优选His。
优选式(V)化合物中Xaa2为Gly；优选式(V)化合物中Xaa3为Ala；优选式(V)化合物中Xaa4为Ala；优选式(V)化合物中Xaa9为Ala；优选式(V)化合物中Xaa14为Leu、戊基甘氨酸或Met；优选式(V)化合物中Xaa25为Trp或Phe；优选式(V)化合物中Xaa6为Ala、Phe或萘丙氨酸；Xaa22为Phe或萘丙氨酸；Xaa23为Ile或Val。
优选式(V)化合物中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38独立地选自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸及N-甲基丙氨酸中的任何一个；Z1优选为-NH2。
Z2优选为-NH2。
一方面，优选式(V)化合物中Xaa1为Ala、His和Tyr，更优选Ala或His；Xaa2为Ala或Gly；Xaa6为Phe或萘丙氨酸；Xaa14为Ala、Leu戊基甘氨酸或Met；Xaa22为Phe或萘基丙氨酸；Xaa23为Ile或Val；Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38独立地选自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-烷基丙氨酸中的任何一个；Xaa39为Ser或Tyr，更优选Ser。Z1更优选-NH2。
特别优选方面，特别优选化合物包括式(V)化合物中Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gly或Ala；Xaa3为Ala、Asp或Glu；Xaa4为Ala或Gly；Xaa5为Ala或Thr；Xaa6为Phe或萘丙氨酸；Xaa7为Thr或Ser；Xaa8为Ala、Ser或Tyr；Xaa9为Ala、Asp或Glu；Xaa10为Ala、Leu或戊基甘氨酸；Xaa11为Ala或Ser；Xaa12为Ala或Lys；Xaa13为Ala或Gln；Xaa14为Ala、Leu、Met或戊基甘氨酸；Xaa15为Ala或Glu；Xaa16为Ala或Glu；Xaa17为Ala或Glu；Xaa19为Ala或Val；Xaa20为Ala或Arg；Xaa21为Ala或Leu；Xaa22为Phe或萘丙氨酸；Xaa23为Ile、Val或叔丁基甘氨酸；Xaa24为Ala、Glu或Asp；Xaa25为Ala、Typ或Phe；Xaa26为Ala或Leu；Xaa27为Ala或Lys；Xaa28为Ala或Asn；Z1为-OH、-NH2、Gly-Z2、Gly Gly-Z2、GlyGlyXaa31-Z2、Gly Gly Xaa31Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2，GlyGly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly AlaXaa36-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2，Gly GlyXaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2或Gly Gly Xaa31SerSer Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38Xaa39-Z2；其中Xaa31、Xaa36、Xaa37及Xaa38独立地为Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-甲基丙氨酸中的任何一个；而Z2为-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27和Xaa28中为Ala的不超过3个；且前提是，如果Xaa1为His、Arg或Tyr，那么Xaa3、Xaa4和Xaa9中至少有一个是Ala。特别优选的式(V)化合物包括1998年11月13日提交的、系列编号为PCT/US98/24210的名为《新的exendin激动剂化合物》的PCT申请中所述化合物，所述化合物具有SEQ.ID.NOS.5-93鉴定的氨基酸序列。
特别优选方面，提供了式(V)化合物，其中Xaa14为Ala、Leu、Ile、Val或戊基甘氨酸，更优选Leu或戊基甘氨酸；而Xaa25为Ala、Phe、Tyr或萘丙氨酸，更优选Phe或萘丙氨酸。这样的化合物无论体外和体内，还是在化合物合成过程中都不易氧化降解。式VI此处也给出1998年11月13日提交的名为《新型exendin激动剂化合物》的PCT申请PCT/US98/24273中所述的化合物，包括式(VI)的化合物[SEQ.ID.NO.46]5 10Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Xaa14Xaa15Xaa16Xaa17Ala Xaa19Xaa20Xaa21Xaa22Xaa23Xaa24Xaa25Xaa26X1-Z1；其中Xaa1为His、Arg、Tyr、Ala正缬氨酸、Val、正亮氨酸或4-咪唑丙酰；Xaa2为Ser、Gly、Ala或Thr；Xaa3为Ala、Asp或Glu；Xaa4为Ala、正缬氨酸、Val、正亮氨酸或Gly；Xaa5为Ala或Thr；Xaa6为Phe、Thr或萘丙氨酸；Xaa7为Thr或Ser；Xaa8为Ala、Ser或Thr；Xaa9为Ala、正缬氨酸、Val、正亮氨酸、Asp或Glu；Xaa10为Ala、Leu、Ile、Val、戊基甘氨酸或Met；Xaa11为Ala或Ser；Xaa12为Ala或Lys；Xaa13为Ala或Gln；Xaa14为Ala、Leu、Ile、戊基甘氨酸、Val或Met；Xaa15为Ala或Glu；Xaa16为Ala或Glu；Xaa17为Ala或Glu；Xaa19为Ala或Val；Xaa20为Ala或Arg；Xaa21为Ala、Leu或Lys-NHε-R，其中R为Lys、Arg、C1～C10直链或支链烷酰基或环烷基(alleyl)烷酰基；Xaa22为Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa23为Ile、Val、Leu、戊基甘氨酸、叔丁基甘氨酸或Met；Xaa24为Ala、Glu或Asp；Xaa25为Ala、Trp、Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa26为Ala或Leu；X1为Lys Asn、Asn Lys、Lys-NHε-R Asn、Asn Lys-NHε-R、Lys-NHε-R Ala或Ala Lys-NHε-R，其中R是Lys、Arg、C1～C10直链或支链烷酰基或环烷基烷酰基；Z1为-OH，-NH2Gly-Z2，Gly Gly-Z2，Gly GlyXaa31-Z2，
Gly Gly Xaa31Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37-Z2，Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38-Z2或Gly Gly Xaa31Ser Ser Gly Ala Xaa36Xaa37Xaa38Xaa39-Z2；其中Xaa31、Xaa36、Xaa37及Xaa38独立地选自Pro、高脯氨酸、3Hyp、4Hyp、硫代脯氨酸、N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸和N-烷基丙氨酸中的任何一个；而Z2为-OH或-NH2；前提是Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa9、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16、Xaa17、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa24、Xaa25和Xaa26中为Ala的不超过3个，同时前提是，若Xaa1为His、Arg、Tyr或4-咪唑丙酰，那么Xaa3、Xaa4和Xaa9中至少有一个是Ala。
式(VI)化合物优选包括那些其中Xaa1为His、Ala、正缬氨酸或4-咪唑丙酰的化合物。Xaa1优选His或4-咪唑丙酰或Ala，Xaa1更优选His或4-咪唑丙酰。
优选的式(VI)化合物中包括那些其中Xaa2为Gly的化合物。
优选的式(VI)化合物中包括那些其中Xaa4为Ala的化合物；优选的式(VI)化合物中包括那些其中Xaa9为Ala的化合物；优选的式(VI)化合物中包括那些其中Xaa14为Leu、戊基甘氨酸或Met的化合物。
优选的式(VI)化合物中包括那些其中Xaa25为Trp或Phe的化合物。
优选的式(VI)化合物中包括那些其中Xaa6为Ala、Phe或萘丙氨酸、Xaa22为Phe或萘丙氨酸及Xaa23为Ile或Val的化合物。
优选的式(VI)化合物中包括那些其中Z1为-NH2的化合物。
优选的式(VI)化合物中包括那些其中Xaa31、Xaa36、Xaa37和Xaa38独立地选自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸及N-烷基丙氨酸中的任何一个的化合物。
优选的式(VI)化合物中包括那些其中Xaa39为Ser或Tyr，更优选Ser的化合物。
优选的式(VI)化合物中包括那些其中Z2为-NH2的化合物。
优选的式(VI)化合物中包括那些其中Z1为-NH2的化合物。
优选的式(VI)化合物中包括那些其中Xaa21为Lys-NHε-R的化合物，其中R为是Lys、Arg、C1～C10直链或支链烷酰基。
优选的式(VI)化合物中包括那些其中X1为Lys Asn、Lys-NHε-RAsn或Lys-NHε-R的化合物，其中R为是Lys、Arg、C1～C10直链或支链烷酰基。
优选的式(VI)包括在1998年11月13日提交的、名为《新的exendin激动剂化合物》的PCT申请PCT/US98/24273中所述的化合物，它们具有选自SEQ.ID.NOS 95-110中鉴定的氨基酸序列。式VII根据本发明，特别有用的化合物是提交于1998年1月7日、名为《使用exendin及其激动剂减少摄食量的用途》、系列编号为09/003869的美国专利申请中所述的exendin激动剂化合物，包括式(VII)的化合物[SEQ.ID.NO.47]1 5 10Xaa1Xaa2Xaa3Gly Thr Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa815 20Ser Lys Gln Xaa9Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu2530Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Leu Lys Asn Gly Gly Xaa1435Ser Ser Gly Ala Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18-Z其中Xaa1为His、Arg或Tyr；Xaa2为Ser、Gly、Ala或Thr；Xaa3为Asp或Glu；Xaa4为Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa5为Thr或Ser；Xaa6为Ser或Thr；Xaa7为Asp或Glu；Xaa8为Leu、Ile、Val、戊基甘氨酸或Met；Xaa9为Leu、Ile、戊基甘氨酸、Val或Met；Xaa10为Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa11为Ile、Val、Leu、戊基甘氨酸、叔丁基甘氨酸或Met；Xaa12为Glu或Asp；Xaa13为Trp、Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17独立地为Pro、高脯氨酸、3Hyp、4Hyp、硫代脯氨酸、N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸中的任何一个；Xaa18为Ser、Thr或Tyr；而Z为-OH或-NH2；前提条件是该化合物不含有SEQ.ID.NOS 1或2的结构式。N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸和N-烷基丙氨酸中优选的N-烷基包括低级烷基，优选1～6个碳原子，更优选1～4个碳原子。适当的化合物中包括那些有着SEQ.ID.NOS.10～40的氨基酸序列的化合物。式(VII)化合物的药学可接受盐在本发明中也有用。
优选的exendin激动剂化合物中包括那些其中Xaa1为His或Tyr的化合物。Xaa1更优选His。
优选的是那些其中Xaa2为Gly的化合物。
优选的是那些其中Xaa9为Leu、戊基甘氨酸或Met的化合物。
优选的化合物包括那些其中Xaa13为Trp或Phe的化合物。
同样优选的化合物中Xaa4为Phe或萘丙氨酸；Xaa11为Ile或Val；而Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17独立地选自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-烷基丙氨酸中的任何一个。优选的N-烷基丙氨酸中其N-烷基有1～6个碳原子。
特别优选方面，Xaa15、Xaa16和Xaa17为同一个的氨基酸残基。
优选的化合物中Xaa18为Ser或Tyr，更优选Ser。
Z优选-NH2。
一方面，优选的式(VII)化合物中Xaa1为His和Tyr，更优选His；Xaa2为Gly；Xaa4为Phe或萘丙氨酸；Xaa9为Leu、戊基甘氨酸或Met；Xaa10为Phe或萘丙氨酸；Xaa11为Ile或Val；Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17独立地选自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-烷基丙氨酸中的任何一个；而Xaa18为Ser或Tyr，更优选Ser。Z更优选-NH2。
特别优选方面，特别优选的化合物中所包括的式(VII)化合物中Xaa1为His或Arg；Xaa2为Gly；Xaa3为Asp或Glu；Xaa4为Phe或萘丙氨酸；Xaa5为Thr或Ser；Xaa6为Ser或Thr；Xaa7为Asp或Glu；Xaa8为Leu或戊基甘氨酸；Xaa9为Leu或戊基甘氨酸；Xaa10为Phe或萘丙氨酸；Xaa11为Ile、Val或叔丁基甘氨酸；Xaa12为Glu或Asp；Xaa13为Trp或Phe；Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17独立地选自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-甲基丙氨酸中的任何一个；Xaa18为Ser或Tyr；而Z为-OH或-NH2；前提条件是该化合物不具有SEQ.ID.NOS 1或2的结构式。Z更优选-NH2。特别优选的化合物包括那些有着SEQ.ID.NOS 10、11、22、23、24、27、29、36、37和40的氨基酸序列的化合物。
特别优选方面，所给化合物中Xaa9为Leu、Ile、Val或戊基甘氨酸，更优选Leu或戊基甘氨酸，而Xaa13为Phe、Tyr或萘丙氨酸，更优选Phe或萘丙氨酸。这些化合物显示了更有利的作用持续时间，且这些化合物无论体内和体外还是在化合物合成过程中都不易氧化降解。式VIII同时给出1998年8月6日提交的系列编号为PCT/US98/16387名为《新型exendin激动剂化合物》的PCT申请中所述化合物，包括式(VIII)的化合物[SEQ.ID.NO.48]1 5 10Xaa1Xaa2Xaa3Gly Thr Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa815 20Ser Lys Gln Xaa9Glu Glu Glu Ala Val Arg25 30Leu Xaa10Xaa11Xaa12Xaa13Leu X1Gly Gly Xaa1435Ser Ser Gly Ala Xaa15Xaa16Xaa17Xaa18-Z其中Xaa1为His、Arg、Tyr或4-咪唑丙酰；Xaa2为Ser、Gly、Ala或Thr；Xaa3为Asp或Glu；Xaa4为Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa5为Thr或Ser；Xaa6为Ser或Thr；Xaa7为Asp或Glu；Xaa8为Leu、Ile、Val、戊基甘氨酸或Met；Xaa9为Leu、Ile、戊基甘氨酸、Val或Met；Xaa10为Phe、Tyr或萘丙氨酸；Xaa11为Ile、Val、Leu、戊基甘氨酸、叔丁基甘氨酸或Met；Xaa12为Glu或Asp；Xaa13为Trp、Phe、Tyr或萘丙氨酸；X1为Lys Asn、Asn Lys、Lys-NHε-R Asn、Asn Lys-NHε-R，其中R是Lys、Arg、C1～C10直链或支链烷酰基或环烷基烷酰基基；Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17独立地为Pro、高脯氨酸、3Hyp、4Hyp、硫代脯氨酸、N-烷基甘氨酸、N-烷基戊基甘氨酸或N-烷基丙氨酸中的任何一个；Xaa18为Ser、Thr或Tyr；而Z为-OH或-NH2；前提条件是该化合物不具有SEQ.ID.NOS 1和2的结构式。适当的化合物包括1998年8月6日提交的、系列编号为PCT/US98/16387、名为《新的exendin激动剂化合物》的PCT申请中所述化合物，它们具有SEQ.ID.NOS 37-40的氨基酸序列。
优选的式(VIII)exendin激动剂化合物所包括的化合物中Xaa1为His、Tyr或4-咪唑丙酰。Xaa1更优选His或4-咪唑丙酰。
优选的式(VIII)化合物中Xaa2为Gly。
优选的式(VIII)化合物中Xaa9为Xaa9为Leu、戊基甘氨酸或Met。
优选的式(VIII)化合物中Xaa13为Trp或Phe。
优选的式(VIII)化合物中X1为Lys Asn或Lys-NHε-R Asn，其中R是Lys、Arg、C1～C10直链或支链烷酰基。
同样优选的式(VIII)化合物中Xaa4为Phe或萘丙氨酸；Xaa10为Phe或萘丙氨酸；Xaa11为Ile或Val；而Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17独立地选自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-烷基丙氨酸中的任何一个。特别优选方面，Xaa18为Ser或Tyr。优选的化合物中Xaa18为Ser。Z优选-NH2。
特别优选方面，优选的式(VIII)化合物中Xaa4为Phe或萘丙氨酸；Xaa10为Phe或萘丙氨酸；Xaa11为Ile或Val；X1为Lys Asn或Lys-NHε-RAsn，其中R是Lys、Arg、C1～C10直链或支链烷酰基；Xaa14、Xaa15、Xaa16和Xaa17独立地选自Pro、高脯氨酸、硫代脯氨酸或N-烷基丙氨酸中的任何一个。制备修饰的exendin和exendin激动剂将一个或多个聚乙二醇聚合物连接到exendin或exendin激动剂上，即得到本发明中的exendin或exendin激动剂。首先描述exendin或exendin激动剂的合成，接着介绍将聚乙二醇聚合物连接到exendin或exendin激动剂上的方法。制备exendin或exendin激动剂可以通过Eng等(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)26520259-62，1990)以及Eng等(生物化学杂志J.Biol.Chem.2677402-05，1992)所述多肽的纯化方法制备得到本文所述的exendin或exendin激动剂化合物，如exendin类似物或exendin衍生物。所述方法在此引入作为参考。另外，也可用本领域中熟知的方法制取exendin和exendin激动剂多肽。如Raufman等人(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)26721432-37，1992)所述方法，使用标准固相肽合成技术及优选的自动或半自动肽合成仪合成上述化合物，这些方法在此引入作为参考。可以使用标准固相肽合成技术及优选的自动或半自动肽合成仪制备本发明中制剂和剂量的组成活性成分。通常情况下，该技术在碱如二异丙基乙胺和偶联剂如二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑存在下，在惰性溶剂例如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷中，α-N-氨甲酰基保护下的氨基酸与连在树脂上的正在延长的肽链上的氨基酸于室温下发生偶联反应。用诸如三氟乙酸或六氢吡啶等试剂可将α-N-氨甲酰基保护基从生成肽链上脱除下来。重复偶联反应可将下一个需要的N-端被保护的氨基酸加到肽链上。本领域中熟知的合适的N-保护基团中，叔丁氧羰基(tBoc)和芴甲氧羰基(Fmoc)在本文中优选。
可从加拿大Applied Biosystems Inc.(Foster City，CA)订购多肽合成仪用到的溶剂、氨基酸衍生物及4-二苯甲基胺树脂。可从Applied Biosystems Inc.买到以下保护侧链的氨基酸BSD-112344.1-Arg(Pmc)、Boc-Thr(Bzl)、Fmoc-Thr(t-Bu)、Boc-Ser(Bzl)、Fmoc-Ser(t-Bu)、Boc-Tyr(BrZ)、Fmoc-Tyr(t-Bu)、Boc-Lys(Cl-Z)、Fmoc-Lys(Boc)、Boc-Glu(Bzl)、Fmoc-Glu(t-Bu)、Fmoc-His(Trt)、Fmoc-Asn(Trt)以及Fmoc-Gln(Trt)。Boc-His(BOM)可购自Applied Biosystems Inc.或Bachem Inc.(Torrance，CA)。苯甲醚、二甲硫、苯酚、乙二硫醇以及苯甲硫醚可从Aldrich ChemicalCompany(Milwaukee，WI)订购。Air Products andChemicals(Allentown，PA)提供HF。乙醚、乙酸和甲醇可从FisherScientific(Pittsburgh，PA)订购。
多肽的固相合成可以在自动肽合成仪(Model 430A，AppliedBiosystems Inc.，Foster City，CA)上进行，使用NMP/HOBt(Option1)系统和tBoc或Fmoc化学方法进行保护(请参见ABI 430A肽合成反应用生物体系使用说明(Applied Biosystems User’s Manual forthe ABI 430A Peptide Synthesizer)，版本1.3B，1988年7月1日，第6节，pp.49-70，Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)。可以用HF(-50～0℃，1小时)裂解Boc-肽树脂。轮流使用水和乙酸可将多肽从树脂中抽提出来，滤液再冷冻干燥。裂解F-moc可根据标准方法(裂解技术导论(Introduction to CleavageTechniques)，Applied Biosystems Inc.，1990，pp.6-12)。也可用Advanced Chem Tech Synthesizer(Model MPS 350，Louisville，Kentucky)合成多肽。
可使用Waters Delta Prep 3000系统用RP-HPLC(制备柱和分析柱)纯化多肽。肽的分离可以用C4、C8或C18制备柱(10μ，2.2×25cm；Vydac，Hesperia，CA)，肽的纯度可用C4、C8或C18分析柱(5μ，0.46×25cm；Vydac)检测。溶剂(A＝0.1％TFA/水，B＝0.1％TFA/CH3CN)可以1.0ml/min的流速流过分析柱，而以15ml/min的流速流过制备柱。氨基酸分析可在Waters Pico Tag系统上进行，操作时使用Maxima程序。可用气相酸水解作用将肽水解(115℃，20-24h)。通过标准方法(Cohen，等，Pico标记方法氨基酸分析先进技术手册(The PicoTag MethodA Manual of Advanced Techniques for Amino AcidAnalysis)，pp.11-52，Millipore Corporation，Milford.MA(1989))可衍生并分析水解产物。可以在M-Scan，Incorporated(WestChester，PA)上进行快速原子轰击分析。用碘化铯或碘化铯/甘油校准肽质量。使用滞留时间的等离子体吸收离子化分析可以在AppliedBiosystems Bio-Ion 20质谱仪上进行。在VG-Trimo仪器上研究多肽的电子喷射质谱学。
本发明制剂和剂量中有用的多肽有效成分化合物也可以通过DNA重组技术，用本领域中已知方法制备。可参见Sambrook等，分子克隆实验手册(Molecular CloningAlaborotory Manual)，第2版，冷泉港1989)。此外，通过均相多肽合成方法也可制备这些化合物。本发明中非多肽类有用化合物可用领域中已知方法制备。例如含有磷酸根的氨基酸以及含有此类氨基酸的多肽，可以用本领域中已知方法制备。可参照Bartlett & Landen，生物有机化学(Biorg.Chem.)14356-377(1986)。聚乙二醇聚合物的结合有数种方法可将PEG偶联到多肽/蛋白质上。参照Int.J.Hematology 681(1998)；生物偶联化学(Bioconjugate Chem.)6150(1995)；及Crit.Rev Therap.Drug Carrier Sys.9249(1993)，所有这些文献在此完整引入作为参考。因此，本领域中的熟练操作人员可以利用这些熟知的技术将一个或多个聚乙二醇聚合物连接到本文所述的exendin和exendin激动剂上。合适的典型聚乙二醇聚合物可以商购，也可以用本领域中熟练人员熟知的技术制取。聚乙二醇分子量优选在500和20000之间，可以是直链或支链聚合物。
PEG可以通过与氨基、羧基或硫醇基发生偶联作用从而附着在完整的多肽或蛋白质上。这些基团有典型的N末端及C末端，且位于诸如赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸这样的天然存在的氨基酸侧链上。由于exendin4及其它exendin和exendin激动剂可以通过固相多肽化学技术制取，所以多种含有二氨基和二羧基并有正交保护基的部分可用于PEG的连接。
本发明同时提供将exendin或exendin激动剂连接到一个或多个非PEG的聚合物分子之上的方法，这些非PEG的聚合物能以类似于聚乙二醇聚合物的方式调节肾清除率。这样的聚合物例子包括清蛋白和明胶。请参照Gombotz & Pettit，生物偶联化学(BioconjugateChem.)，6332-351，1995，该文献在此完整引入作为参考。应用就其药理学特性而论，本文所述制剂和剂量是有用的。尤其是此文所述化合物可以作为降低胰高血糖素水平及抑制胰高血糖素分泌的药剂，这通过其可以降低动物和人胰高血糖素水平的能力得到证明。这些化合物可用于治疗一些病症，通过降低胰高血糖素水平及抑制胰高血糖素分泌减轻疾病的痛苦。
以上提及的化合物可以与各种无机的及有机的酸和碱形成盐。这些盐中包括用有机酸和无机酸制取的盐，所述酸如HCl、HBr、H2SO4、H3PO4、三氟乙酸、乙酸、甲酸、甲磺酸、甲苯磺酸、马来酸、延胡索酸以及樟脑磺酸。用碱加成的盐包括铵盐、碱金属盐，如钠盐和钾盐，还包括碱土金属盐，如钙盐和镁盐。优选的盐是乙酸盐、盐酸盐以及三氟乙酸盐。这些盐可以用传统方式生成，如将以游离酸或游离碱形式存在的产物与一或多当量的合适的碱或酸在盐不溶的溶剂或介质中反应，或者在诸如水的溶剂中反应，随后真空中或通过冷冻干燥去除掉水，或者通过在合适的离子交换树脂上将成盐的离子换成别的离子。制剂及其用法鉴于本发明修饰的exendin和exendin激动剂制剂和剂量有类似于exendin的作用，所以它们是有用的，并且可以方便地以适用于非肠道给药(包括静脉内、肌肉内、皮下)的制剂形式出现。本文也有制剂和剂量可用于其它医药送递途径，包括口、鼻、颊、舌下及肺。
可以通过测量循环中的exendin-4，同时观察其生物反应，如给药后糖尿病动物中血糖的降低，来研究exendin-4送递其它的给药途径的可能性。研究了exendin-4通过呼吸道(鼻、气管及肺途径)和消化道(舌下、食管及内十二指肠途径)几种表面的情况。通过观察经呼吸道的各个给药途径以及经胃肠道的舌下和食管多肽研究血液中exendin-4的生物作用及其外观特征。同时对所有的气管内给药、鼻给药、经肠给药及舌下给药途径进行了描述。
在一些情况下，提供一种修饰的exendin或exendin激动剂及另外一种抗胰高血糖素药剂如糊精或糊精激动剂以单一成分或以溶液形式一起给药比较方便。另外一些情况下，将另一种抗胰高血糖素药剂与exendin、exendin激动剂或修饰的exendin或exendin激动剂分开给药则更为有利。还有一些情况，exendin、exendin激动剂或修饰的exendin或exendin激动剂要么以共制剂形式要么与别的降低胰高血糖素药剂如糊精分开使用则更为有益。最好由从业者决定每个病人的适宜给药方式。在标准制剂论文中，如Remington′sPharmaceutical Sciences(作者E.W.Martin)，描述了合适的药用的载体及其制剂。同时请参考Wang，Y.J.&Hanson，M.A.肽和蛋白质的肠胃外制剂稳定性和稳定剂(“Parenteral Formulations ofProteins and PeptidesStability and Stabilizers.”)，肠胃外科学和技术杂志(Journal of Parenteral Science andTechnology.)，技术报告(Techical Report)No.10，增刊.4225(1998)。
本发明中有用化合物也可以以用于注射或灌注的肠胃外组合物出现。例如，这些化合物可以悬浮在惰性油中，可用的植物油例如有芝麻油、花生油、橄榄油；或者悬浮在其它可用的载体上。这些化合物优选悬浮在含水的载体上，如悬浮在大约pH5.6～7.4的等渗溶液中。组合物即可用传统方法灭菌也可过滤灭菌。组合物中应包含接近生理条件所需的药用辅助物，如pH缓冲剂。可选用的缓冲液包括例如乙酸钠/乙酸缓冲液。可以使用一种仓库或“补给站”缓慢释放制剂形式，以便使经皮下注射或给药后制剂的治疗有效量能在几小时或几天内进入血流中。
所需等渗性可以用氯化钠或其它药用介质如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇、多元醇(如甘露醇和山梨糖醇)或其它无机或有机溶质实现。对于含有钠离子的缓冲液，氯化钠尤其优选。
所述化合物也可形成药用盐类(如由酸加成的盐)和/或其复合物。药用盐类在其给药浓度下应为无毒盐类。这些盐类制剂通过改变组合物的理化特性同时并不抑制组合物发挥其生理作用来增强其药理作用的。有用的理化特性变化的例子包括降低熔点以有利于跨粘膜给药、提高溶解度以有利于使药物以更高的浓度给药。
药用盐类包括酸加成的盐，如硫酸盐、盐酸盐、磷酸盐、磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、p-甲苯磺酸盐、环己基磺酸盐以及奎尼酸盐。可以用酸制备药用盐类，这些酸如盐酸、硫酸、磷酸、次磺酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、p-甲苯磺酸、环己基磺酸和奎尼酸。这些盐的制备方法是，例如，用产物的游离酸或游离碱形式在盐不溶的溶剂或介质中与一或多当量的适当的碱或酸反应产生，或者在诸如水的溶剂中反应，其随后在真空中去除掉或通过冷冻干燥去除掉，或者在合适的离子交换柱上将成盐的离子交换成另一种离子。
使用载体或赋形剂对化合物的给药有促进作用。载体和赋形剂的例子包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖类(如乳糖、葡萄糖、蔗糖或各种类型的淀粉)、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇以及生理配伍溶剂。组合物或药学组合物可以不同的途径给药，包括静脉内、腹膜内、皮下以及肌肉内、口、局部或跨粘膜。
以上组合物溶液如果想增稠的话，可用增稠试剂如甲基纤维素增稠。组合物可以制备成乳化形式，或油包水或水包油。可供使用的药用乳化剂有多种，包括例如金合欢粉、非离子表面活性剂(如Tween)或离子表面活性剂(如碱性聚醚醇的硫酸酯或磺酸酯，如Triton)。
本发明中有用化合物的制备方法是参照一般性方法将各成分混合好。例如，所选组分可以在搅拌器中简单混匀，也可用其它标准装置制备成浓缩混合物。通过加水或加入增稠剂可将浓缩混合物调到最终浓度及最终粘度，并可用缓冲液控制其pH或加入其它溶质控制其张力。
为使内科医生使用方便，化合物可以以剂量单位形式出现。剂量单位中包含一定量的exendin、exendin激动剂或修饰的exendin或xendin激动剂，可以有也可以没有另外一种抗胰高血糖素药剂。治疗有效量的Exendin、exendin激动剂或修饰的exendin或xendin激动剂用于控制胰高血糖素及用于受益于胰高血糖素水平的降低或调节的病症，其治疗有效量能够降低饭后血糖水平达到想要达到的水平。糖尿病或不耐胰高血糖素的个体，他(它)们体内血浆胰高血糖素水平会比正常个体中的高些。可以使这些个体饭后血糖水平发生有益的降低或保持平缓。治疗药剂的有效量会因为多种因素而有所不同，本领域的人都认同这一点。这些因素包括病人的年龄和体重，病人的身体状况，想要获得的胰高血糖素水平或抑制胰高血糖素的抑制水平，还有其它一些因素。
这些药用组合物可用于降低被试者的胰高血糖素，也可用于其它紊乱症，能够有益地降低或抑制被试者的胰高血糖素。
对于体重70公斤的病人，化合物的每天有效抗胰高血糖素剂量通常在0.01或0.03～约5mg/天的范围内，优选量约为0.01或0.5～2mg/天，更优选约0.01或0.1～1mg/天，可以一次性给药也可以分剂量给药。准确的给药剂量由临床医生决定，取决于特定化合物在以上所提供剂量的范围以及个体的年龄、体重和身体状况。应在发现症状或对胰高血糖素的上升诊断为糖尿病后即刻开始给药。可以通过注射的方式给药，优选皮下注射或肌肉内注射。口服有效的化合物可以口服，但剂量应该增加5-10倍。
一般情况下，在治疗或抑制升高的、不适的或不想要的饭后血糖水平时，本发明中的化合物可以以类似于上述给出的剂量范围对需要这种治疗的患者施用。但是化合物的给药更频繁，如一天一次、一天两次或一天三次。特别优选的exendin和exendin激动剂制剂和剂量及其特别优选的给药方式在以下申请中有所描述共同拥有的美国临时申请60/116380(及其对应的声明优先权的PCT申请，提交于2000年1月14日，申请系列号(未定))，题目《新型exendin激动剂制剂及其给药方法》，提交于1999年1月14日；美国临时申请60/[未定]，题目为《用exendin及其激动剂调节甘油三酯水平并治疗血脂异常症的用途》，提交于1999年1月14日。本申请声明对以上申请有优先权，以上申请的公开内容再次完整引入作为参考。
本申请中给病人的最适制剂及化合物给药方式依赖于本领域熟知的因素，这些因素如特定的疾病或紊乱、想要达到的效果以及病人类型。这些化合物通常用于治疗人的疾病，但也可用于治疗其它脊椎动物中的类似的或同一种疾病，这些脊椎动物包括其它灵长类，农场动物如猪、牛和家禽，还有体育动物和宠物如马、狗以及猫。
以下包括了一些实施例，描述了一系列实验结果，这些实施例对理解本发明有帮助。与本发明有关的实验当然不能解释成特异地限制了本发明。本发明的变例，无论是现在已知的或以后发展起来的，都将是本领域熟练人员的工作范围，并认为是处在本文所述及下文要求的本发明范围之内。
实施例1--exendin-3的制备方法His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met GluGlu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly GlyPro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH2[SEQ.ID.NO.1]以上酰胺化的多肽是在4-(2’-4’-二甲氧苯基)-Fmoc氨甲基苯氧基乙酰胺正亮氨酸MBHA树脂(Novabiochem，0.55mmol/g)上用Fmoc保护的氨基酸(Applied Biosystems Inc.)装配成的。通常情况下，合成的自始至终用的是单偶联循环，并用到Fast Moc(HBTU活化)化学。用哌啶实现正在延长链的脱保护(Fmoc基团的去除)。参照标准方法(Introduction to Cleavage Techniques，AppliedBiosystems Inc.)，用三乙基甲硅烷(0.2ml)、乙二硫醇(0.2ml)、茴香醚(0.2ml)、水(0.2ml)和三氟乙酸(15ml)的混合物完成对完整肽树脂的脱保护。多肽用乙醚/水(50ml)沉淀，然后离心。沉淀物用冰醋酸还原，随后冻干。冻干的多肽用水溶解。粗产物的纯度大约为75％。
纯化和分析步骤中用到溶剂A(0.1％TFA/水)和溶剂B(0.1％TFA/ACN)。
包含多肽的溶液加到C-18制备柱上进行纯化(10％～40％溶剂B/溶剂A，40分钟以上)。用C-18分析柱等度鉴定级分的纯度。合并以上鉴定的多肽纯级分。冻干的多肽用分析型RP-HPLC(30％-60％梯度溶剂B/溶剂A，30分钟以上)分析，给出观察的滞留时间为19.2分钟的肽产物。
实施例2--exendin-4的制备方法His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met GluGlu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly GlyPro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH2[SEQ.ID.No.2]以上酰胺化的多肽是在4-(2’-4’-二甲氧苯基)-Fmoc氨甲基苯氧基乙酰胺正亮氨酸MBHA树脂(Novabiochem，0.55mmol/g)上用Fmoc保护的氨基酸(Applied Biosystems Inc.)装配成的。树脂的裂解方法、脱保护及纯化方法与实施例1中所记述的exendin-3的方法相类似。多肽分析时用溶剂A(0.1％TFA/水)和溶剂B(0.1％TFA/ACN)。冻干的多肽用分析型RP-HPLC(36％-46％溶剂B/溶剂A，30分钟以上)分析，给出滞留时间为14.9分钟的肽产品。电子喷射质谱分析(M)计算值为4186.6，实测值为4186.0-4186.8(4批)。
实施例3--肾清除率在去除某些分子(药物、多肽、蛋白质)时肾发挥主要作用。对于某些分子，这一过程在肾小球过滤血液产生下文所述的超滤液时就开始了。肾小球在过滤时不仅以分子量为基础，而且肾小球可作为负电荷选择屏障，促使阴离子化合物的滞留。血浆中分子量小于5kD及有效半径小于15的游离分子(未与蛋白结合)比较容易滤过。对于更大分子量的分子，滤过时是有限制的，主要受分子大小、分子结构和净电荷的影响。肾小球滤过的截止点在清蛋白(67kD，被滞留)和血红蛋白(68kD，滤过)之间。清蛋白有效半径为约36，肾小球滤过的不超过1％。
一旦肾小球中的分子到达近端小管，则该分子要么被重吸收要么继续通过亨利氏袢到达近端小管，集合小管将滤液排到膀胱。近端小管处滤过的蛋白质和多肽通常会被刷状缘酶裂解，在此处它们会有效地被钠/氨基协同转运蛋白(清除泵)回收。而那些极性的、离子化的以及大分子量的分子将不被重吸收。在这一过程中，肾皮质(近端小管)中的代谢酶也可能将分子降解成极性更强的分子，于是增大了通透进入尿的可能性。许多肽类激素(如糊精、降钙素)是在经过肾循环时被降解的，可能是由能进入血浆的胞外酶完成的，这一过程是和肾小球的滤过作用分开进行的。在那些实施方案中，血浆对多肽的清除率与肾血浆流量率相当，比肾小球滤过率高大约3倍。
为鉴定exendin-4的血浆循环代谢物而进行的研究中，并未发现因蛋白水解造成的降解迹象。动物静脉灌注大量剂量后，血浆HPLC分析只有完整的exendin，并出现可忽略的表示降解产物集结的“子代”峰。这与其它多肽(如糊精和GLP-1)的研究结果相反。其它多肽的研究结果是伴随着“母体”HPLC峰消失的是“子代”HPLC峰的出现，随后确定“子代”HPLC峰是亚肽降解物。没有exendin血浆降解产物这一结果表明在包括肾循环的任何部位都只有少许或没有蛋白水解的发生。肾清除率用的是非蛋白水解方式，即产生对氨基马尿酸盐的滤过作用或有效排泄作用。
exendin-4清除率的最初测量结果是人(120～130ml/min)、猴(～9ml/min)和大鼠(3.2～4.4ml/min)，这与报道的这些物种中的肾小管滤过率相等。为鉴定肾清除率是否是消除exendin的主要方式，进行如下研究对过液禁食的肾切除雄性大鼠灌注恒定流速的exendin。与有完整肾的大鼠相比，肾切除大鼠中稳态的exendin-4血浆水平有了很大提高。该数据表明肾负责至少exendin-4 80％的清除率(见图5和图6)。完整大鼠的exendin清除率又一次与那些肾切除的大鼠的肾小管滤过率(4.2ml/min)相近。考虑所有这些结果，表明全身几乎没有代谢发生，且exendin-4清除率大多是通过肾滤过作用(而不是肾血管内的蛋白水解作用)完成的。在尿中只有低量的免疫活性全长exendin，这与exendin在过滤后被近端小管中刷状缘酶的裂解作用相同。
实施例4--exendin-4降低DIABETIC FATTY ZUCKER大鼠在高血糖锁定过程中胰高血糖素的分泌作用绝对或相对高胰高血糖素血症通常是1型糖尿病和2型糖尿病的一个特征，而抑制本文所述或提及的这些或其它病症分泌过多的胰高血糖素，可能会使得用glucagonostatic agent治疗颇受裨益。本实施例中检测了exendin-4对麻醉的雄性Diabetic Fatty Zucker(ZDF)大鼠胰高血糖素分泌的影响。使用胰岛素分泌过多高血糖锁定(clamp)方案时，那些影响胰高血糖素分泌的因素保持恒定。在静脉灌注盐水(n＝7)或exendin-4(0.2μg+2.1μg/ml/h；n＝7)之前60分钟，血糖锁定在～34mM。这两组在注入盐水或exendin-4之前所测的血浆胰高血糖素浓度是相近的(分别是306±30pM和252±32pM；n.s.)。
锁定最终60分钟时灌注exendin-4的大鼠中血浆胰高血糖素平均浓度几乎是灌注盐水大鼠中的一半(分别为165±18pM和298±26pM；p＜0.002)。用高血糖锁定方案同时测量胰岛素敏感性。锁定过程中，exendin-4处理的大鼠与对照大鼠相比其葡萄糖灌注率升高111±7％(p＜0.001)。换言之，在高血糖锁定研究过程中，exendin-4显示了在ZDF大鼠中有降低胰高血糖素的效果，这样的效果能使糖尿病病人享受到治疗带来的裨益。
实施例5--exendin-4对2型糖尿病病人胰高血糖素分泌的代谢效应本实施例中对合成的exendin-4在8位不能利用胰岛素的2型糖尿病病人中的安全性、耐受性及效能进行了评估，这8位病人曾用其它抗糖尿病疗法间断地治疗过至少7天。在单盲、渐增剂量、安慰剂受控交换设计实验中，每位病人48小时皮下(SC)间隔注射安慰剂(PBO)以及0.1、0.2和0.3μg/kg exendin-4。有5位病人还接受了0.4μg/kg的剂量。禁食后评估血糖浓度、胰岛素浓度及胰高血糖素浓度对在注射exendin-4/PBO时给予7Kcal/kg Sustacal攻击的应答情况。和Sustacal一起给口服20mg/kg液状乙酰氨基苯后，通过测定血清乙酰氨基苯浓度对胃排空作出评估。没有对基于所报道的不利事件、EKG及安全实验室监测的安全事例做出鉴定。0.3和0.4μg/kg的剂量引发了对恶心的剂量依赖性升高；剂量最高时发生呕吐。
与PBO相比，所有exendin-4剂量虽然胰岛素浓度没有显著不同，但血糖浓度降低了。PBO、0.1、0.2、0.3和0.4μg/kg剂量的血糖AUC8小时平均±SE变化分别离开基线+391±187、-263±108、-247±64、-336±139和-328±70mg*hr/dl)。3小时血糖变化分别为+128.0±19.2、-5.6±10.5、-29.4±18.6、-40.5±24.5和+6.9±38.6。所有剂量的胃排空速率都减慢了。与PBO相比，0.1、0.2、0.3和0.4μg/kg剂量的平均总吸收乙酰氨基苯6小时分别降低51％、50％、57％和79％。总之，给病人SC注射exendin-4没有鉴定安全事例，可耐受剂量≤0.3μg/kg，降低血糖和胰高血糖素并能减慢胃排空的速度。这些观察支持使用exendin治疗一些病症，这些病症将会受益于胰高血糖素水平的降低和/或胰高血糖素的抑制，包括但不仅限于1型和2型糖尿病。
实施例6--PEG修饰的exendin-4对于exendin-4这样有39个氨基酸的多肽，其分子量为4187，增大其分子大小和/或增大其阴离子本性的修饰作用将降低它被肾滤过的能力。因为对exendin-4的清除率主要由肾进行，所以对exendin-4修饰后将有效延长其半衰期。PEG修饰作用的其它特性(因为可避开可能发生的肾和/或细胞清除机制，其血浆半衰期延长了；免疫原性和抗原性降低；溶解度增大；抗蛋白水解；毒性降低(避免出现剂量峰)；热稳定性和机械稳定性增强；提高对粘液或上皮层的通透性；对特异的生物功能有选择控制作用)对于exendin-4和exendin-4激动剂还有潜在的裨益。尤其是因为我们观察到exendin-4有多重药理作用(可能代表多个受体亚型)，所以可以选择exendin-4不同生物活性在其适当位置加上PEG基。有人报道过PEG修饰的蛋白生物活性发生丧失或改变(这可能是由于PEG链本身的存在，PEG链占据了特定的部位或者偶联条件对蛋白有副作用)。
就肾对exendin和exendin激动剂的滤过作用来看，PEG修饰作用主要考虑的是大小和电荷。未修饰的exendin和exendin激动剂分子量大约为4.2KD，其阴离子本性是生理pH下总净电荷大约为-2。一个、两个或三个PEG组分可共价连接到exendin-4或exendin-4类似物上，优选例如一个PEG组分。PEG分子量大小可以是500～20000，优选5000和12000之间。
许多共价连接PEG的方法利用的是赖氨基上的ε-氨基。exendin-4有两个赖氨酸可以连接PEG发生修饰作用。对截短的exendin-4类似物AC3177(Leu14，Phe251-28exendin-4)进行丙氨酸扫描，找到了对丙氨酸取代敏感的部位。12位和27位的两个赖氨酸由丙氨酸取代后并不会造成太大的影响，这表明失去赖氨酸特异的R基侧链(亚甲链和ε-氨基)是可以忍受的。对于全长多肽exendin-4，这两个赖氨酸位置适合于PEG附着(见化合物1和2)。此外，依赖于结合PEG的化学方法，可以掩蔽掉这些部位的ε-氨基以提高多肽的阴离子本性。
(201)HGEGTFTSDLSK(PEG)QMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(202)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLK(PEG)NGGPSSGAPPPS-NH2基于丙氨酸扫描结果，其它可以插入Lys-PEG或与之相当的插入修饰的可能部位是(203) HK(PEG)EGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(204) HGEGK(PEG)FTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(205) HGEGTFTK(PEG)DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(206) HGEGTFTSDK(PEG)SKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(207) HGEGTFTSDLK(PEG)KQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(208)*HGEGTFTSDLSKK(PEG)MEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(209)*HGEGTFTSDLSKQMEK(PEG)EAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(210)*HGEGTFTSDLSKQMEEK(PEG)AVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(211) HGEGTFTSDLSKQMEEEAK(PEG)RLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(212) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRK(PEG)FIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2(213)*HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIK(PEG)WLKNGGPSSGAPPPS-NH2(214) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEK(PEG)LKNGGPSSGAPPPS-NH2(215) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKK(PEG)GGPSSGAPPPS-NH2以上三个*部位通常包括一个用K(PEG)修饰显示的谷氨酸，也可偶连到谷氨酸侧链羧基E(PEG)修饰。
另一个可加入Lys-PEG的类似物是在提议的GlyGly转角(216)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNK(PEG)GPSSGAPPPS-NH2(217)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGK(PEG)PSSGAPPPS-NH2exendin-4的29-39位可能对于降低胰高血糖素活性来说不是关键的，这可由AC3177证明，而AC3177有与exendin-4几乎等效的活性。这些部位中的任何一个，无论单个或组合，都能用K(PEG)或与之相当的修饰来替换。
本领域中的熟练人员会毫无困难地了解到本发明可以很好地实现目的并能获得提及过的结果和裨益以及那些固有的好处。本文所述的分子复合体和方法、方案、治疗方法、分子，特定化合物目前代表可以借鉴的优选实施方案，而并不意味着限制了本发明范围。本领域中的熟练人员会想到其中的一些变化和其它的用法，这些也都包含在由权利要求范围定义的本发明本质精神之内。
本领域的熟练人员很容易看出在不违背本发明范围和本质精神的情况下，本文公开的发明可以有多种替代和修饰。
所有在详述中提及的专利和公开文书是本发明所属领域的熟练人员的水平的指导。所有专利和详述在此以同等程度引入作为参考，就好象每个公开文书特异并单独引入作为参考一样。
在本文特异公开的任何条件限制不存在情况下，本文中说明描述的发明是可以实施的。因此，本文每一实施例中的“包含”、“主要包含”和“由…组成”术语中的任何一个可以用另外两个术语替换。所用术语和表达方式只是描述性术语，并不是限制条件。在显示或描述特征或其部分特征时并不是有意用除任何相当的说法外的这些术语和表达方式，但是需要认可的是各种修饰都可能在此处申请的发明范围之内。因此，应该清楚本发明虽然以优选实施方案和任选特征特异公开，但是对公开概念的修饰和变动，可以由本领域熟练人员来完成，而且那些修饰和变动也认为在附加权利要求中定义的本发明范围之内。
此外，用马库什基团术语描述的本发明特征或方面时，本领域熟练人员将认识到本发明也可用马库什基团成员中的任何单个成员或亚群术语来描述。例如，如果X描述为选自溴、氯和碘时，X是溴的声明和X是溴和氯的声明即为全面的描述方式。
本文对本发明进行了大体和一般性描述。一般性公开内容范围内的每个狭义性内容和次一般性定群也都是本发明的一部分。不管删去的资料在本文中是否作了明确祥述，每个狭义性内容和次一般性定群包括对带有去除任何主题内容的限制条件或否定性限制条件时一般性描述。
在下面的权利要求中有其它的实施方案。
权利要求
1.一种降低被试者血浆胰高血糖素的方法，包括给所说的被试者施以降低胰高血糖素治疗有效量的选自exendin、exendin激动剂、修饰的exendin及修饰的exendin激动剂的化合物。
2.权利要求1的方法，其中该被试者患有坏死性游走性红斑。
3.权利要求1的方法，其中该被试者有高血糖素瘤疾病。
4.权利要求1～3任何一个中的方法，其中所说的exendin激动剂是一种exendin。
5.权利要求4的方法，其中所说的exendin是exendin-4。
6.权利要求1～3或4任何一个中的方法，其中被试者是人。
7.权利要求1～3任何一个中的方法，其中所说的修饰的exendin或exendin激动剂与一个或多个聚乙二醇聚合物相连接。
8.权利要求7的方法，其中所说的一个或多个聚乙二醇聚合物分子量都在500～20000之间。
全文摘要
本发明提供使用一种exendin、一种exendin激动剂或者一种exendin或exendin激动剂与一个或多个聚乙二醇聚合物连接的修饰的exendin或exendin激动剂的方法,例如用于降低被试者胰高血糖素水平和/或抑制被试者胰高血糖素的分泌。这些方法对治疗高胰高血糖素血症及其它一些病症是有用的,被试者将受益于血浆中胰高血糖素的降低或者胰高血糖素分泌的抑制。
文档编号A61K38/26GK1347327SQ00805017
公开日2002年5月1日 申请日期2000年1月14日 优先权日1999年1月14日
发明者A·杨, B·格杜林 申请人:安米林药品公司