专利名称：重组人甲状旁腺激素基因、其表达载体及重组人甲状旁腺激素蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及人工合成的表达人甲状旁腺激素的基因，构建的该基因的重组表达载体，由该载体转化的宿主细胞。
本发明还涉及制备重组人甲状旁腺激素蛋白的方法。
正常人体内PTH的分泌有时相性，一方面是分泌物动力学的多变性，以此调节血钙浓度，防止PTH受体对PTH亲和力的下调；另一方面是PTH分泌的高度稳定性，即每日分泌次数和每次分泌量是有规律的，以此维持正常骨量及骨代谢的平衡。骨质疏松病人PTH的分泌没有规律，造成骨形成及骨吸收的不平衡，引起骨量丢失及骨结构改变。因而对骨质疏松病人间歇皮下注射PTH，人为造成体内PTH的分泌与正常人相似，从而达到治疗骨质疏松的目的。
在PTH蛋白的氨基端引入额外的氨基酸，PTH的活性大大降低，而在大肠杆菌中表达外源蛋白时，往往在氨基端引入甲硫氨酸；另一方面，PTH基因5’端有一可能的翻译起始位点，在大肠杆菌中表达时易表达无活性的8-84氨基酸片段；再一方面PTH易氧化失去活性。这些原因导致在大肠杆菌中用直接表达的方法很难得到大量的有活性的PTH。通过采用不易形成二级结构的密码子以利于翻译起始，利用大肠杆菌的内源性甲硫氨酸氨肽酶(methionineaminopeptidase)去除表达产物的氨基端甲硫氨酸，结合适当的纯化方法可得到有活性的PTH(US patent6146852，Sung et.al.，J.Bio.Chem.1991，266(5)2831-2835)。
有多种方法克服翻译起始区不利二级结构对翻译的影响，比如通过对翻译起始区内的序列进行改造，但这种改造依赖于不太精确的计算机mRNA二级结构预测，因此改造结果难以预料，而双顺反子表达方法是一种比较有效的方法，其原理在于前导顺反子的有效翻译能打开后续顺反子内的不利二级结构。双顺反子表达方法就是在编码目的蛋白的基因之前引入另一易于表达的编码较短氨基酸序列的(一般在20个氨基酸以内)一段DNA序列，从而克服目的基因内不利的二级结构对翻译起始的影响，获得目的基因的有效表达。
本发明的另一目的在于提供重组人甲状旁腺激素基因的表达载体及该表达载体转化的宿主细胞。
本发明的又一目的在于提供以基因工程技术制备重组人甲状旁腺激素蛋白的方法。
根据本发明的一方面，提供含有SEQ ID NO.1的DNA序列的重组人甲状旁腺激素基因，其中，碱基81至332编码人甲状旁腺激素1-84个氨基酸序列(SEQ ID NO.3)。碱基7至碱基57编码一作为前导顺反子的短肽IVSEIQLMHNLGKHLTS(SEQ ID NO2)。此两片段之前各有一起始密码子ATG，之后各有一终止密码子TAA，碱基64至碱基70为大肠杆菌SD系列。
在本发明的一个优选实施方案中，通过人工合成引物和模板，经过DNA链延伸反应后，将延伸反应的产物再进行聚合酶链反应进行扩增，PCR反应产物经连接反应后将获得的DNA转化进入大肠杆菌E.Coli JM109感受态细胞。经鉴定后挑选阳性克隆。
根据本发明的另一方面，提供包含SEQ ID NO1序列的重组载体。其中载体可以以质粒、病毒颗粒以及噬菌体等形式。在本发明的一个实施方案中，构建了质粒形式的载体。
可通过多种方法将目的DNA插入到载体中，一般而言，通过本领域技术人员已知的一些方法可以将本发明的DNA序列插入到一个适当的限制性内切酶位点上。表达载体中的DNA可操作地与一个适当的表达调控序列(启动子)连接以指导mRNA的合成，表达载体也含有一个用于翻译起始的核糖体结合位点以及一个转录终止子。表达载体同时含有用于筛选转化宿主细胞的表型性状基因。用于构建表达载体的质粒或病毒可通过商业途径获得。
本发明的一个优选实施方案中，通过将重组人甲状旁腺激素基因(SEQ IDNO.1)插入质粒pTHioHisA的限制性内切酶NdeI、SalI位点，构建成质粒表达载体pTrcPTH，该载体可以在大肠杆菌中表达出具有高生物学活性的重组人甲状旁腺激素蛋白根据本发明的又一方面，由本发明的表达载体转化的宿主，宿主细胞可以包括原核细胞和真核细胞，其中用于转化的原核细胞可以包括各种细菌，在本发明的一个优选实施方案中，以大肠杆菌作为本发明载体的宿主细胞，更优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
根据本发明的再一方面，利用基因工程技术制备重组人甲状旁腺激素蛋白的方法，包括1)将编码重组人甲状旁腺激素的基因(SEQ ID NO.1)可操作地连接于表达调控序列，构建表达载体；2)用该表达载体转化原核或真核细胞，形成宿主细胞；3)在适当的培养条件下培养本发明的宿主细胞；4)从培养液中分离出具有人甲状旁腺激素活性的蛋白质；5)纯化获得重组人甲状旁腺激素。
本发明成功地合成了表达人甲状旁腺激素蛋白的基因，构建了该基因的表达载体并形成了表达该基因的宿主细胞，建立了采用基因工程技术生产重组人甲状旁腺激素蛋白的方法，由该方法获得的人甲状旁腺激素蛋白可明显刺激骨肉瘤细胞cAMP，具有较高的生物学活性。本发明为重组人甲状旁腺激素蛋白的大规模、工业化生产奠定了基础。
附图的简要说明
图1为重组质粒pTrcPTH的图谱；示出了PTH的编码序列，复制子pUCori，氨苄青霉素抗性(AMPR)的基因，TAC启动子，term终止子，前导顺反子Lac的元件ATG＝ATG的起始密码子，RBS＝核糖体结合位点，Leader＝编码IVSEIQLMHNLGKHLTS的序列；图2为重组质粒pTrcPTH中的双顺反子片段的核苷酸序列及相应的氨基酸序列；图3为实例三中的纯化结果；图3中，A图示出阳离子交换层析图谱；B图示出疏水层析图谱；C图示出SDS-PAGE电泳图谱，18％SDS-PAGE泳道1发酵5小时菌体总蛋白；泳道2发酵9小时菌体总蛋白；泳道3诱导1小时菌体总蛋白；泳道4诱导1.5小时菌体总蛋白；泳道6、7疏水层收集管；泳道7分子量标准14KD、20KD、24KD、29KD、36KD、45KD、66KD；图4示出重组PTH蛋白对骨肉瘤细胞的生物学活性。
实施例一基因合成及克隆(1)、化学合成如下引物CAG212F1(SEQ ID NO4)5’CATATGATCGTAAGTGAAATACAGCTAATGCACAACCTGGGAAAACATCTGACTTCATAATAAAGGAGGA 3’CAG212F2(SEQ ID NO5)5’GACTTCATAATAAAGGAGGAAACAGCTATGTCAGTAFCAGAAATACAATTAATGCATAATTTAGGTAAGC 3’CAG212F3(SEQ ID NO6)5’AATGCATAATTTAGGTAAGCACTTGAACTCTATGGAAAGAGTTGAATGGTTGAGAAAGAAGCTGCAGGAC 3’CAG212R1(SEQ ID NO7)5’GTCGACTTACTGGGATTTAGCTTTAGTGAGTACATTCACATCGGCCTTGTCAGCCTCGCCA 3’CAG212R2(SEQ ID NO8)5’CGGCCTTGTCAGCCTCGCCAAGGGATTTTTCATGGCTCTCAACTAAGACATTGTCTTCCT 3’CAG212R3(SEQ ID NO9)5’AACTAAGACATTGTCTTCCTTTTTACGTGGTCTTTGGGAACCAGCATCACGAGGCGCCAA 3’CAG212R4(SEQ ID NO10)5’CCAGCATCACGAGGCGCCAACGGAGCGCCCAGCGCAACGAAATTGTGAACGTCCTGCAGCTTCTTTCTCA 3’2)DNA链延伸反应。在Microtube管中调制下列反应液CAG212F3(0.33ug/ul) 5ulCAG212R4(0.33ug/ul) 5ul10×TaKaPa LA Buffer 10uldNTP 16ulH2O63ul
将反应液在94℃保温5分钟后，在10分钟内冷却到55℃，加入TaKaRa LATaq酶1ul，72℃保温5分钟。
3)、PCR反应在Microtube管中调制下列反应液CAG212F1(0.33ug/ul)1ulCAG212R2(0.33ug/ul)1ulCAG212R1(0.33ug/ul)1ulCAG212R2(0.33ug/ul)1ulCAG212R3(0.33ug/ul)1ulDNA延伸液 1ul10×TaKaPa LA Buffer 10ulTaKaRa Ex Taq酶1uldNTP 10ulH2O73ulPCR反应条件为94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，20循环。
反应产物用乙醇沉淀后溶解于100ulTE中。
4)、连接反应在Microtube管中调制下列反应液PCR反应产物 2ulPmd18-T 1ul(50ng)H2O 2ulLigation Solution I 5ul16℃保温30分钟后，全量转化至E.Coli JM109 Competent Cell.
5)、阳性克隆检测挑取菌落，用RV-M(SEQ ID NO11)和M13-47(SEQ ID NO12)为引物进行PCR鉴定，挑取能扩增出400bp左右片段的菌落，过夜培养后，以常规快速质粒提取法提取质粒，用Nde I和Sal I双酶切鉴定，挑取能酶切出400bp片段的质粒，命名为pMD18PTH，以RV-M为引物进行全自动序列测定进一步证实，测序结果表明合成并克隆了正确的基因片段(SEQ ID NO1)。
实施例二表达人重组甲状旁腺激素的重组质粒pTrcPTH的构建。
用Nde I酶和Sal I酶切割pMD18PTH质粒，回收340bp左右的目的片段。Invitrogen公司出售的质粒pThioHisa，经Nde I和Sal I酶切，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳，电泳分离出360bp左右片段和3.4kb左右片段，用凝胶回收试剂盒回收3.4kbp左右片段，将其与上述340bp左右的目的片段连接，转化大肠杆菌DH5a，转化子用LB培养基培养后提取质粒，再用Nde I和Sal I双酶切鉴定，鉴定正确的质粒以TrxR(SEQ ID NO13)为引物进行全序列测定，测序结果表明成功构建了重组表达质粒pTrcPTH，其质粒图谱如图1，其双顺反子片段的核苷酸序列及相应的氨基酸序列如图2所示。
实施例三重组人甲状旁腺激素的制备1)工程菌的建立选用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌，用氯化钙法制备感受态细胞，将质粒pTrcPTH转化入感受态细胞，涂在含100ug/ml氨苄青霉素的LB(1％trypton，0.5％yeast extract，1％NaCl，1.5％agrose)平板上，重组菌落用含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基在30℃培养，经筛选后建立表达人PTH的工程菌BL21(DE3)/pTrcPTH，原始菌种用含15％甘油的LB培养基保存于-70℃，工程菌在含氨苄青霉素的LB平板上生长呈典型的大肠杆菌菌落特征，此工程菌每传20代作一次图谱分析，结果与原始菌种一致。
2)发酵种子菌培养保存的BL21(DE3)/pTrcPTH菌株接种入200ml含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基，在1升摇瓶中于30℃培养16小时左右，接种入3.5升发酵培养基中。
7升发酵罐培养发酵培养基R2(3.5升)
(NH4)2HPO42g/lKH2PO46.75g/lCitric acid 0.85g/lMgSO41.8G/LGlucose 20g/lCaCl20.054g/lZnCl20.02g/lTrace metal 2ml/l复合维生素液1ml/l氨苄青霉素 0.2g/lTrace metal(1 liter)Citric acid 5gCoCl2·6H2O 2gMnCl2·4H2O 12gCuSO4·5H2O 1.85gH3BO32.5g(NH4)6M07·4H2O 1.32gFeCl3·6H2O 3.4g复合维生素液(1升)维生素B1 20g维生素B12200mg维生素B6 2.5g维生素B2 1.0g生物素 12.5mg发酵参数培养温度30℃，pH控制在6.8～7.2，罐压为常压，通气量2vvm，溶解氧通过控制搅拌速率或通纯氧控制在10％以上。
通过流加葡萄糖培养至菌密度为OD600＝30左右时(大约在接种后10小时)，加入诱导物(4ml 0.5M IPTG)，升温至36℃，继续培养，根据养分消耗情况补充酸水解干酪素、葡萄糖和酵母抽提物，直至菌体生长停滞，大约在诱导后2小时，4℃离心收集菌体。表达结果见图3C。
3)纯化菌体按1g/ml用量抽提液(1N HCl/1％NaCl/1％TFA)抽提，离心后再抽提一次，离心，合并上清，用5N NaOH调pH至3.8，用水稀释五倍，上样至SP柱，SP柱预先用缓冲液Al(50mM Formic acid Ph3.8)平衡好，然后用缓冲液Al冲洗直至检测基线接近上样前基线，然后以缓冲液Al为流动相加O-1N NaCl梯度进行梯度洗脱，分部收集洗脱液(图3A)，用18％SDS-PAGE证实含目的蛋白的各分部收集样品合并这些收集样品，加入二十份之一体积的5N NaCl，用5N NaOH调pH至8.0，过phenyl疏水层析柱，phenyl柱预先用缓冲液A2(1M NH4AC，pH8.0)平衡好，上样结束后用缓冲液A2冲洗直至检测基线接近上样前基线，然后用20mM NH4AC，pH8.0洗脱，收集洗脱峰(图3B)。纯化得到的重组PTH蛋白，纯度大于95％(图3C)。
4)重组人甲状旁腺激素的生物学活性分析重组人甲状旁腺激素的腺苷环化酶活性用体外培养的骨肉瘤细胞进行测定(Rabbani et al.，J.Bio.Chem.1988，263(3)1307-1313)。骨肉瘤细胞上的甲状旁腺激素受体结合甲状旁腺激素后激活细胞内腺苷环化酶，导致环腺嘌呤(cAMP)的增多。
骨肉瘤细胞MG-63和MC3T3-EI用含15％胎牛血清和1.5mM谷氨酰胺的高糖DMEM培养基于37℃培养，维持培养箱中CO2在10％，湿度在99％。以1×103个细胞每孔接种在24孔培养板上，继续培养直至长满，去除培养基，用检测培养基(DMEM/0.1％BSA/2mM 3-isobutyl-1-methylxanthine，20ug/ml ascorbicacid)洗涤一次，加入含待检测样品的检测培养基，在37℃培养20-30分钟，然后去除培养基，加入冰预冷的0.1NHCl裂解细胞，然后按R&Dsystem公司的cAMP检测试剂盒说明进行操作，测定cAMP的含量。与不含PTH的对照组相比，含PTH的实验组明显刺激骨肉瘤细胞产生cAMP(图4)。
由此可见，通过本发明方法制备的重组人甲状旁腺激素蛋白具有较高的生物学活性。
以上对本发明的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明精神，均应属于本发明的权利要求所定义的范围。
SEQUENCE LISTING<110>昆明云健制药股份有限公司<120>重组人甲状旁腺激素基因、其表达载体及重组人甲状旁腺激素蛋白的制备方法<130>PI022513<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>341<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(7)..(60)<223>前导顺反子序列<220><221>CDS<222>(81)..(335)<223>编码人甲状旁腺激素1-84个氨基酸<400>1catatg atc gta agt gaa ata cag cta atg cac aac ctg gga aaa cat48Ile Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His1 5 10ctg act tca taa taaaggagga aacagctatg tca gta tca gaa ata caatta101Leu Thr Ser Ser Val Ser Glu Ile GlnLeu1520atg cat aat tta ggt aag cac ttg aac tct atg gaa aga gtt gaa tgg149Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp25 30 35 40ttg aga aag aag ctg cag gac gtt cac aat ttc gtt gcg ctg ggc gct197Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala45 50 55ccg ttg gcg cct cgt gat gct ggt tcc caa aga cca cgt aaa aag gaa245Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu60 65 70gac aat gtc tta gtt gag agc cat gaa aaa tcc ctt ggc gag gct gac293Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp75 80 85aag gcc gat gtg aat gta ctc act aaa gct aaa tcc cag taa gtcgac341Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys Ala Lys Ser Gln90 95 100<210>2<211>17<212>PRT<213>人工序列<400>2Ile Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Thr1 5 10 15Ser<210>3<211>84<212>PRT<213>人工序列<400>3Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser35 40 45Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu50 55 60Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys65 70 75 80Ala Lys Ser Gln<210>4<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(70)<223>引物<400>4catatgatcg taagtgaaat acagctaatg cacaacctgg gaaaacatctgacttcataa 60taaaggagga70<210>5<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(70)<223>引物<400>5gacttcataa taaaggagga aacagctatg tcagtatcag aaatacaattaatgcataat 60ttaggtaagc70<210>6<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(70)<223>引物<400>6aatgcataat ttaggtaagc acttgaactc tatggaaaga gttgaatggttgagaaagaa 60gctgcaggac70<210>7<211>61<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(61)<223>引物<400>7gtcgacttac tgggatttag ctttagtgag tacattcaca tcggccttgtcagcctcgcc 60a61<210>8<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(60)<223>引物<400>8cggccttgtc agcctcgcca agggattttt catggctctc aactaagacattgtcttcct 60<210>9<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(60)<223>引物<400>9aactaagaca ttgtcttcct ttttacgtgg tctttgggaa ccagcatcacgaggcgccaa 60<210>10<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(70)<223>引物<400>10ccagcatcac gaggcgccaa cggagcgccc agcgcaacga aattgtgaacgtcctgcagc 60ttctttctca70<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(23)<223>引物<400>11agcggataac aatttcacac agg23<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>引物<400>12cgccagggtt ttcccagtca cgac24<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物<400>13tgtaaaacga cggccagtgc20
权利要求
1.包含SEQ ID NO1的核苷酸序列的多核苷酸。
2.包含SEQ ID NO1所示DNA序列的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于所述载体为质粒载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述载体包括SEQ IDNO1所示的DNA序列和pTHioHisA载体。
5.用包含SEQ ID NO1所示DNA序列的质粒转化的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于所述用于转化的宿主细胞为大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于所述大肠杆菌为BL21(DE3)。
8.一种制备重组人甲状旁腺激素的方法，包含下述步骤1)将含有SEQ ID NO.1的DNA序列可操作地连接于表达调控序列，构建表达载体；2)用该表达载体转化原核或真核细胞，形成宿主细胞；3)在适当的培养条件下培养本发明的宿主细胞；4)从培养液中分离出具有人甲状旁腺激素活性的蛋白质；5)纯化获得重组人甲状旁腺激素。
9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤1)所述的表达载体为由质粒pTHioHisA与SEQ ID NO.1构建的质粒载体。
10.根据权利要求8所述的方法，其中步骤2)所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)/pTrcPTH。
全文摘要
本发明涉及人工合成的表达人甲状旁腺激素蛋白的基因(SEQ ID NO.1)，构建的该基因的重组表达载体，由该载体转化的宿主细胞。本发明还涉及制备重组人甲状旁腺激素蛋白的方法。本发明成功地合成了表达人甲状旁腺激素蛋白的基因，建立了采用基因工程技术生产重组人甲状旁腺激素蛋白的方法，由该方法获得的人甲状旁腺激素蛋白可明显刺激骨肉瘤细胞cAMP，具有较高的生物学活性。本发明为重组人甲状旁腺激素蛋白的大规模、工业化生产奠定了基础。
文档编号C12N15/16GK1472219SQ0212785
公开日2004年2月4日 申请日期2002年8月1日 优先权日2002年8月1日
发明者赵彬, 陈志龙, 徐林, 杨上川, 唐维坤, 何昆云, 赵 彬 申请人:昆明云健制药有限公司